רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי
9 ביוני 2022
אנו מתארים את הטכניקה הכירורגית ואת תהליך הדה-סלוליזציה של חולדות מרוכבות. דה-סלוליזציה מתבצעת באמצעות נתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך באמצעות מערכת פרפוזיה של מכונת ex vivo.
הקמנו מודל של בעלי חיים קטנים לדה-סלוליזציה של איבר. זה שימושי כדי להקל על הוכחת מחקר היתכנות על דה ו recellularization של רקמות מרוכבות כלי הדם. משטרי דיכוי חיסוני הם אחת המגבלות העיקריות באלוטרנספלנטציה מרוכבת וסקולרית.
ניתן להפחית את האימונוגניות של הרקמות באמצעות דה-סלולריזציה. כדי להתחיל, לבצע חתך בעור באמצעות להב כירורגי מספר 10 לאורך הרצועה המפשעתית, נע מ לרוחב לכיוון מדיאלי, תוך החזקת העור שמסביב עם מלקחיים Adson. כאשר השומן הבסיסי נחשף, השתמש בדיסקציה קהה כדי לנתח בזהירות דרך השומן, ולאתר את כלי הדם האפיגסטריים העליונים.
באמצעות מיקרו-מספריים, יש לנתח באופן פרוקסימלי ולחשוף את עצב הירך, העורק והווריד הבסיסיים ברמת הרצועה המפשעתית. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, לזהות את כלי הירך, ולנתח את העורק ואת הווריד באופן פרוקסימלי באמצעות מלקחיים עדינים כדי לקבל אורך מספיק מנקודות bifurcation של רשת העורקים. לאחר מכן, ligate את וריד הירך ואת העורק בנפרד באמצעות 6-0 תפרים.
לאחר מכן, יש לבצע דיסקציה היקפית סביב שארית העצם האחורית מבלי לשבש את כלי הירך הקשורים, ולהעביר את עצם הירך באורך בינוני באמצעות חותך עצם. כדי לבודד באופן מלא את החלק האחורי, יש להעביר את כלי הירך המחוברים באופן דיסטלי לליגטורות באמצעות מספריים זעירים, ולתעל את עורק הירך באמצעות אנגיוקטטר של 24 מדים מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר מכן, לשטוף עם מלוחים heparinized עד זרימה ברורה הוא ציין מן וריד הירך.
אבטחו את הצינורית על ידי קשירת תפר אחד סביב כלי הצינורית בתפר אחר באופן דיסטלי סביב הצינורית עצמה, תוך הקפדה על מיקום הצינורית באופן פרוקסימלי כדי למנוע חסימה של נקודות הביפורקציה. לאחר מכן, הטביעו את ה-backlimbs הנרכשים ואת ה-PBS עד ל-decellularization. כדי לבנות את הביוריאקטור, מקם את התא המעוקר, והברג שלושה פקקי תלת-כיווניים חד-פעמיים בקווי הכניסה, היציאה והחידוש, כדי להבטיח שהפקק ליציאת החידוש ייסגר בשתי היציאות הנותרות שלו כדי למנוע דליפה.
חבר את צינורות הסיליקון שנעשו בעבר לפקקים בקווי הכניסה והיציאה. לאחר מכן, חבר צינורות פריסטלטיים לצינורות הסיליקון. לאחר אבטחת הקלטת על צינורות פריסטלטיים, מניחים אותה על המשאבה הפריסטלטית.
לאחר מכן, חבר את אחד מצינורות הסיליקון לקצה הצינורות הפריסטלטיים של קו היציאה מהשלב שמעל. בצד השני, מחברים פיפטה סרולוגית של מיליליטר אחד, ומשעים את הקצה המחובר עם פיפטה סרולוגית בבקבוק מאגר הפסולת. לאחר מכן, השהה את קצה הצינור המחובר לפיפטה הסרולוגית לתוך מאגר חומרי הניקוי, ומיד אטם את פתח בקבוק המאגר של חומרי הניקוי באמצעות פרפילם.
הוסף 0.25% SDS מצנצנת הזכוכית של ליטר אחד לתוך תא הביוריאקטור בגובה מחצית הדרך. לאחר מכן, קח את החלק האחורי שנרכש באמצעות מלקחיים של אדסון, והשעה אותו לתוך תא הביוריאקטור בזהירות. באמצעות שני זוגות של מלקחי אדסון, הנחו את החלק המשומר של החלק האחורי אל קו הכניסה תוך החזקת הצינורית עם זוג מלקחיים אחד.
