Name: בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: חקור מנגנוני טרנסציטוזה באנדותל כדי להעריך חדירות מחסום הרשתית הפנימית באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים רטינליים אנושיים. שיטה זו מאפשרת חקר רגולטורים מולקולריים ואסטרטגיות מסירת תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH (R01 EY028100, EY024963 ו- EY031765) ל- JC. ZW נתמך על ידי מענק קריירה של קרן האבירים הטמפלרים.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית החולים לילדים בבוסטון ליצירת מיקרוסקופיית אור ותמונות EM (איור 3). פרוטוקולים למחקרי in vivo ניתן לקבל מ- Wang et al.24. כל הניסויים שכללו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) אושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC) בבית החולים לילדים בבוסטון.
1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>פתרון לציפוי צלחת תרבית רקמה: הכינו תמיסת ג'לטין של 0.1% על ידי המסת 1 מ"ל של תמיסת מלאי ג'לטין (40%-50%) ב-500 מ"ל של תרבית רקמה סטרילית דרגה 1x PBS (pH = 7.4). סנן את הפתרון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן תמיסת ג'לטין של 0.1% בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורה האמורה במשך זמן בלתי מוגבל במצב סטרילי.</li>
	<li>מדיום גדילה: הכן 500 מ"ל של צמיחת תאי אנדותל מדיום שלם (EGM) על ידי המסת תוספי EGM למדיום הבסיסי לצמיחת תאי אנדותל (EBM) בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). Aliquot צמיחה בינונית לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן את הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס. חיי המדף של מדיום הצמיחה הם 12 חודשים ב -4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>תמיסת טריפסין: עבור תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25%, aliquot מבקבוקון המלאי לצינורות 50 מ"ל ולאחסן ב-4 °C (עד שבועיים) או −20 °C (עד 24 חודשים).</li>
</ol>2. טיפוח HRMECs
<ol><li>תרבית תאים ראשונית<ol><li>תרבית תאי ציפוי צלחות פטרי (קוטר 100 מ"מ x גובה 20 מ"מ) עם 5 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית ולשמור אותם ללא הפרעה במכסה המנוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לציפוי אחיד. הערה: ציפוי ג'לטין של כלים משפר את החיבור לתאים. לחלופין, ניתן להשתמש גם בצלוחיות תרבות T75 מצופות ג'לטין.</li>
		<li>לפני זריעת התאים, לשאוף את תמיסת הג'לטין באמצעות משאבת ואקום. לחץ הוואקום של השואף ששימש היה עד 724 מ"מ כספית. הערה: השאיפה חייבת להיעשות מיד לפני זריעת התאים כדי למנוע התייבשות מתמיסת הציפוי.</li>
		<li>הפשרת בקבוקון קפוא של HRMECs (מאחסון בחנקן נוזלי) על ידי שימוש באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או על ידי הוספת מדיום גידול חם לתוך הבקבוקון. לאחר ההפשרה, העבירו את תרחיף התאים ל-9 מ"ל של מדיום גדילה (בהנחה שהבקבוקון המופשר של HRMECs הוא 1 מ"ל). הערה: ה- HRMECs הושגו באופן מסחרי (טבלת חומרים). מדיום הגדילה שנוסף לתאים צריך תמיד להיות מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
		<li>סובב את התאים ב 200 x g במשך 5 דקות ב RT בזהירות לשאוף את supernatant כדי למנוע הסרת גלולה התא.</li>
		<li>יש לתלות את גלולת התא ב-10 מ"ל של מדיום גדילה ולהעביר את התרחיף שנוצר על צלחת פטרי מצופה ג'לטין. שמור את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. בדרך כלל, HRMECs הם 70%-80% מפגש לאחר 72 שעות. הערה: מדיום הצמיחה משתנה אחת ליומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>תת-תרבות של HRMECs על תוספות ממברנה חדירות<ol><li>הכן תוספות מסנן תרבית תאים (תוספות 6.5 מ"מ עם קרום פוליקרבונט בגודל נקבוביות 0.4 מיקרומטר, המונחות בצלחת של 24 בארות) לזריעת HRMECs על ידי ציפוי כל תוסף (תא אפיקלי) עם 200 μL של תמיסת ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות מתחת למכסה זרימה למינרית. ודא שהפתרון מכסה את כל המשטח התחתון של תוספת המסנן. הערה: לכל באר יש תא אפיקלי ובזולטרלי המופרדים על ידי קרום נקבובי.</li>
		<li>הוציאו את צלחת הפטרי עם HRMECs מתורבתים (שלב 2.1.5.) מהאינקובטור ושאפו את מדיית הצמיחה. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 2 עם 10 מ"ל של PBS 1x מתחת למכסה המנוע של זרימה למינרית כדי להיפטר מתאים צפים/מתים פוטנציאליים.</li>
		<li>לנתק את התאים עם 0.5-1 מ"ל של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA ולהניח את צלחת פטרי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2) במשך 5 דקות.</li>
		<li>להרוות את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 4.5-9 מ"ל של מדיית גדילה ולהעביר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה 10 מ"ל.</li>
		<li>סובב את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT, להסיר בזהירות את supernatant, ולהשעות את הכדור ב 3 מ"ל של מדיה צמיחה.</li>
		<li>ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי וזרע בצפיפות של 4 x 104 תאים לכל תוספת מסנן (כלומר, 1.25 x 105 תאים לס"מ2). נפח ההשעיה של התא עבור כל תוספת הוא 250 μL.</li>
		<li>שאפו את תמיסת הציפוי מהבארות המכילות תוספות חדירות והעבירו 250 μL של תרחיף התא לכל תוספת (תא apical). הוסף רק מדיום (כלומר, ללא תאים) לאחת התוספות, אשר ישמש כ"פקד ריק " למדידת TEER. בו זמנית, גם להוסיף 750 μL של בינוני לכל באר, בתאים basolateral.</li>
		<li>שמור את צלחת 24 באר עם תוספות חדירות באינקובטור (37 °C ו 5% CO 2) במשך 7-12 ימים עד התאים בתרבית להיות מפגש מלא ואת הערך TEER הרצוי של ~ 20 Ω·cm2 מושגת.</li>
		<li>שנה את מדיום הצמיחה כל יומיים. במהלך שינוי מדיה, שאפו בזהירות את המדיה כדי למזער את ההפרעה של חד-שכבתי התא והוסיפו 250 μL ו-750 μL של מדיה טרייה לכל באר לתאים apical ו-basolateral, בהתאמה. הערה: מדיום הצמיחה משתנה הן עבור התאים האפיקליים והן עבור התאים הבזולטרליים של הבארות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. מדידות TEER (איור 4)
<ol><li>ביום 14 לאחר זריעת תאים (שלב 2.2.9.), מדוד את ה- TEER עבור HRMECs באמצעות מערכת התנגדות חשמלית (ER) של מד וולט-אוהם אפיתל (EVOM) (טבלת חומרים) באופן הבא.</li>
