Name: סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: למד שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב-Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מספק טכניקות פשוטות לסינכרון תולעים ומדידת השפעות ההזדקנות בנמטודות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

G.G. נתמך על ידי T32AG052374 ו- R.H.S. נתמך על ידי R00AG065200 מהמכון הלאומי להזדקנות. אנו מודים ל- CGC (במימון תוכנית תשתיות המחקר של משרד NIH P40 OD010440) על הזנים.

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כלכליים מתחרים.

תוחלת החיים, המוגדרת בפשטות כמשך החיים, היא תופעה בינארית ברורה ברוב האורגניזמים – או שאורגניזם חי או שאינו חי. עם זאת, אריכות ימים לא תמיד מתואמת עם בריאות האורגניזם. לדוגמה, מודלים של הורמזיס מיטוכונדריאלי שבו חשיפה ללחץ מיטוכונדריאלי מגדילה באופן דרמטי את תוחלת החיים הם בדרך כלל חלק מבעלי החיים בעלי תוחלת החיים הארוכה ביותר, אך מפגינים צמיחה מעוותת וירידה בתפקוד המטבולי37,54. באופן דומה, גם בעלי חיים עם תגובות עקה אנדופלסמיות אנדופלזמיות היפראקטיביות מפגינים התנהגויות ופנוטיפים מסוימים שניתן לתאם עם בריאות מופחתת, למרות שיש להם הומאוסטזיס חלבוני משופר באופן דרמטי ותוחלת חייםשל 36,49. לבסוף, פרדיגמות רבות של אריכות ימים באורגניזמי מודל, כולל תפקוד מוגבר של HSF-155, תפקוד XBP-1 מוגבר56, ואיתות FoxO שונה57 מתואמים כולם עם סיכון מוגבר לסרטן, ולא ניתן לערער על כך שתוחלת חיים ממושכת אינה מועילה אם אורגניזם נמצא במאבק מתמיד עם סרטן ומחלות בריאותיות אחרות. לכן, אריכות ימים אינה יכולה להיות מדידה עצמאית בביולוגיה של ההזדקנות.
לפיכך, הרעיון של healthspan היה תחום הולך וגדל בביולוגיה של ההזדקנות. תוחלת החיים, המוגדרת באופן רופף כתקופת החיים שאדם בריא, קשה יותר לברר מאשר אריכות ימים. עם זאת, בניגוד לאריכות ימים, המושג "בריאות" הוא מסובך, שכן ישנן קריאות רבות ושונות לבריאות האורגניזם: ברמה האורגניזמית, יש תפקוד שרירים / כוח, תפקוד עצבי / קוגניטיבי, בריאות הרבייה וכו '; ברמה התאית יש הומאוסטזיס של חלבונים, הומאוסטזיס שומנים, הומאוסטזיס של גלוקוז, חילוף חומרים וכו '. בשנת 2014, ביולוגים של הזדקנות אפיינו באופן סופי את סימני ההיכר הביולוגיים של ההזדקנות עם ההגדרה המובנית שזה חייב להיות משהו שמתפרק באופן טבעי במהלך ההזדקנות וניתן לשנותו בניסוי כך שהחמרה ניסיונית אמורה להאיץ את ההזדקנות והתערבות ניסיונית צריכה להאט את ההזדקנות. תשעת סימני ההיכר האלה של הזדקנות כוללים חוסר יציבות גנומית, התשה של טלומרים, שינויים אפיגנטיים, אובדן הומאוסטזיס של חלבונים (פרוטאוסטזיס), תשישות תאי גזע, איתות בין-תאי שונה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, חישה של חומרים מזינים שאינם מווסתים וסנסנציה תאית58. מאז, מחקרים רבים טוענים שיש לכלול גורמים אחרים, כולל חלבונים חוץ-תאיים ופיזיולוגיה מערכתית כמו חסינות ודלקת59. בסופו של דבר, ההגדרה המורכבת של תוחלת החיים מחייבת למדוד את בריאות האורגניזם בשיטות רבות ושונות.