השתמש בזוג המלקחיים האחרים כדי לסובב ולהדק את קו הכניסה לצינורית. לאחר האבטחה, הוסיפו עוד 0.25% SDS מצנצנת הזכוכית של ליטר אחד כדי להטביע את הגפה במלואה לפי הצורך, כדי להבטיח שגם יציאת היציאה תהיה שקועה במאגר הביוריאקטור, ותשמור על זרימה עקבית. לאחר מכן, חברו מסנן מזרק חד-פעמי ליציאת האוורור שעל מכסה תא הביוריאקטור, והדקו את המכסה על הביוריאקטור, כדי להבטיח שהתא אטום מכל הצדדים.
כדי להוציא אוויר מהצינורות ולהתחיל את מעגל הזליפה, השתמש במזרק חד-פעמי חדש של 10 מיליליטר כדי לשאוב חומר ניקוי ממאגר חומרי הניקוי באמצעות פקק תלת-כיווני בקו הכניסה. לאחר המשיכה, השתמש באותו נוזל כדי להחדיר לתוך stopcock התלת-כיווני בקו היציאה. לאחר מכן, לחץ למטה ואבטח את הקסטות עם הצינורות לתוך המשאבה הפריסטלטית.
לאחר מכן, הפעל את המשאבה הפריסטלטית באמצעות לחצן ההפעלה. במסך המשאבה הפריסטלטית, המשך לכרטיסייה השנייה באמצעות מקש החץ כדי להגדיר את קצב הזליפה עבור הערוץ הראשון עם קצב זרימת הקלט כמצב המסירה, וקבע את קצב הזלוף על מיליליטר אחד לדקה, תוך הבטחת כיוון הזרימה נכון בהתאם להגדרת המנגנון. כייל את המשאבה הפריסטלטית כדי להבטיח שכמות הנוזלים המועברת דרך קו הכניסה, ו/או נלקחת מקו היציאה זורמת באופן עקבי בין השניים, כדי להבטיח שמזהה הצינורות מוגדר ל-1.85 מילימטרים.
התחל דה-סלוליזציה באמצעות זלוף מכונה במהירות של מיליליטר אחד לדקה עבור קווי הכניסה והיציאה על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בלוח המקשים. נטר וודא שהזרימה מתבצעת ונמשכת הן בקווי הכניסה והן בקווי היציאה. באמצעות 1 ליטר של 0.25% STS, יש לחדש את מאגר הביוריאקטור דרך יציאת החידוש לפי הצורך.
לאחר מכן, חפשו מראה לבן שקוף של הרקמה, אשר יופיע עד היום החמישי, המציין decellularization של החולדה האחורית. לאחר אישור הדה-סלולריזציה, החליפו את מאגר חומרי הניקוי במאגר PBS ו-1% אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי, ואטמו את פתח הבקבוקון בפרפילם. יש להתחיל ב-PBS וב-1% הזלפה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית במיליליטר אחד לדקה, ולהמשיך יומיים.
החלף את מאגר PBS ו- 1% אנטיביוטיקה-אנטימיקוטי ב- 200 מיליליטר של 0.1% חומצה טפילית, מאגר 4% אתנול, והתחל זלוף במיליליטר אחד לדקה למשך שעתיים. מתחת לארון בטיחות ביולוגית, נתקו את החלק האחורי מקו הכניסה באמצעות שני זוגות של מלקחיים אדסון סטריליים עם זוג מלקחיים אחד כדי לסובב את קו הכניסה, והשני מחזיק את הצינורית, כדי להבטיח שהצינורית לא תימשך כדי למנוע פירוק. יש לאחסן את האיבר בצנצנת זכוכית של 500 מיליליטר המכילה PBS, ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
הן עורק הירך והן הווריד הראו אובדן של תוכן גרעיני בכל השכבות ורקמת החיבור שמסביב, בהתחשב בהיעדר גרעינים מוכתמים כחולים שנמצאים אחרת בכלי הדם המקומיים. טוניקה אינטימה מדיה ואדוונטיטיה של וריד הירך והעורקים נשמרו בכלי הדם decellularized. עצב הירך הראה שימור של מבנה הרקמה, כולל האנדונוריום.
העצם הראתה שימור מבני כולל עם אובדן גרעינים מוכתמים של אוסטאוציטים, ומשכבות אנדוסטאום ופריוסטאום שמסביב לאחר דה-סלולריזציה. העור הראה אובדן תאים מהאפידרמיס והדרמיס. הדרמיס הראה סיבי קולגן שמורים בדומה לרקמת עור טבעית.
לבסוף, המבט הרוחבי של שרירי השלד הראה אובדן של גרעינים הממוקמים אחרת בשולי האנדומיסיום. תכולת המיופיבריל נותרה שמורה בתוך הפאסיקלים המתאימים לאחר הדה-סלולריזציה. כמו כן בוצע כימות דנ"א באמצעות PicoGreen, שבו תכולת הדנ"א הופחתה באופן משמעותי על פני כלי הירך, העצבים, העור, השרירים והעצמות.
