סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מציג את העלות הנמוכה ביותר ואת השיטות הטכנולוגיות הנמוכות ביותר לשירות הזדקנות באלגנס ים. אורגניזם מודל משפיע בביולוגיה של ההזדקנות. היתרון הגדול ביותר של שיטות אלה הוא קלות היישום, באמצעות ציוד בעלות נמוכה וחומר.

הפיכתם למקובלים על כל חוקר ללא קשר לניסיון או למימון זמין. כמחקרי הזדקנות ותיקים יש שונות טבעית בבריאות בתוך אוכלוסיות. לכן, חיוני שהניסויים יבוצעו על בעלי חיים בריאים, מוזנים היטב ומסונכרנים היטב.

כדי להבטיח נכות קרע התחל בהכנת מדיית גידול נמטודה של ליטר אחד או צלחת אוגר NGM. מוסיפים 2.5 גרם של טון פפ, 3.0 גרם של נתרן כלורי ו 20 גרם של אוגר לתוך בקבוק ליטר אחד עם מוט ערבוב ומוסיפים מים מזוקקים לנפח סופי של 970 מיליליטר. יש לחטא את תמיסת האוגר NGM בבקבוקון של ליטר אחד באמצעות אוטוקלאב סטנדרטי או מעקר מדיה.

ולתת את הפתרון לערבב עד שהוא מתקרר ל 60 עד 75 מעלות צלזיוס. בזמן שהתמיסה מתקררת, מחממים אמבט חרוזים ל-65 עד 70 מעלות צלזיוס. לאחר שתמיסת האוגר NGM מתקררת ל-60 עד 75 מעלות צלזיוס.

מוסיפים את התוספים הנוזליים ומאפשרים לתמיסה להתערבב לחלוטין במשך חמש דקות. לאחר מכן טבלו את הבקבוקון באמבט חרוזים בטמפרטורה של 65 עד 70 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהתקשורת להתמצק תוך כדי מזיגה לצלחת. פיפטה תשעה עד 11 מיליליטר של התמיסה לתוך כל צלחת 60 מיליליטר.

בסיום, החזירו את הפיפטה לתמיסה המחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה ולמנוע התמצקות של כל מדיה בפיפטה. חזור על התהליך עבור כל הצלחות ולאפשר NGM צלחת להתמצק בן לילה. לאחר שהתמצקו, השתמשו בהם לזריעה של צלחות עם חיידקים או אחסנו את הצלחות במיכלים אטומים למשך עד שלושה חודשים בארבע מעלות צלזיוס כדי לסנכרן את התולעים באמצעות הלבנה.

אספו את הנמטודות על ידי שפיכת כמות קטנה של תמיסת M9 על צלחת המכילה את התולעים מבלי למלא את צלחת הפטרי יתר על המידה. לאחר מכן סובבו את תמיסת M nine בעדינות כדי לשחרר תולעים ממדשאות החיידקים. לאחר מכן, לאסוף תולעים gravid בוגר לתוך צינור 15 מיליליטר עם פיפטה סרולוגית.

הימנעות מפירסינג האוגר עם קצה הפיפטה. גלולו את החיות על ידי centr במשך 30 שניות ב 1100 פעמים G, ולשאוף את supernatant. מוסיפים חמישה מיליליטר מתמיסת ההלבנה שזה עתה הוכנה לכדור התולעת, ובודקים את התולעים תחת מיקרוסקופ מנתח כל כמה דקות יחד עם רעידות נמרצות לסירוגין עד שכל גופי התולעת הבוגרים מומסים ורק ביצים נשארות בתערובת.

לאחר מכן, גלולו את הביצים על ידי סיבוב תערובת הלבנת הביצים למשך 30 שניות ב-1100 פעמים G ושאפו את תמיסת ההלבנה. לאחר מכן לשטוף את הביצים כדוריות על ידי הוספת עד 15 מיליליטר של תמיסת M9 ולהפוך את הצינור ארבע או חמש פעמים כדי לפזר את הביצים ואת הפתרון. שוב, צנטריפוגה את הצינור במשך 30 שניות ב 1100 פעמים G כדי לזרוק את הביצים ולשאוף את הפתרון M9.

בצע את הכביסה ארבע פעמים כדי לחסל כל אקונומיקה מתערובת הביצים. לאחר השטיפה הרביעית שואפים את תמיסת M9 מ 100 microliters עד שני מיליליטר בהתאם למספר הכולל של תולעים מולבן. נערו את הביצים ביסודיות כדי לפרק את הגושים ולוודא שהביצים עוברות החייאה מלאה בתמיסת M9.

לחלופין, בעלי חיים יכולים להיות L אחד נעצר עבור סנכרון זמני הדוק יותר על ידי הוספת 10 עד 12 מיליליטר של תמיסת M9 לכדור הביצה בצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. תנו לתולעים להסתובב ברוטטור עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להעריך את הביצה או L ריכוז אחד פיפטה ארבעה מיקרוליטר של תערובת הביצים על צלחת NGM יושב עם חיידקים.

