שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

פרוטוקול זה ינחה את העובדים על חלבונים קושרי ממברנה לקבוע כיצד צורת הממברנה ממלאת תפקיד בארגון מכלולי חלבונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרבגוניות שלה עבור סוג החלבון, הרכב הממברנה וגיאומטריית הממברנה. זה גם מאפשר חקירה של איך bilayer שומנים יכול לשנות תכונות של חלבונים הקשורים.

כדי לזהות קרום טוב לניסוי, אנו מציעים להקים רשימת תיוג שעשויה לכלול שיעורי דיפוזיה של שומנים, ניידות של החלבון המעניין והאם יש ליפוזומים לא מתפוצצים או ליפוזומים מתמזגים שנדבקו לפני השטח. כדי להתחיל בניקוי פלזמה של השקופיות, לטהר את מנקה הפלזמה במשך חמש דקות עם חמצן כדי להסיר אוויר מן הקווים ואת החדר. סדרו את זכוכית הכיסוי היבש לתוך עריסת קרמיקה.

בזמן הטיהור, הזרם גז אינרטי מעל זכוכית כיסוי המיקרו מחליק כדי להסיר אבק וחלקיקים. מניחים את העריסה בחלק האחורי של תא הפלזמה כך שהכיסויים מקבילים לקצה הארוך של התא. הפעל את מנקה הפלזמה במשך 15 דקות עם חמצן בעוצמה מקסימלית.

להכנת התא, חתכו את המכסה ממש מתחת לחלק הקפוא של צינור PCR של 0.2 מיליליטר. צבעו את שפת צינור ה-PCR בדבק המופעל באמצעות UV תוך הימנעות מהחלק הפנימי של הצינור. הניחו בעדינות את דבק צינור ה-PCR במרכז כיסוי שעבר ניקוי פלזמה, ולאחר מכן הניחו את התא תחת אור UV באורך גל ארוך למשך חמש עד שבע דקות כדי לרפא את הדבק.

כדי ליצור bilayer, להוסיף את הריאגנטים לבאר. נערו בעדינות את התאים מצד לצד כדי לשבש את רכבי השטח ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את הדו-שכבה שש פעמים עם 150 מיקרוליטרים של SLBB על ידי פיפטינג כדי לשטוף את עודפי השומנים, ולאחר מכן שטפו את הדו-שכבה שש פעמים עם 150 מיקרוליטרים של חיץ תגובה לפני הדגירה עם ספטינים.

בשלב הכביסה האחרון, הסר את חיץ התגובה, והשאיר 75 מיקרוליטר בבאר. הוסף 25 מיקרוליטרים של ספטינים מדוללים ב- SSB ותמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF. ראשית, מערבלים את הבקבוק המכיל מיקרוספרות סיליקה למשך 15 שניות, לאחר מכן מתרחצים במשך דקה אחת ומערבולות שוב למשך 15 שניות כדי לשבור את כל האשכולות.

ערבבו את החרוזים עם SLBB ו-10 מיקרוליטרים של רכבי שטח של חמישה מילימולרים בצינור מיקרוצנטריפוגה עם הידבקות נמוכה. דגרו את תערובת השומנים בחרוזים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר כדי למנוע שקיעה. בינתיים, הפשירו כיסוי פגי והדביקו אליו צינור PCR של 0.2 מיליליטר.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה של החרוזים למשך 30 שניות ב- RCF המיועד. לאחר הסיבוב הראשון, להסיר 50 microliters של supernatant, ולאחר מכן להוסיף 200 microliters של PRB ומערבבים על ידי pipetting נמרץ. בסבבים הבאים, הסר 200 מיקרוליטרים של PRB והוסף עוד 200 מיקרוליטרים לאחר הספין השני והשלישי והוסף 220 מיקרוליטרים של PRB לאחר הספין הרביעי.

אם מבצעים בדיקת תחרות עם גדלי חרוזים מרובים, מכינים את התגובה על ידי ערבוב נפחים שווים של כל גודל חרוז ודילול 29 מיקרוליטרים של תערובת חרוזים זו עם 721 מיקרוליטרים של מאגר תגובה, ולאחר מכן מוסיפים 75 מיקרוליטרים של חרוזים מדוללים ו -25 מיקרוליטרים של החלבון המדולל ב- SSB לבארות ומערבבים. אם מודדים ספטינים במצב יציב, דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת ולאחר מכן מדמים ליד TIRF או מיקרוסקופיה קונפוקלית. מיקרוגרפים של TIRF של SLBs מישוריים שהודגמו עם ספטינים שהוצגו בירוק הראו התפלגות חלבונים הומוגנית.

SLBs שנעשו עם כיסויי זכוכית מנוקים היטב הראו חורים או רווחים bilayer באזורים של ספטין נמוך. ליפוזומים לא מתפרצים וצינוריים עשויים להצטבר על פני השטח אם נעשה שימוש בליפוזומים ישנים או אם השטיפות אינן מחמירות. במיקרוגרפים של מיקרוספרות מצופות שומנים שהודגמו באמצעות רודמין PE הראו תצהיר דו-שכבתי חלק.

התמיכות הכדוריות היו מצופות באופן שווה על ידי הממברנה והיו מעט אשכולות חרוזים. שטיפה לא מספקת של עודפי שומנים גרמה לציפוי ממברנה לא אחיד כפי שנצפה על ידי גושי שומנים וטיפול לא נכון גרם לפערים בדו-שכבתי. ערבוב לא מספיק של חרוזים גרם לגושים שאינם אידיאליים למדידת ספיגת החלבון הכוללת.

באמצעות דו-שכבתי השומנים הנתמכים המוצגים כאן, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיית הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים, ציטומטריה המונית של ממברנות ומיקרוסקופיה של כוח אטומי במהירות גבוהה כדי לבחון דינמיקה שונה של חלבון-חלבון או חלבון-ממברנה.