לכן, בכתב יד זה, מוצגות שיטות מרובות למדידת היבטים שונים של תוחלת הבריאות באמצעות מודל הנמטודה, C. elegans. אנו בודקים את התנהגות התנועה באמצעות מבחני ת'ראש, בריאות הרבייה באמצעות ספירת ביציות וגודל גזע, ורגישות ללחץ. ואכן, התנהגות תנועתית היא שיטה סטנדרטית למדידת תוחלת החיים, שכן אורגניזמים מפגינים אובדן משמעותי של תנועתיות ותנועה במהלך הזדקנות51. ניתן לייחס את אובדן התנהגות התנועה לסימני היכר מרובים של הזדקנות, שכן תפקוד השרירים ב- C. elegans תלוי בפרוטאוסטזיס תקין60, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה61, ואיתות נוירון-שריר62. בעוד שכתב יד זה מתמקד במדידה אחת של התנהגות תנועתית, חשוב לציין כי קיימות שיטות רבות אחרות, כולל תנועתיות של בעלי חיים על לוח אגר מוצק, תגובה למגע51, ומבחני כימוטקסיס63. עם זאת, שיטות אלה דורשות בדרך כלל התקני הקלטה מתוחכמים יותר, שימוש בתוכנות מעקב אחר תולעים או שימוש בכימיקלים יקרים, מסוכנים או נדיפים, כל אלה עשויים להיות אסורים במסגרות מחקר מסוימות.
בנוסף, מבחנים לספירת ביציות וגודל גזע מוצגים כשיטה למדידת בריאות הרבייה וכשיטה הפשוטה ביותר למדידת חלוקת תאים בתולעים בוגרות, שכן תולעים בוגרות הן פוסט-מיטוטיות ורק תאי נבט ועוברים עוברים חלוקת תאים בתוך תולעת בוגרת64. כמדד לחלוקת התאים, בריאות הרבייה יכולה להיות רלוונטית לסימני ההיכר המזדקנים של סנסנציה תאית ותשישות תאיים. בריאות הרבייה יכולה להיות מושפעת מגורמים רבים, כולל זיהום פתוגני65 או חשיפה ללחץ49, אם כי אין קשר ישיר בין בריאות הרבייה לאריכות ימים. למעשה, כמה בעלי חיים בעלי חיים בעלי תוחלת חיים ארוכה מציגים ירידה משמעותית בגודל49 של גזע, וייתכן אפילו שקיים מתאם הפוך בין אריכות ימים לבין גודלbrood 50. זו אינה תופעה ספציפית ל-C. elegans, שכן השפעות מזיקות של רבייה על אריכות ימים נצפו זה מכבר בבני אדםבני 66, בכלבי לוויה67 ובעכברים68. ובכל זאת, אנו מספקים ספירת ביציות וגודל גזע כשיטה אמינה ובעלות נמוכה למדידת בריאות הרבייה עם האזהרה שבריאות הרבייה עשויה שלא להיות מתואמת עם אריכות ימים או תוחלת בריאות.
לבסוף, מבחני הישרדות מוצעים כמדד עקיף לבריאות האורגניזם. חשוב לציין שתגובות העקה התאית, כולל תגובה ללחץ תרמי69 ולחץ ER35, יורדות במהירות במהלך תהליך ההזדקנות ויש להן רלוונטיות ישירה לסימן ההיכר המזדקן של פרוטאוסטזיס70,71. לעומת זאת, תגובת עקה היפראקטיבית יכולה להאריך באופן משמעותי את תוחלת החיים על ידי קידום עמידות ללחץ 35,37,38. בעוד שמחקר זה מתמקד בשיטות הפשוטות ביותר ובעלות הנמוכה ביותר, קיימות מספר רב של שיטות חלופיות לבדיקות עמידות בפני עקה עבור תרמוטולרנס41 ועקה חמצונית66, שכל אחת מהן דורשת מערך שונה של ציוד וחומרים מתכלים. מעבר למחקרי חשיפה פשוטים לגורמי לחץ, ניתן לבצע שיטות פיזיולוגיות אחרות בהתאם לגישה לציוד. לדוגמה, מנתח שטף חוץ-תאי יכול לנטר את תפקוד המיטוכונדריה ואת הנשימה התאית73; מיקרוסקופי דיסקציה פלואורסצנטיים יאפשרו מדידות של כתבים שעתוק להפעלת תגובת לחץ20; ומיקרוסקופים מורכבים או קונפוקליים ברזולוציה גבוהה יכולים לשמש למדידת מורפולוגיה אברונית באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות למיטוכונדריה74, הרשתית האנדופלסמית 75,76, ואקטין ציטוסקלטון77.