לאחר מכן לספור ולחשב את הביצים הנוכחים לכל microliter של מדיה. חזור על הספירה שלוש או ארבע פעמים כדי לשפר את הקירוב, בהתבסס על צלחת הקירוב, את המספר המתאים של ביצים או L אחד נעצר בעלי חיים על צלחת אוגר NGM זרע עם חיידקים לפי בחירה. למדוד את התנהגות הקטר של התולעים באמצעות ת'ראש.

העבר מספר קטן של תולעים בוגרות ביום הראשון מצלחת אוגר NGM על 10 עד 20 מיקרוליטרים של תמיסת M9 תחת היקף ניתוח. לאחר מכן התמקדו בתולעת אחת בכל פעם וספרו את מספר הפעמים שהדגימה עוברת מהיווצרות קעורה לקמורה תוך 15 שניות. השתמש מונה יד טיימר ולחזור על ההליך עבור 10 עד 15 תולעים.

יישון התולעים לגיל הרצוי וחזרה על מדידות ת'ראש בכל הגילאים הרצויים. כפי שניתן לדמיין, תולעים מבוגרות יותר ת'ראש במהירויות נמוכות משמעותית. למדידות כמות ופוריות.

ב-10 עד 15 תולעי Caenorhabditis elegans, בודדו את L ארבע תולעים לצלחת אוגר NGM נפרדת שנזרעה עם חיידקים לפי בחירה. אפשרו לבעלי חיים לגדול בן לילה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס והבטיחו כי אצווה חדשה של צלחות שנזרעה מוכנה ליום המחרת. כדי למדוד את כמות הביצים שהוטלו על ידי Caenorhabditis elegans מעבירים את התולעים הבוגרות ללהב אוגר NGM טרי שנזרע עם החיידק שנבזז כל 12 עד 24 שעות במשך שבעה עד שמונה ימים או עד שהביצים כבר לא נראות לעין וסופרים את מספר הביצים המוטלות על הצלחות.

כדי למדוד את גודל הגזע של Caenorhabditis elegans העבירו את התולעים הבוגרות לצלחת אוגר NGM טרייה עם חיידקים כל 12 עד 24 שעות, או שבעה עד שמונה ימים או עד שהצאצאים כבר לא נראים לעין. שמור את כל הצלחות המכילות ביצים ב 20 מעלות צלזיוס. יומיים לאחר העברת תולעים.

סופרים את הצאצאים המפותחים על הצלחת. ספרו את כל התולעים החיות והמתפתחות בשלב L ארבע או מוקדם יותר כדי להבטיח שדור F Two לא יבלבל את התוצאות. הסר את כל התולעים מהצלחת בזמן שהן נספרות.

שמרו על הלוחות במשך יום-יומיים נוספים לפני שתבקיעו אותם שוב, כדי להבטיח שכל בעלי החיים עם עיכוב בבקיעה או בהתפתחות לא יפספסו. ההשפעה של שיטת העיקור על תוחלת החיים של נמטודות N2 מסוג בר הראתה ששינויים בתוחלת החיים של התולעים שגדלו על לוחות האוגר של NGM היו דומים לאלה של תולעים שגדלו על לוחות האוגר של NGM או של ארבע חיות מוטנטיות BN2 שגדלו על לוחות האוגר של NGM. החיה קצרת הימים HSF הראתה ירידה משמעותית בתוחלת החיים של כל התנאים.

ירידה משמעותית במספר הביצים המוטלות ובגודל הביצים נמצאה ב-HSF על פני חיות ביטוי בהשוואה לבקרות הסוג הפראי. חלק מבעלי החיים של HSF one over expression הפגינו סטריליות מלאה המצביעה על כך שבריאות הרבייה יכולה להיות בקורלציה הפוכה עם אריכות ימים. שיעור הת'ראש סיפק שיטה אמינה למדידת הבריאות במהלך ההזדקנות כפי שנמדדה על ידי ירידה משמעותית בת'ראש בבעלי חיים זקנים בהשוואה לצעירים.

הישרדות ללחץ הם מבחנים אמינים למדידת בריאות אורגניזמים, Tunicamycin אשר גורם ללחץ רשתית הביא לתוחלת חיים מופחתת ללא קשר לריכוז בהשוואה לבקרת DMSO. הרמות הגבוהות של paraquat קיצרו באופן משמעותי את תוחלת החיים בעוד שריכוזים נמוכים של paraquat הגדילו את תוחלת החיים עקב השפעה הורמטית. במבחני הסובלנות התרמו, ביטוי היתר של HSF אחד הגדיל את הסובלנות התרמומית ב-37 מעלות צלזיוס לכל ניסויי תוחלת החיים וההזדקנות.

חשוב לזכור כי טכניקות עיקור יכולות להיות בעלות השפעה פליאוטרופית על בריאות האורגניזם, אשר משפיעה על התוצאות. קיימות גישות רבות נוספות ומשלימות למדידת טווח הבריאות אם יש ציוד ותשתית זמינים, כולל מדידות של שעתוק, צבירת חלבונים בתרגום, אברון, מורפולוגיה ותפקודים מטבוליים.