	<li>טען מראש את מערכת המיון ובדוק את פונקציונליות המונה באמצעות אלקטרודת הבדיקה STX04. כייל, במידת הצורך.</li>
	<li>חבר את האלקטרודה למטר ושיווי משקל האלקטרודה על ידי השרייתה תחילה ב-70% אתנול למשך 15-20 דקות ולאחר מכן טבילתה לזמן קצר במדיום הגדילה של EGM בתרבית התא.</li>
	<li>בינתיים, שמור את צלחת 24 הבאר המכילה תאים במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ב- RT למשך 15-20 דקות לשיווי משקל טמפרטורה. הערה: מדידות TEER מושפעות מהטמפרטורה, ולכן שלב שיווי המשקל חיוני.</li>
	<li>למדידת TEER, הוסף מדיום גידול טרי הן לתאים האפיקליים (250 μL) והן לתאים הבזולטרליים (750 μL) של הבארות.</li>
	<li>בצע מדידת TEER על ידי טבילה זהירה של האלקטרודה כך שהקצה הקצר יותר נמצא בתוסף והקצה הארוך יותר נוגע בתחתית הבאר. מדוד תחילה את ההתנגדות על-פני הפקד הריק. עבור כל תוספת, מדוד TEER במשולשים. הערה: לשטיפת האלקטרודה בין המדידות, נעשה שימוש במדיית תרבית. ודא שהאלקטרודה מוחזקת בזווית של 90° לתחתית התוסף לקריאה יציבה.</li>
	<li>חישוב התנגדות חשמלית (ב Ω·ס"מ 2) על פני המונולאייר באמצעות הנוסחה, TEER = התנגדות נטו (Ω) x שטח הפנים של תוספת המסנן (ס"מ2); כאן, התנגדות נטו היא ההבדל בין ההתנגדות של כל באר (מדיום צמיחה עם תאים) לבין הבאר הריקה (רק מדיום צמיחה).</li>
	<li>בצע טיפול נוסף בתאים רק לאחר שערך ה- TEER מגיע ל~20 Ω·ס"מ2. אם לא מגיעים לרמת ה- TEER הרצויה, שמור את הצלחת באינקובטור ומדוד את ה- TEER למחרת. הערה: מפגש HRMEC יכול להיות מאומת גם על ידי בדיקה מורפולוגית של צורת התא (תחת מיקרוסקופ) עם מורפולוגיה טיפוסית מרוצפת אבן ו / או על ידי נוכחות של חלבונים צומת התא עם צביעת אימונוהיסטוכימיה בנפרד.</li>
</ol>4. בדיקת טרנסציטוזה
<ol><li>בדיקת טרנסציטוזה חוץ-גופית בתיווך קלתרין באמצעות טרנספרין מתויג Cy3 (איור 5)<ol><li>עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 Ω·cm 2, סרום לשלול את התאים במשך 24 שעות ב 37 °C ו 5% CO2 באמצעות 0.5% FBS ב EBM (מדיום מופחת בסרום) בשני התאים (תא apical: 250 μL ותא basolateral: 750 μL) לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה.</li>
		<li>דגירה של התאים (באמצעות המדיום המופחת בסרום בשלב 4.1.1.) בתא האפיקלי עם ליגנד טרנספרין (Cy3-Tf) מתויג פלואורסצנטי (ציאנין 3) (ריכוז סופי של 40 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הערה: יש להגן על לוחות המכילים Cy3-Tf מפני אור כדי למנוע הלבנה של Cy3-Tf על ידי עטיפת רדיד אלומיניום וביצוע הניסוי במכסה מנוע של תרבית תאים כאשר האורות כבויים.</li>
		<li>לאחר שעה אחת, הניחו את הצלחת על קרח ושטפו את המונולייר באופן אפי ובזולטרלי 4x (3-5 דקות לשטיפה) עם המדיום המופחת בסרום ב-RT כדי להסיר את Cy3-Tf החופשי שאינו מאוגד. הערה: שטיפה חיונית להסרת מולקולות עוקבות חופשיות ומאפשרת קריאה מדויקת של טרנסציטוזה ללא דליפה פוטנציאלית מהמסלול הפרה-תאי.</li>
		<li>הוסיפו מדיום מופחת סרום טרי (כמו בשלב 4.1.1.) לתוספות המסנן השטופות היטב המכילות תאים והעבירו את התוספות לבארות טריות של צלחת 24 בארות המכילות מדיום מופחת סרום שחומם מראש.</li>
		<li>דגירה של התאים במשך 90 דקות נוספות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2), ולאחר מכן אסוף את המדיום מתא הבזולטרלי.</li>
		<li>רשום את עוצמת הפלואורסצנטיות של התמיסה מתא הבזולטרלי באמצעות גלאי פלואורסצנטי. רמות עוצמת הפלואורסצנציה, הנמדדות כיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU), מצביעות על כמות הטרנסציטוזה של קומפלקס Cy3-Tf המועברת על פני המונו-שכבה HRMEC באמצעות טרנסציטוזה תלוית קלתרין.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת טרנסציטוזה חוץ-גופית בתיווך מערות באמצעות HRP (איור 6)<ol><li>עם הגעה למפגש מלא עם ערכי TEER סביב 20 Ω·cm 2, סרום לשלול את התאים במשך 24 שעות ב 37 °C ו 5% CO2 באמצעות 0.5% המכיל FBS בינוני (מדיום מופחת בסרום) לפני הטיפול (כמו בשלב 4.1.1.). מדיום EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה.</li>
		<li>טפלו בתאים שבחדר האפיקלי בעזרת הטיפולים הרצויים ובקרות הרכב. הערה: כאן, השתמשנו במודולטורים של Wnt כדוגמה כדי להדגים את הרגולציה של טרנסציטוזה בתיווך מערות על ידי מסלול האיתות Wnt ב- HRMECs: מעכב נורין רקומביננטי אנושי ומעכב Wnt XAV939. בניסוי טיפוסי, תאים טופלו במשך 24 שעות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2) בריכוזים הבאים: נורין (125 ננוגרם/מ"ל), נורין (125 ננוגרם/מ"ל) + XAV939 (10 מיקרומטר), ותמיסת בקרת רכב. בנוסף, נעשה שימוש גם במדיום מותנה Wnt3a (המיוצר מתאי L Wnt-3A).</li>
		<li>דגירה של התאים בתא האפיקלי עם HRP (5 מ"ג/מ"ל) למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאחר מכן, הניחו את צלחת 24 הבארות על קרח ושטפו את התאים האפיקליים והבזולטרליים באופן אינטנסיבי פי 6 עם חיץ P (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM נתרן פירובט, 10 mM גלוקוז, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) על מנת להסיר את HRP החוץ תאי החופשי. הערה: שטיפה חיונית להסרת מולקולות עוקבות חופשיות ומאפשרת קריאה מדויקת של טרנסציטוזה ללא דליפה פוטנציאלית מהמסלול הפרה-תאי.</li>
		<li>הוסיפו מדיום טרי מופחת בסרום (כמו בשלב 4.1.1.) לתא האפיקלי והעבירו את התוספות לבאר טרייה המכילה מדיה שחוממה מראש.</li>
		<li>דגירה מונולייר במשך 90 דקות נוספות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 לפני איסוף המדיום מן התא basolateral.</li>
		<li>למדיום שנאסף, יש להוסיף 100 μL של מצע פרוקסידאז פלואורוגני HRP (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן, ולדגירה ב-RT למשך 10 דקות לפני עצירת התגובה עם 100 μL של תמיסת עצירה.</li>
		<li>זהה את הרמות של תוצר תגובת מצע HRP במדיה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באורך גל פליטה של 420 ננומטר (עם עירור של 325 ננומטר) וכיחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU). הערכים מציינים את רמת הטרנסציטוזה של HRP על פני שכבת HRMEC באמצעות טרנסציטוזה בתיווך caveolae. הערה: המוצר הפלואורסצנטי המשמש כאן (טבלת חומרים) אינו פוטו-אקונומיקה. אין צורך בהגנה מפני הלבנה.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים או אינטרסים כספיים לחשוף.