כסיפור אזהרה אחרון למדידות של אריכות ימים, בעוד ששיטות כימיות וגנטיות לעיקור תולעים מוצעות כדי להפחית משמעותית את העלות, חשוב לציין כי שתיהן יכולות להשפיע ישירות על תוחלת החיים. לדוגמה, חשיפה ל-FUDR דווחה בעבר כמשפיעה הן על תוחלת החיים והן עלהתרמוטולרנס 45. ובעוד שלמוטציה glp-4(bn2) עצמה אין השפעות ישירות על תוחלת החיים, צמיחה ב-25 מעלות צלזיוס היא עקת חום קלה33,34 ולכן יכולה להשפיע על תוחלת החיים2. קיימות שיטות אחרות לעיקור C. elegans, כולל סטריליות בתיווך אוקסין78 או מוטנטים חלופיים רגישים לטמפרטורה של מחסור בזרע79. עם זאת, לכל השיטות יש כמה אזהרות, ויש להקפיד על שימוש בבדיקה הכי פחות מזיקה לצרכים המדעיים של כל מעבדה. מגבלה אחת אחרונה של מחקרי אריכות ימים היא שונות פוטנציאלית שיכולה להתרחש עקב גודל מדגם נמוך או פשוט על ידי טעות אובייקטיבית של החוקר. ניתן לעקוף זאת מכיוון שטכנולוגיות חדשות נולדות בטכנולוגיות אוטומטיות של תוחלת חיים80, אך שוב מערכות אלה יקרות ודורשות ציוד וכישורים הנדסיים וחישוביים מסוימים. בסופו של דבר, אוסף השיטות המסופקות כאן הוא סט אמין של כלים שניתן להתאים וללמוד במהירות כמעט בכל מוסד ולספק בסיס מוצק לביולוגיה של ההזדקנות.

מאז פרסום 'הגנטיקה של Caenorhabditis elegans', אחד המאמרים המשפיעים ביותר של סידני ברנר בשנת 1974, תולעת מיקרוסקופית זו נחשבה למערכת מודל יוצאת דופן לחקר תעלומות ביולוגיות1. בשנת 1977 פרסם מייקל ר. קלאס את השיטה למדידת תוחלת החיים של C. elegans והקים מערכת מודל זו כדי לחקור הזדקנות2. החקירה להבנת הקשר בין לחץ לאריכות ימים החלה בזיהוי מוטציה בודדת בגן age-1, שהביאה להארכת תוחלת החיים ב-C. elegans3. יתר על כן, מחקרים עכשוויים זיהו מוטציות אחרות שהולכות וגדלות בתוחלת החיים, שחשפו תולעים מוטנטיות בעלות תוחלת חיים ארוכה שמפגינות עמידות מוגברת ללחץשל 4,5,6. עם יתרונותיו הרבים, כולל תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה, גנום ברצף מלא המכיל הומולוגיה לכ-2 שלישים מכל הגנים הגורמים למחלות אנושיות, זמינות וקלות השימוש בספריות הפרעות RNA (RNAi), ודמיון פיזיולוגי עם בני אדם 7,8,9, C. elegans אומץ במהירות כמודל יוצא מן הכלל לביולוגיה של עקה והזדקנות.
אולי היתרונות הגדולים ביותר של C. elegans הם עלות התחזוקה הנמוכה ביותר שלה, קלות הניסויים ומגוון הכלים הגנטיים הזמינים למחקרים. C. elegans גדלים בדרך כלל על מדיום אגר מוצק עם מקור מזון E. coli. שני זני E. coli הנפוצים הם OP50 סטנדרטי, זן B שהוא אולי הנפוץ ביותר10, ו-HT115, זן K-12 המשמש בעיקר לניסויים של RNAi11,12. זן HT115 K-12 נושא מחיקה ב-RNAIII RNase, מוטציה החיונית לשיטות RNAi, שבהן נעשה שימוש בפלסמידים המבטאים dsRNA המתאימים לגנים בודדים של C. elegans. וקטורי ההזנה של dsRNA מאפשרים פגיעה חזקה בגנים של C. elegans ללא צורך בצלבים מורכבים או בעריכת גנום, מכיוון שחיידקים הנושאים את הפלסמידים האלה יכולים להיות מוזנים ישירות לנמטודות. אלפי וקטורי RNAi חיידקיים אלה קיימים ברקע HT115, כולל ספריית Vidal RNAi הפופולרית ביותר עם >19,000 מבני RNAi בודדים13 וספריית Ahringer RNAi עם 16,757 RNAi בונה14. עם זאת, לדיאטות החיידקים OP50 ו-HT115 יש הבדלים משמעותיים בפרופיל המטבולי, כולל הבדלים בוויטמין B1215,16. לכן, מומלץ לבצע את כל הניסויים על מקור חיידקי יחיד, במידת האפשר, כדי להימנע מאינטראקציות בין גנים לתזונה שעשויים להציג מספר גורמים מבלבלים כפי שתואר קודם לכן 17,18,19. בשל הקלות שלו, בעלי חיים נשמרים על OP50 עבור כל תנאי הניסוי המתוארים כאן, אבל כל הניסויים מבוצעים על HT115 כפי שתואר קודם לכן20. בקצרה, בעלי חיים נשמרים ב-OP50 ומועברים ל-HT115 לאחר הסנכרון (לאחר ההלבנה) לצורך עקביות בין ניסויי RNAi לעומת ניסויים שאינם RNAi. לחלופין, ניתן להשתמש בזן OP50 בעל יכולת RNAi הנושא מחיקה דומה של RNAIII RNase שנמצא בזן E. coli K12 HT115גם הוא 21.
