הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

למרות דוגמאות רבות של קואורדינציה, רוב המחקרים בוחנים את חלבוני האקטין או המיקרוטובול בנפרד. שיטה זו מאפשרת הדמיה של שני הפולימרים הדינמיים בתגובה אחת. טכניקה זו מאפשרת למשתמש להעריך חלבונים רגולטוריים מגוונים עבור תכונות מתפתחות שניתן לראות רק עם גרסאות דינמיות של אקטין ומיקרוטובולים.

ניתן להרחיב טכניקה זו כך שתכלול שומנים או תמציות כדי להתקרב לבניית תא סינתטי. התחילו בהפשרת אליקוטים של אבקות PEG-Silane ו-Biotin-PEG-Silane, והמסת אבקות ה-PEG ב-80% אתנול כדי לייצר את תמיסות מלאי הציפויים של 10 מיליגרם למיליליטר mPEG-Silane ושניים עד ארבעה מיליגרם למיליליטר ביוטין-PEG-סילאן. הסר את החלקת הכיסוי הנקייה מאחסון האתנול באמצעות מלקחיים.

מייבשים בגז חנקן ומאחסנים בצלחת פטרי נקייה. מצפים את תלושי הכיסוי ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת ציפוי ומדגרים אותם ב-70 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות לפחות או עד לשימוש. חותכים 12 רצועות של סרט דו-צדדי בעל משענת כפולה לאורך של 24 מילימטרים.

הסר צד אחד של גיבוי הקלטת ותקן פיסות נייר דבק הסמוכות לששת החריצים הנמצאים בתא הדמיה נקי. הסר את פיסת הגב השנייה של הקלטת כדי לחשוף את הצד הדביק של הקלטת לאורך כל חריץ תא, והנח את סרט הטייפ על משטח נקי. מערבבים שרף אפוקסי ותמיסות הקשחה אחד על אחד בסירת שקילה קטנה, ומשתמשים בקצה P1000 כדי להניח טיפה של אפוקסי מעורב בין רצועות הקלטת בקצה כל חריץ של תא הדמיה.

לאחר מכן, הניחו תא, סרט הדבקה או אפוקסי בצד למעלה, על משטח נקי. הסירו את החלקת הכיסוי המצופה מחממת 70 מעלות צלזיוס ושטפו את המשטחים המצופים והלא מצופים של מחליקי הכיסוי במים מזוקקים כפולים שש פעמים. יבש עם גז חנקן מסונן ולאחר מכן הצמד לתא ההדמיה עם ציפוי הכיסוי החלקה בצד לכיוון הסרט.

השתמש בקצה פיפטה P200 או P1000 כדי להפעיל לחץ על ממשק הזכוכית המודבקת כדי להבטיח אטימה טובה בין הקלטת לתלוש הכיסוי. דגירו את התאים המורכבים בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות לפחות כדי לאפשר לאפוקסי לאטום באופן מלא את בארות התא לפני השימוש. תאי פרפוזיה פוקעים תוך 12 עד 18 שעות מרגע ההרכבה.

השתמש במשאבת פרפוזיה והחלף ברצף פתרונות מיזוג בתא הזלוף על ידי זרימת 50 מיקרוליטרים של 1% BSA כדי להכין את תא ההדמיה. הסר את החיץ העודף ממאגר התאמת מנעול הפיתוי. לאחר מכן, לזרום 50 microliters של 0.005 מיליגרם לכל מיליליטר streptavidin ודגירה במשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר.

הסר את המאגר העודף מהמאגר. זרימה של 50 מיקרוליטרים של 1%BSA כדי לחסום את הקשירה הלא ספציפית ולדגירה למשך 10 עד 30 שניות. הסר את המאגר העודף מהמאגר.

לאחר מכן, הזרימו 50 מיקרוליטרים של חיץ TIRF חם 1x ולאחר מכן 50 מיקרוליטרים של זרעי מיקרוטובולים מיוצבים ו-50% ביוטילים מדוללים בחיץ TIRF 1x. הכינו את הבמה או את מכשיר החימום האובייקטיבי כדי לשמור על טמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני הדמיית התגובה הביוכימית הראשונה. לאחר מכן, הגדר את מרווח הרכישה לכל חמש שניות למשך 15 עד 20 דקות.

לאחר מכן, הגדר 488 ו 647 חשיפות לייזר ל 50 עד 100 אלפיות השנייה ב 5% עד 10% הספק על ידי התאמת תגובת הפילמור הראשון כדי להתחיל את מכלול חוט אקטין. רכשו את התמונות ב-647 ננומטר ובצעו התאמות מתאימות. לאחר מכן, התאימו את תגובת הפילמור בחלוקה מותנית שנייה היטב כדי ליזום את מכלול המיקרוטובולים.