BRB ממלא תפקיד חיוני בבריאות הרשתית ובמחלותיה. טכניקות במבחנה להערכת חדירות כלי הדם הוכיחו את עצמן ככלים חיוניים במחקרים הנוגעים להתפתחות ותפקוד של מחסומים (BRB/BBB). ההליך המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס טרנסציטוזה של EC או להעריך מודולטורים מולקולריים קשורים המשפיעים על חדירות BRB. במבחנה למבחני טרנסציטוזה של EC יש יתרונות מרובים על פני מבחני in vivo או טכניקות המשמשות להערכת חדירות כלי הדם. הם מהירים לביצוע עם תפוקה גבוהה וניתן להשתמש בהם כדי לנתח את ההש...

הרשתית האנושית היא אחת הרקמות הדורשות אנרגיה הגבוהה ביותר בגוף. תפקוד תקין של הרשתית העצבית דורש אספקה יעילה של חמצן וחומרים מזינים יחד עם שטף מוגבל של מולקולות אחרות שעלולות להזיק כדי להגן על סביבת הרשתית, המתווכת דרך מחסום הדם-רשתית (BRB)1. בדומה למחסום הדם-מוח (BBB) במערכת העצבים המרכזית, ה-BRB פועל כמחסום סלקטיבי בעין, המווסת את תנועת היונים, המים, חומצות האמינו והסוכר אל הרשתית וממנה. BRB גם שומר על הומאוסטזיס ברשתית ועל הפריבילגיה החיסונית שלו על ידי מניעת חשיפה לגורמים במחזור הדם כגון תאי מערכת החיסון, נוגדנים ופתוגנים מזיקים2. תפקוד לקוי של BRB תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, כגון רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית ואובאיטיס, וכתוצאה מכך בצקת וזוגנית ואובדן ראייהלאחר מכן 3,4,5.
ה-BRB מורכב משני מחסומים נפרדים עבור שתי רשתות כלי דם עיניים נפרדות, בהתאמה: כלי הדם ברשתית והכוריוקפילריס הפנסטרטיבי שמתחת לרשתית. ה-BRB הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (RMECs) המרפדים את המיקרו-ווסקולטורה של הרשתית, המזינים את השכבות העצביות הפנימיות ברשתית. מצד שני, אפיתל פיגמנט הרשתית מהווה את המרכיב העיקרי של BRB החיצוני, אשר נמצא בין הרשתית neurosensory ו choriocapillaris2. עבור ה-iBRB, ההובלה המולקולרית על פני RMECs מתבצעת דרך נתיבים על-תאיים וטרנס-תאיים כאחד (איור 1). הרמה הגבוהה של סלקטיביות החומר ב-iBRB מסתמכת על (i) נוכחותם של קומפלקסים של חלבונים צומתיים המגבילים את ההובלה העל-תאית בין תאי אנדותל סמוכים (ECs), ו-(ii) רמות ביטוי נמוכות של מתווכים, מובילים וקולטנים של caveolae בתוך תאי האנדותל השומרים על שיעורים נמוכים של הובלה טרנס-תאית 1,6,7,8 . קומפלקסים צמתים המווסתים את השטף הפארא-תאי מורכבים מצמתים הדוקים (קלודינים, occludins), צמתים דבקים (VE cadherins) וצמתי פער (connexins), המאפשרים מעבר של מים ותרכובות קטנות המסיסות במים. בעוד שמולקולות ליפופיליות קטנות מתפזרות באופן פסיבי על פני פנים ה-RMECs, התנועה של מולקולות ליפופיליות והידרופיליות גדולות יותר מווסתת על ידי מסלולים טרנס-אנדותליים מונעי ATP, כולל הובלה שלפוחיתית ומובילי ממברנות 5,9.
טרנסציטוזה שלפוחיתית עשויה להיות מסווגת כטרנסציטוזה מערות בתיווך קייבולין, טרנסציטוזה תלוית קלתרין (ובתיווך קולטן) ומקרופינוציטוזה שאינה תלויה בקלתרין (איור 2). תהליכי הובלה שלפוחיתיים אלה כוללים בועיות בגדלים שונים, כאשר המקרופינוזומים הם הגדולים ביותר (הנעים בין 200-500 ננומטר) ו-caveolae הם הקטנים ביותר (ממוצע של 50-100 ננומטר), בעוד ששלפוחיות מצופות קלתרין נעות בין 70-150 ננומטר10. Caveolae הם אינווגינציות של קרום פלזמה עשיר בשומנים בצורת בקבוקון עם ציפוי חלבון, המורכב בעיקר מ- caveolin-1 הקושר כולסטרול של קרום השומנים וחלבונים מבניים ואיתותים אחרים באמצעות תחום פיגומי המערותשלהם 11. Caveolins פועלים יחד עם cavin מחובר היקפית כדי לקדם ייצוב caveolae בקרום פלזמה12. ממברנות מערות עשויות גם לשאת קולטנים למולקולות אחרות כגון אינסולין, אלבומין וליפופרוטאינים במחזור, כולל ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) כדי לסייע לתנועתם על פני תאי האנדותל13. במהלך הפיתוח, היווצרות של BRB פונקציונלי תלוי דיכוי של EC transcytosis8. אנדותל רשתית בוגר, לפיכך, יש רמות נמוכות יחסית של קולטני caveolae, caveolin-1, ו albumin ביחס לתאי אנדותל אחרים בתנאים פיזיולוגיים, תורם תכונות המחסום שלה 4,9.