אולי מגבלה מרכזית אחת לניסויי RNAi ב- C. elegans היא החשש מיעילות ההדחה. בעוד שניתן לאמת את יעילות ההדחה באמצעות qPCR או כתם מערבי, אלה דורשים ציוד וריאגנטים יקרים ומוגבלים לניתוח בתפזורת. זה אפילו יותר מדאיג בהסתכלות על תאים ספציפיים, כגון נוירונים, שהם עקשנים (פחות רגישים) ל-RNAi. בעוד שניתן לשפר את יעילות ה-RNAi בתאים ספציפיים באמצעות ביטוי יתר של SID-1, חלבון הטרנס-ממברנה החיוני לקליטת dsRNA22, זה עדיין מוגבל לדפוסי הביטוי הספציפיים לסוג התא של המקדמים המשמשים למבנים אלה, ולכן נוקאאוטים של גנים ומוטציות הם האמצעי המטופש ביותר לדלדול תפקודי גנים. מעבר להדחה בתיווך RNAi, C. elegans גם נוחים מאוד לעריכת גנום עם אסטרטגיות מבוססות קריספר 23,24,25 ובנייה מהונדסת ביטוי יתר באמצעות מיקרו-אינטגרציות, עם אפשרות לשלב מבנים מהונדסים באמצעות הקרנה או אינטגרציה מבוססת טרנספוזון 26,27,28,29 . עם זאת, שיטות אלה דורשות ציוד מיקרו-איניג'קציה יקר, והעלות הגבוהה של רנ"א מנחה או אנזים Cas9 עשויה לאסור שיטות אלה במוסדות עם מימון מוגבל. במקום זאת, אלפי קווים ומוטנטים מהונדסים זמינים בקלות תמורת דולרים בודדים הן במרכז הגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) והן בפרויקט הלאומי של Bioresource (NBRP). ה-NBRP מציע מוטנטים מבודדים עבור מספר רב של גנים של C. elegans, כולל זנים מוטנטיים שפורסמו ולכן אומתו, מוטנטים שמקורם בפרויקטי פיילוט ומוטנטים שטרם אופיינו. לעומת זאת, CGC הוא מאגר של קווי C. elegans שפורסמו והתבססו ברובם מקהילת המחקר. שניהם שולחים זנים ברחבי העולם במחירים סבירים מאוד ומציעים מגוון רחב של אפשרויות לבעלי יכולת מוגבלת לסנתז זנים בתוך החברה.
כאן מוצע אוסף שיטות, אשר צפויות להיות השיטות בעלות הנמוכה ביותר לבדיקת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב- C. elegans. כל השיטות המוצגות כאן דורשות ציוד ואספקה בעלות נמוכה, ומשתמשות רק בזנים הזמינים בקלות מה-CGC. אולי הדבר העיקרי למבחני אריכות ימים והישרדות ב- C. elegans הוא העלות של לוחות נמטודה צמיחה מדיה (NGM). מאחר ש-C. elegans הם הרמפרודיטים ומפרים את עצמם, מבחני הישרדות סטנדרטיים דורשים שבעלי חיים בוגרים יתרחקו ללא הרף מצאצאיהם כדי למנוע זיהום מצד הצאצאים. לא רק שתהליך זה גוזל זמן רב, הוא עלול להפוך ליקר בשל הצורך בכ-100 צלחות לכל תנאי כדי להפעיל מבחן תוחלת חיים יחיד. כאן מסופקות שתי חלופות: ניצול של המוטציה הרגישה לטמפרטורה ללא חיידקים, glp-4(bn2), או עיקור כימי באמצעות 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR). glp-4 מקודד סינתזת tRNA של valyl aminoacyl, וה-glp-4(bn2) הרגיש לטמפרטורה סובלים ממחסור רבייתי בטמפרטורות מגבילות עקב ירידה בתרגום חלבוניםשל 30,31. FUDR היא שיטה חזקה לעיקור כימי של C. elegans על ידי מניעת שכפול DNA, ובכך לעכב רבייה32. למרות ש-FUDR יכול להיות יקר מאוד עבור מעבדות מסוימות, נדרשת רק כמות קטנה כדי לעקר תולעים כימית, ויציבותו בצורת אבקה עשויה להפוך אותו לאפשרי עבור רוב הקבוצות. שימוש במוטציה glp-4(bn2) הרגישה לטמפרטורה היא ללא ספק האפשרות הזולה ביותר, שכן הדרישה היחידה היא אינקובטור להעברת בעלי החיים ל-25 מעלות צלזיוס המגבילות; עם זאת, יש לציין כי צמיחה ב 25 °C (76 °F) עלול לגרום ללחץ חום קל33,34. ללא קשר לשיטה, שימוש בבעלי חיים סטריליים יכול להפחית באופן משמעותי את העלויות של חומרים מתכלים הנדרשים לבדיקות הקשורות לגיל.