דמיינו ב-488 ננומטרים ובצעו התאמות מתאימות. שלבו שלושה מיקרוליטרים של 10 מיקרומולאר 488 טובולין עם 7.2 מיקרוליטר אליקוט של 100 מיקרומולר עם תווית פלואורסצנטית לא יותר מ-15 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, שלבו שלושה מיקרוליטרים של אקטין הקשור לביוטין מדולל בכמויות מתאימות של אקטין ללא תווית פלואורסצנטית ומסומן, כך שהתערובת הסופית תהיה 12.5 מיקרומולר סה"כ אקטין עם תווית של 10% עד 30% פלואורסצנטית.

הכן את תערובת השלד של הציטוסקלטון על ידי שילוב שני מיקרוליטרים של תערובת אקטין מיקרומולרית של 12.5 מיקרומולר עם תערובת ציר טובולין לא יותר מ-15 דקות לפני ההדמיה. יש לאחסן על קרח עד לשימוש. הכינו את תערובת תגובת החלבון על ידי שילוב של כל המרכיבים והחלבונים הניסיוניים האחרים, כולל חיץ 2x TIRF, אנטי אקונומיקה, נוקלאוטידים, מאגרים וחלבוני עזר.

דגירה של תערובת השלד של הציטוסקלטון ותערובת תגובת החלבון בנפרד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 שניות. כדי ליזום את התגובה מוסיפים את התוכן של תערובת תגובת החלבון לתערובת השלד של הציטוסקלטון ומערבבים אותה. זרימה 50 מיקרוליטרים של תערובת התגובה המכילה 1x BUFFER TIRF בתוספת 15 טובולין ללא מיקרומולר, GTP מילימולרי אחד, מונומרים של אקטין מיקרומולרי 0.5, ונפחים מתאימים של פקדי חיץ לתא הזלוף.

הקלט סרט בהילוך מהיר באמצעות תוכנת מיקרוסקופ כדי לרכוש כל חמש שניות למשך 15 עד 20 דקות. התנו היטב פרפוזיה חדשה והחליפו את נפח המאגר בחלבון הרגולטורי בעל העניין ובקרות המאגר. לרכוש כדי להעריך את החלבונים הרגולטוריים עבור פונקציות מיקרוטובול אקטין מתפתחות.

מדידות לדוגמה של מיקרוטובולים ודינמיקה של חוטי אקטין מוצגות בתמונות אלה. הקרנת הזמן הממוצעת של תעלת טובולין ממחישה ביעילות את אורכי המיקרוטובול הכוללים עבור סריקות הקו המשמשות ליצירת עלילות הקימוגרף. קווים מנוקדים שחורים תואמים את שני הקימוגרפים לדוגמה של המיקרוטובולים הדינמיים.

שלבי הצמיחה והפירוק של המיקרוטובולים מוצגים בכל קימוגרף. שני מונטאז'ים לדוגמה של תמונות בהילוך מהיר המתארים חוטי אקטין בודדים המפולימרים באופן פעיל מוצגים כאן. שיעורי התארכות מחושבים כשיפוע החלקות של אורך חוטי אקטין לאורך זמן לכל אקטין מיקרומולרי אקטין.

לפיכך, יש ליישם מקדם תיקון של שניים על תגובות אקטין של 0.5 מיקרומולר כדי להשוות את השיעורים הנקבעים בדרך כלל בריכוז אקטין מיקרומולרי אחד. דוגמאות מחמישה חוטים מוצגות כאן. פלואורסצנציה פנימית כוללת של השתקפות פנימית, או תמונות TIRF של המיקרוטובולים הדינמיים בחוטים אקטין פולימריים בהיעדר או נוכחות של 250 ננומולאר טאו מוצגים כאן.

קווים מקווקווים כחולים וסימון חצים עונדים קו שורטטו עבור חלקות סריקת הקו המתאימות לכל תנאי. ניתן להבקיע חפיפה בין המיקרוטובולים באזורי האקטין בנקודת זמן מוגדרת לכל אזור. חלבוני שלד ציטוסקטליים, במיוחד אקטין, מיקרוטובולים והרגולטורים שלהם רגישים מאוד למחזורי הקפאה/הפשרה.

לקבלת עקביות והצלחה, השתמש בחלבונים טהורים מאוד המאוחסנים כראוי.