מכיוון שהתמוטטות iBRB היא סימן היכר מרכזי של מחלות עיניים פתולוגיות רבות, חיוני לפתח שיטות להערכת חדירות כלי הדם ברשתית in vivo ו- in vitro. שיטות אלה מסייעות לספק תובנות סבירות לגבי המנגנונים של שלמות BRB שנפגעה ולהעריך את היעילות של מטרות טיפוליות פוטנציאליות. הדמיית in vivo נוכחית או בדיקות דליפת כלי דם כמותיות משתמשות בדרך כלל בפלואורסצנט (נתרן פלואורסצין ודקסטרון), קולורימטרי (צבע כחול אוונס ומצע פרוקסידאז חזרת [HRP]), או עוקבים רדיואקטיביים14 כדי לזהות אקסטרווזיה מכלי הדם לרקמות הרשתית הסובבות באמצעות הדמיית מיקרוסקופ או בליזאט רקמה מבודדת. עקיבה אידיאלית לכימות שלמות כלי הדם צריכה להיות אינרטית וגדולה מספיק כדי לחדור באופן חופשי לכלי דם פגועים בעודם כלואים בתוך נימים בריאים ושלמים. שיטות המשתמשות בנתרן פלואורסצין או פלואורסצין איזותיוציאנט מצומד דקסטרן (FITC-dextran) באנגיוגרפיה חיה של פונדוס פלואורסצין (FFA) או בתושבות שטוחות רשתית מבודדות נמצאות בשימוש נרחב לכמותית של אקסטרוואסציה ברשתית in vivo או ex vivo. ל-FITC-dextran יש את היתרון בכך שהוא זמין במשקלים מולקולריים שונים הנעים בין 4-70 kDa למחקרים סלקטיביים בגודל15,16,17. FITC-אלבומין (~68 kDa) הוא מעקב חלבוני חלופי בגודל גדול בעל רלוונטיות ביולוגית למחקרי דליפת כלי דם18. הצבע הכחול של אוונס, שהוזרק באופן תוך-קרדיאלי19, רטרו-אורביטלי, או דרך וריד הזנב 20, מסתמך גם על קשירתו עם אלבומין אנדוגני כדי ליצור מולקולה גדולה שניתן לכמת על ידי זיהוי ספקטרופוטומטרי בעיקר, או, פחות נפוץ, מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתב-20,21 תושבות שטוחות. עם זאת, מתודולוגיות הדמיה כמותיות או קלות אלה אינן מבחינות לעתים קרובות בין הובלה פארא-תאית לבין הובלה טרנס-אנדותל. לצורך ניתוח ספציפי של טרנסציטוזה עם הדמיה אולטרה-סטרוקטורלית של שלפוחיות טרנסציטוזיות, מולקולות עקיבה כגון HRP משמשות בדרך כלל לאיתור שלפוחיות טרנסציטוזה בתוך תאי אנדותל שניתן לצפות בהן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים22,23,24 (איור 3A-C).
הפיתוח והשימוש במודלים של iBRB במבחנה להערכת חדירות תאי האנדותל יכולים לספק הערכת תפוקה חזקה וגבוהה כדי להשלים ניסויי in vivo ולסייע בחקירת הרגולטורים המולקולריים של דליפת כלי דם. מבחנים נפוצים להערכת ההובלה העל-תאית והשלמות של צמתים הדוקים כוללים התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER), מידה של מוליכות יונית (איור 4)2,25, ובדיקת דליפת כלי דם במבחנה באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים במשקל מולקולרי קטן 26. בנוסף, מבחני טרנסציטוזה מבוססי טרנסציטוזה המבוססים על טרנספירין מודלים BBB שימשו לחקר טרנסציטוזה תלוית קלתרין27. למרות זאת, בדיקות להערכת BRB, וליתר דיוק, רשתית EC caveolar transcytosis במבחנה מוגבלים.
במחקר זה, אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של EC באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) כמודל במבחנה לקביעת חדירות iBRB וטרנסציטוזה של EC. בדיקה זו מסתמכת על היכולת של HRMECs להעביר טרנספרין או HRP דרך מסלולי טרנסציטוזה בתיווך קולטן או תלויי מערות, בהתאמה (איור 2). HRMECs שגודלו בתרבית למפגש מלא בתא האפיקלי (כלומר, תוסף מסנן) דוגרו עם טרנספרין מצומד-פלואורסצנטי (Cy3-Tf) או HRP כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות המתאימה לרמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון באמצעות טרנסציטוזה EC בלבד. מפגש של מונולאייר התא יכול להיות מאושר על ידי מדידת TEER, המציין את שלמות הצומת הדוק25. כדי להדגים את טכניקת הבדיקה של TEER וטרנסציטוזה, נעשה שימוש במודולטורים מולקולריים ידועים של חדירות כלי דם וטרנסציטוזה של EC, כולל גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF)28 ואלה באיתות Wnt (ליגנדות Wnt: Wnt3a ונורין)29.

