מודל אימונותרפיה ניסיוני למלנומה באמצעות חיסון לגידול עם ציטוקין המטופויאטי

הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.

פרוטוקול זה מספק מודל אימונותרפיה קליני מוצק של גידולים ופלטפורמת מחקר לחקר הקשר בין תאי הגידול לתאי מערכת החיסון החודרים. חיסון גידול מבוסס תאים זה הוא נוח, פשוט לשימוש, וניתן לשלב אותו עם שיטות טיפוליות אחרות כגון חסימת מחסום, כדי להשיג אפקט תוסף או סינרגטי שיכול לגרום לחסינות גידול חזקה יותר וגבוהה. מי שתעזור להדגים את ההליך תהיה אן בלנסיו, טכנאית מחקר מהמעבדה שלי.

בתור התחלה, תרבית B16-F10 תאי מלנומה ב- IMDM, המכילים 10% FBS לא פעיל בחום, גלוטמין 2 מילימולרי, 1 מילימולאר נתרן פירובט, 1 מילימולר MEM חומצות אמינו לא חיוניות ו 100 יחידות למיליליטר כל אחד של פניצילין וסטרפטומיצין. שמרו על קו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. זרעו וקצרו את תאי B16-F10 כמתואר בכתב היד של הטקסט.

הסר את מדיום התרבות ולשטוף את הצלוחיות פעם אחת עם PBS. שאפו PBS והוסיפו 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA, ולאחר מכן טפחו בחוזקה על שפת בקבוק התרבית. הוסף 15 מיליליטר של מדיום תרבות כדי לנטרל את טריפסין-EDTA ויוצקים את תוכן הבקבוקון לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

לשטוף את פני השטח עם 10 מיליליטר של PBS ויוצקים לתוך אותו צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים במשך 5 דקות ב 200 RCF. השליכו את הסופר-נטנט ושברו את כדור התא על ידי הקשה באצבע על תחתית הצינור.

הוסף 10 מיליליטר קר של PBS בעדינות פיפטה את ההשעיה התא. לאחר מכן, לספור ידנית את התאים באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על הקרח לפני ההזרקה.

השתלה תוך-עורית של 500, 000 תאים B16-F10 תאי גידול ב -50 מיקרוליטרים של PBS קר באגף השמאלי, באמצעות מחט 30 מד. ייתכן שיהיה צורך להתאים את המינון של תאי גידול B16-F10 מושתלים בטווח של 50, 000 עד 500, 000 תאים להתפתחות מוצלחת של הגידול. לאחר היישום, יש למדוד את אורך ורוחב הגידול שלוש פעמים בשבוע באמצעות קליפר דיגיטלי אלקטרוני.

לחשב את נפח הגידול ולטפל בעכברים עם חיסון הגידול כאשר הגידולים הגיעו לגודל של שני מילימטרים כמתואר בכתב היד של הטקסט. באמצעות הקרנה רנטגן שנקבעה על 160 קילווולט ו -25 מיליאמפר, מקרינים תאים ב -150 מנות אפורות של קרני גמא. לספור ולבדוק את כדאיות התא על ידי מכתים כחולים טריפאן לפני ההזרקה.

להזריק לעכברים באופן תוך-עורי מיליון תאי B16-Flt3L מוקרנים ב-50 מיקרוליטרים של PBS קר באותו אגף של השתלת הגידול המקורית. כסנטימטר אחד מאתר הגידול הראשוני בימים 3, 6 ו -9 לאחר השתלת התא הראשונית. סמן את אתרי הזרקת החיסון בעט צבעוני כדי להבדיל אותם מהגידול הראשוני.

אם 50, 000 תאי B16-F10 הושתלו לראשונה, מומלץ לבצע טיפול חיסוני בימים 8, 11 ו -14. בניתוח הסיר את הגידול עם העור מכל עכבר מורדם והכניס אותו לצלחת 24 באר עם 1 מיליליטר של 10% FBS RPMI 1640 בינוני. חותכים את הגידולים לחתיכות קטנות בשני מיליליטר של חיץ עיכול ודגרה במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

הוסף 10 מיליליטר של 10% FBS RPMI 1640 בינוני כדי לעצור את העיכול. מעבירים את התאים למסננת תאים בקוטר 40 מיקרומטר באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מיליליטר. לאחר מכן השתמש בבוכנה של מזרק מיליליטר אחד כדי לטחון את הרקמות.

צנטריפוגה של התאים ב 500 RCF במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. החזירו את הכדור ל-5 מיליליטר של מדיום ספציפי בצפיפות של 40% ב-PBS מדולל לריכוז של פי 1. הוסף את תרחיף התא באיטיות על גבי 5 מיליליטר של 80% צפיפות הדרגתית מדיום ספציפי המכיל PBS.

צנטריפוגה לתאים ב-325 RCF עם הגדרת בלם נמוכה למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, לאסוף בזהירות את שכבת לויקוציטים בממשק בין 40% ל 80% צפיפות הדרגתית מדיום ספציפי, ולהעביר אותו דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר. צנטריפוגה של התאים ב 500 RCF במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.

לדגור את הכדור בשני מיליליטר של חיץ תזה של תאי דם אדומים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הוסף 10 מיליליטר של 10% FBS RPMI 1640 בינוני כדי להרוות את חיץ ליזה RBC. צנטריפוגה של התאים ב 400 RCF במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.

יש להשעות את התאים ב-0.5 מיליליטר של 10% FBS RPMI 1640 בינוני, ולספור את המספר הכולל של התאים לפני השימוש לניתוח נוסף. אסוף את הטחול או את בלוטות הלימפה המתנקזות כבקרות לאסטרטגיית הגידור של תת-קבוצות תאי מערכת החיסון על ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה. בצע את שיטת בידוד התאים המתוארת בכתב היד של הטקסט.

נקודה שחורה נראית לעין של תאי B16-F10 המושתלים נצפתה בדרך כלל על פני העור כשלושה ימים לאחר השתלת הגידול. עכברים טופלו בחיסון לגידול שלושה, שישה ותשעה ימים לאחר שהגולם הגידולי הגיע או עלה על גודל של שני מילימטרים. ירידה משמעותית בצמיחת הגידול נצפתה בקבוצת העכברים המחוסנים כשבועיים לאחר השתלת הגידול.

תאים שנאספו משכבת הלוקוציטים הכילו תאי גידול רבים, מה שהקשה על הגדרה קלה של אוכלוסיית הלימפוציטים. לכן, splenocyte שימשו במקביל, עבור gating תקין של תת-קבוצות תאי החיסון intratumoral בניתוח ציטומטריה זרימה. אסטרטגיות הגידור של CD103 חיובי, CD11C חיובי DC, CD8 חיובי, CD4 חיובי, ו Treg תוכננו יחד עם מטריצת הפיצוי.

כמו כן סופקו נתונים מייצגים של חשבונות שנרכשו ותדירות של כל אוכלוסייה. CD103 חיובי תוך-גידולי, CD11C חיובי DC מעכברים מחוסנים, הציג ביטוי מוגבר באופן משמעותי של ליגנד CD86 מגרה משותף. עכברים מחוסנים הראו גם עלייה בתאים חיוביים ל-CD8 ו-CD4 חיוביים, Foxp3 שליליים, וכן ב-CD8 חיובי גראנזים B חיובי ואינטרפרון גמא חיובי CTLs.

שמור על מרחק מספיק בין הגידול הראשוני לחיסון הגידול. הפרדה פיזית זו היא קריטית כדי למנוע איחוי פוטנציאלי בין שני השתלים הגידוליים.