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לאפיין עוד יותר את האיבר הנטויאלי. זה כרוך בבחינת מטריצה חוץ-תאית באמצעות שיטות היסטולוגיות וביוכימיות, ועל ידי הערכת כלי דם בשימוש בהדמיה. הגזע הדה-תאי יכול גם לעבור תהליך של התא באמצעות תאים ספציפיים לרקמות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר טכניקת ניתוח ותהליך דה-סלולאריזציה לגפיים אחוריות מורכבות של חולדות. השיטה משתמשת בנתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך דרך מערכת השקיה תוך-גופנית, ומסייעת במחקר על רקמות מורכבות משוונות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- הנדסת רקמות
רקע
- דה-סלולאריזציה מפחיתה את האימונוגניות של הרקמות.
- היא חיונית להשתלת אלוגרפטים מורכבים משווננים.
- משטרי דיכוי חיסוני מגבילים את הצלחת ההשתלה.
- מודל של חיה קטנה הוקם להסרת תאים מגפיים.
מטרת המחקר
- כדי לאפשר מחקר הוכחת רעיון על דה-סלולאריזציה ורי-סלולאריזציה.
- כדי לשפר את הטכניקות להשתלת רקמות מורכבות משוונות.
- כדי לחקור את ההשפעות של דה-סלולאריזציה על האימונוגניות של הרקמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חתך עור לאורך הרצועה המפשעתית באמצעות סכין כירורגית מספר 10.
- ניתוח קהה כדי לחשוף את השומן התת-עורי ולאיתור כלי הדם האפיגסטריים העליונים.
- דה-סלולאריזציה באמצעות נתרן דודציל סולפט בריכוז נמוך.
- מערכת השקיה תוך-גופנית לתהליך הדה-סלולאריזציה.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של טכניקת דה-סלולאריזציה לרקמות גפיות.
- ירידה באימונוגניות הרקמות שנצפתה.
- סיוע במחקרים עתידיים על רקמות מורכבות משוונות.
- הוכחת יעילות הטכניקה הכירורגית.
מסקנות
- דה-סלולאריזציה היא שיטה קבילה להכנת רקמות מורכבות.
- הטכניקה יכולה לשפר את תוצאות ההשתלה.
- יש צורך במחקר נוסף כדי לייעל תהליכי רי-סלולאריזציה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Perfusion-based decellularization of rat hindlimbs provides a robust platform for evaluating vascularized composite tissue engineering strategies in early discovery. This approach enables mechanistic de-risking of immunogenicity and supports predictive confidence for translational scaffold development. The method is positioned to inform portfolio decisions on next-generation reconstructive and transplantation solutions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tissue immunogenicity reduction through decellularization workflows.
- Supports functional validation of composite scaffold integrity across multiple tissue compartments.
- Facilitates mechanistic de-risking for vascular and structural preservation in engineered tissues.
- Provides a platform for hypothesis-driven recellularization studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated acellular scaffolds for downstream recellularization and functional assays.
- Standardizes decellularization outputs for reproducibility and quantitative DNA content assessment.
- Enables consistent evaluation of scaffold architecture and vascular network preservation.
- Supports scalable preparation of tissue models for compound or cell-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold preparation with disease-relevant tissue engineering and transplantation models.
- Maintains continuity from discovery-stage scaffold validation to preclinical recellularization studies.
- Reduces biological risk by preserving extracellular matrix and vascular structures for translational applications.
- Enables risk-adjusted advancement of engineered tissue constructs toward preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This perfusion-based decellularization method integrates into the early discovery-to-preclinical continuum for engineered tissue constructs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immunogenicity and scaffold preservation in composite tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative DNA depletion and histological readouts for scaffold quality assessment.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as DNA quantification and tissue architecture retention for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges scaffold preparation with recellularization and functional validation in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative scaffold engineering and cross-program evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold immunogenicity and structural fidelity.
- Operational Value: Standardizes decellularization and scaffold preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for tissue engineering programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of engineered tissue constructs for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical tissue procurement and perfusion bioreactor operation.
- Demands access to histological, biochemical, and imaging infrastructure for scaffold characterization.
- Necessitates cross-team standardization of decellularization protocols and quality metrics.
- Adaptable to various composite tissue models with protocol optimization.
- Limitations include model-specific scalability and the need for further recellularization validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Procurement of Rat Hindlimb
2:21
Decellularization of Rat Hindlimbs
5:49
Post-Decellularization Washing and Sterilization
6:55
Results: Histological Staining and DNA Quantification of Native and Decellularized Rat Hindlimb Tissues
8:13
Conclusion