<table><tbody><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים פטרידיש&nbsp;</td>צנטריפוגה <td>704001</td><td></td> <td>נסט ביוטכנולוגיה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>צינורות צנטריפוגה <td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>(15 מ"ל)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352097 צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)</td><td>דנוויל סיינטיפיק בע"מ</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>ציאנין 3-טרנספרין אנושי&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל בסיסי בינוני-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) תוספי SingleQuots</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר (2 שבבים)</td><td>בולדוג ביו</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז (HRP)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית (HRMEC)</td><td>מערכות תאים</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>תרמו אלקטרון תאגיד, תאי Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L (עבור מדיום מותנה בקרה)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A תאים (עבור מדיום מותנה Wnt3A)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Plate Reader</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) מאגר (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מצע פרוקסידאז פלואורוגני QuantaBlu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>נורין אנושי רקומביננטי (rhNorrin)</td><td>R& D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אנדותל כלי דם רקומביננטי (rhVEGF)</td><td>R& מסנן מזרק D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>(0.22 ומיקרו; m)</td> <td>תוספות Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell (6.5 מ"מ transwell, 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליאסטר ממברנה הכנסת)</td><td>קורנינג בע"מ</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%) (1x)</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>דיוק אמבט מים</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (מעכב Wnt/&beta;-catenin)</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל in vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

תפקוד לקוי של מחסום הדם-רשתית (BRB) תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, שלעתים קרובות גורמות לבצקת רשתית ולאובדן ראייה לאחר מכן. מחסום הדם-רשתית הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מאנדותל כלי דם ברשתית עם חדירות נמוכה בתנאים פיזיולוגיים. תכונה זו של חדירות נמוכה מווסתת היטב ומתוחזקת על ידי שיעורים נמוכים של הובלה פארא-תאית בין תאי אנדותל מיקרווסקולריים ברשתית סמוכים, כמו גם הובלה טרנס-תאית (טרנסציטוזה) דרכם. הערכת חדירות המחסום הטרנס-תאי ברשתית עשויה לספק תובנות בסיסיות לגבי שלמות ה-iBRB בבריאות ובמחלות. במחקר זה אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל (EC), כמודל חוץ גופי להערכת חדירות iBRB, תוך שימוש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs). בדיקה זו מעריכה את יכולתם של HRMECs להעביר טרנספרין ופרוקסידאז חזרת (HRP) בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך קולטן וקאוולה, בהתאמה. HRMECs בעלי השפעה מלאה שגודלו בתרבית על ממברנה נקבובית הודגמו עם טרנספרין מתויג פלואורסצנטי (טרנסציטוזה תלוית קלתרין) או HRP (טרנסציטוזה בתיווך caveolae) כדי למדוד את רמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון, מה שמעיד על רמות טרנסציטוזה על פני המונולייר EC. איתות WNT, מסלול ידוע המווסת את iBRB, הונע כדי להדגים את שיטת הבדיקה הטרנסציטוזה המבוססת על HRP בתיווך caveolae. בדיקת הטרנסציטוזה של EC המתוארת כאן עשויה לספק כלי שימושי לחקר הרגולטורים המולקולריים של חדירות EC ותקינות iBRB בפאתולוגיות וסקולריות ולסינון מערכות אספקת תרופות.

תמונות EM של אנדותל כלי דם ברשתית מראות הובלה שלפוחיתית טרנסציטוטית ושלפוחיות מערות בתאי אנדותל in vivo. ניתן לדמיין טרנסציטוזה של EC in vivo בתוך חתכי רשתית עם משקע חום כהה המשקף כלי דם המכילים HRP תחת מיקרוסקופ אור (איור 3A) וכמשקע צפוף אלקטרונים המעיד על שלפוחיות טרנסציטוטיות המכילות HRP (איור 3B,C) באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מעביר (TEM), ובכך מדגים טרנסציטוזה של EC על פני ה-iBRB.<strong...

פרוטוקול זה מדגים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל במבחנה כמודל להערכת חדירות מחסום הדם-רשתית הפנימית על ידי מדידת יכולתם של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית להעביר פרוקסידאז חזרת על פני תאים בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך caveolae.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

פרוטוקול זה מספק מודל שימושי מבוסס תאים לחקר התפקוד והחדירות של מחסומי כלי דם סלקטיביים כגון מחסום דם-רשתית או דם-מוח עם התמקדות ספציפית באנדותל טרנסציטוזה. בדיקה זו קלה להתקנה ולשימוש שאינה דורשת בעלי חיים חיים. ניתן להשתמש בו לחקר רגולטורים מולקולריים שונים של חדירות תאי אנדותל וטרנסציטוזה המשפיעים על שלמות מחסום הרשתית הפנימית.בדיקה זו יכולה לספק תובנות על ביולוגיה של כלי הדם ועל חקר העיניים והמוח, ומאפשרת הבנה טובה יותר של מנגנוני המולקולה העומדים בבסיס בקרת BRB BBB ולחקור העברת תרופות פוטנציאלית מעבר למחסומים. כדי להתחיל, הכינו את תוסף מסנן תרבית התאים לזריעת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית או HRMECs, על ידי ציפוי כל תוסף ב-200 מיקרוליטרים של תמיסת ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית. ודא שהפתרון מכסה את כל המשטח התחתון של תוספת המסנן.קחו צלחת פטרי עם HRMECs מתורבתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, ושאפו את מדיית הצמיחה. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של 1X PBS מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית כדי להיפטר מהתאים הצפים או המתים הפוטנציאליים. לנתק את התאים עם 0.5 עד 1 מיליליטר של 0.25% תמיסת טריפסין-EDTA ולהניח את צלחת פטרי באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 5 דקות.להרוות את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 4.5 עד 9 מיליליטר של מדיה גדילה ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות פיפטה 10 מיליליטר. סובבו את התאים 200 פעמים גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות את הכדור ב 3 מיליליטר של מדיה צמיחה.לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ידני או מונה תאים אוטומטי וזרע בצפיפות של 40, 000 תאים לכל מסנן להוסיף. נפח ההשעיה של התא עבור כל תוספת הוא 250 microliters. שאפו את תמיסת הציפוי מהבארות המכילות תוספות חדירות והעבירו 250 מיקרוליטרים של תרחיף התא לכל הוספה, ולאחר מכן הוסיפו רק מדיום לאחת התוספות, אשר ישמשו כבקרה ריקה להתנגדות חשמלית טרנסאנדותלית, או TEER, מדידה.בו זמנית, גם להוסיף 750 microliters של בינוני לכל באר בתאים basolateral. שמור את צלחת 24 באר עם תוספות חדירות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 7 עד 12 ימים עד תאים בתרבית להיות מפגש מלא ואת הערך TEER הרצוי של כ 20 אוהם לסנטימטר מרובע מושגת. לפני מדידות TEER, הנח את הלוח המכיל 24 בארות בתא במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות לשיווי משקל טמפרטורה.כדי למדוד את ה-TEER עבור HRMECs, באמצעות מערכת התנגדות חשמלית של וולט/אוהם האפיתל, חבר את האלקטרודה למטר, ושיווי משקל האלקטרודה על ידי השרייתה תחילה ב-70% אתנול למשך 15 עד 20 דקות ולאחר מכן טבילתה לזמן קצר במדיום הגדילה של תרבית התאים EGM. בצע מדידת TEER על ידי טבילה זהירה של האלקטרודה, כך שהקצה הקצר יותר נמצא בתוסף והקצה הארוך יותר נוגע בתחתית הבאר. מדוד תחילה את ההתנגדות על-פני הפקד הריק, ולאחר מכן עבור כל תוספת, מדוד את TEER במשולשים.עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 אוהם סנטימטרים רבועים, לשלול את התאים בסרום למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באמצעות 0.5% FBS ב- EBM בשני התאים לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה. דגירה של התאים באמצעות המדיום המופחת בסרום בתא האפיקלי עם תג ציאנין-3 פלואורסצנטי לליגנד טרנספרין למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שטיפת המונולאייר באופן אפי ובזולטרלי 4 פעמים עם המדיום מופחת הסרום, הוסיפו מדיום טרי לתוספות המסנן המכילות את התאים והעבירו את התוספות לבארות טריות של צלחת 24 הבארות המכילות מדיום מופחת סרום שחומם מראש. דגירה של התאים במשך 90 דקות נוספות באינקובטור ולאחר מכן לאסוף את המדיום מן התא basolateral. רשום את עוצמת הפלואורסצנטיות של התמיסה מתא הבזולטרלי באמצעות גלאי פלואורסצנטי.עם ההגעה למפגש עם ערכי TEER סביב 20 אוהם סנטימטר מרובע, לסרום לשלול את התאים למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באמצעות 0.5% FBS ב- EBM בשני התאים לפני הטיפול עם הליגנד. EBM מופחת סרום שימש לאורך כל הבדיקה. לאחר מכן, יש לטפל בתאים שבחדר האפיקלי באמצעות הטיפולים הרצויים ובקרות הרכב.מוסיפים 5 מיליגרם למיליליטר של פרוקסידאז חזרת, או HRP, לתאים, ודוגרים במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו מדיום טרי מופחת סרום לתא האפיקלי והעבירו את התוספות לבאר טרייה המכילה מדיה שחוממה מראש. לדגור את המונולייר במשך 90 דקות נוספות באינקובטור.לאחר איסוף מדיום מתא basolateral, להוסיף 100 microliters של HRP פלואורוגני peroxidase מצע למדיום שנאסף לדגרה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. עצור את התגובה עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת עצירה וזהה את הרמות של תוצר תגובת מצע HRP בתקשורת באמצעות קורא צלחות פלואורסצנטי. לפני הדגמת מבחני הטרנסציטוזה במבחנה, הדמיה של טרנסציטוזה של תאי אנדותל ברשתית מוצגת כמידע רקע.כאן, תמונת מיקרוסקופ האור מראה לומן כלי דם מלא HRP ממקטע רשתית של עכבר מסוג פרא בן 3 חודשים המוכתם ב- DAB. HRP הוזרק רטרו-מסלולי. ניתן לראות כלי רשתית מלאים ב-HRP כמשקעים חומים כהים מתחת למיקרוסקופ הבהיר.מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים דק במיוחד מראה כלי דם טרנסציטוטיים מלאים HRP עם RMECs המתארים טרנסציטוזה EC על פני מחסום הדם-רשתית הפנימי. כאן, השלפוחית הגדולה עשויה לשקף מקרופינוזום ותא דם אדום בצד הזוהר. תמונת TeM מציגה שלפוחיות טרנסציטוטיות קטנות מלאות HRP, ככל הנראה שלפוחיות קאוולה, בתוך RMEC.צביעה אימונוהיסטוכימית של נוגדן CAV-1 ואיזולקטין B4 מדגימה את לוקליזציה של CAV-1, סמן של שלפוחיות קייבולה בכלי הדם ברשתית, ברשתית עכבר מסוג בר בת 3 חודשים. תמונת TeM של CAV-1 עם תווית אימונוגולד בתוך תאי האנדותל ברשתית מוצגת כאן עם תמונה מוגדלת של שלפוחית קייבולה חיובית CAV-1. עבור בדיקת טרנסציטוזה EC בתיווך קלתרין ב- HRMECs באמצעות טרנספרין, כאן, תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה העברה אנדוציטוזית של Cy3 בצבע אדום בתוך HRMECs מוכתמים ב- DAPI בכחול.עבור טרנסציטוזה EC בתיווך מערות באמצעות HRP, איתות Wnt כאן משמש כדוגמה להדגמת הבדיקה. איתות Wnt נמצא לאחרונה כדי לווסת טרנסציטוזה EC בתיווך caveolae. התאים טופלו באמצעות מפעיל מסלול Wnt עם מדיום מותנה Wnt3a ונורין רקומביננטי, עם או בלי מעכב איתות Wnt XAV939 והבקרות הריאקטיביות שלהם.מפעילי Wnt הפחיתו את רמת הטרנסציטוזה מבוססת HRP, שהתהפכה על ידי XAV939. מדידת TEER נכונה היא חיונית כדי לקבוע את שלמות החד-שכבתי. הוא מושפע מאוד מגורמים שונים כגון טיפול לא תקין, תנודות טמפרטורה, מדיום תרבות, משך תרבות וכו '.בדיקה זו יכולה להשתנות כתרבית משותפת או כמערכות תרבית אורגנוטיפית תלת-ממדית המחקות תנאי in vivo.

endothelial-cell-transcytosis-assay-as-an-vitro-model-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר בדיקת חדירות להערכת החדירות של מחסום דם-מוח במבחנה באמצעות מולקולות נתרן פלואורסצאין.

מחסום דם-מוח מחקה בדיקת חדירות: בדיקת מבחנה להערכת החדירות של חיקוי BBB למולקולות עוקבות

סרטון זה מדגים שיטה להערכת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל (TEER) בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח עכבר במבחנה. ערך TEER גבוה מצביע על צמתים שלמים של תאי אנדותל, בעוד שתוספת של תאי T מופעלים מורידה את ערך ה-TEER, ומשקפת שיבוש של מחסום הצומת.

הערכת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל במודל מחסום דם-מוח במבחנה

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

מתוארת ומאומתת שיטה להקמת מודל מבחנה של מחסום דם-מוח המבוסס על תרבית משותפת של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח חולדות ואסטרוציטים. מערכת זו הוכיחה את עצמה ככלי תקף לחקר השפעת הננו-פורמולה על חדירת מחסום הטרנס-מחסום של מולקולות פלואורסצנטיות.

במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פוטנציאלית, A4 lipoxin.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

חקור מנגנוני טרנסציטוזה באנדותל כדי להעריך חדירות מחסום הרשתית הפנימית באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים רטינליים אנושיים. שיטה זו מאפשרת חקר רגולטורים מולקולריים ואסטרטגיות מסירת תרופות.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

גלה סרטונים נוספים