כדי לחקור את ההזדקנות, מבחני תוחלת החיים הסטנדרטית הם קונבנציונליים מכיוון שלפרדיגמות שמשנות את תוחלת החיים יש השפעות ישירות על ההזדקנות. עם זאת, מדידות של תוחלת בריאות ועמידות ללחץ מציגות מידע נוסף על בריאות האורגניזם. כאן, מספר שיטות מוצעות למדידת תוחלת הבריאות: 1) fecundity כמדד לבריאות הרבייה; 2) גודל גזע כמדד לבריאות התפתחותית וכדאיות של צאצאים מפוטרים; ו-3) התנהגות תנועתית כמדד לתפקוד השרירים ולתנועתיות, שניהם מתואמים ישירות עם הזדקנות. בנוסף, מוצעים מבחנים של עמידות לעקה: הישרדות לעקה במיון, עקה מיטוכונדריאלית/חמצונית והישרדות בעקה תרמית. ואכן, בעלי חיים עם עמידות מוגברת ללחץבמיון 35,36, עקה מיטוכונדריאלית37 ומתח תרמי38 מפגינים תוחלת חיים מוגברת. עקת ER מופעלת על ידי חשיפת C. elegans לטוניקמיצין, אשר חוסם את הגליקוזילציה המקושרת ל-N וגורמת להצטברות של חלבונים מקופלים בצורה שגויה39. עקה מיטוכונדריאלית/חמצונית נגרמת על ידי חשיפה לפראקוואט, מה שגורם להיווצרות סופראוקסיד במיוחד במיטוכונדריה40. עקת חום מוחלת באמצעות דגירה של בעלי חיים ב 34-37 °C33,41. ניתן לבצע את כל הבדיקות המתוארות כאן בציוד ובכספים מינימליים, ולהציע מגוון כלים לחקר ההזדקנות בקבוצות מגוונות.

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>עבור RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>עבור לוחות NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>עבור לוחות NGM</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>עבור לוחות NGM</td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>עבור RNAi</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>עבור צלחות NGM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>ממס לתרופות</td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>עבור LB</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>עבור צלחות NGM, M9</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>עבור מתח חמצוני / מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>עבור אקונומיקה soluton</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט dibasic</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>עבור לוחות NGM</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>עבור M9</td></tr><tr><td>S7E ניתוח היקף</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>מיקרוסקופ ניתוח סטנדרטי</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>עבור לוחות NGM, M9</td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>לתמיסת אקונומיקה</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>עבור M9</td></tr><tr><td>טטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>עבור RNAi</td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>עבור מתח ER</td></tr></tbody></table>

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

הגילוי וההתפתחות של Caenorhabditis elegans כאורגניזם מודל השפיעו על הביולוגיה, במיוחד בתחום ההזדקנות. מחקרים היסטוריים ועכשוויים רבים זיהו אלפי פרדיגמות משנות תוחלת חיים, כולל מוטציות גנטיות, ביטוי גנים מהונדס והורמסיס, חשיפה מועילה בדרגה נמוכה ללחץ. עם יתרונותיו הרבים, כולל תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה וזולה, וגנום ברצף מלא עם הומולוגיה לכמעט שני שלישים מכלל הגנים האנושיים, C. elegans אומץ במהירות כמודל יוצא מן הכלל לביולוגיה של סטרס והזדקנות. כאן, מספר שיטות סטנדרטיות נסקרו למדידת תוחלת חיים ותוחלת בריאות שניתן להתאים בקלות כמעט לכל סביבת מחקר, במיוחד אלה עם ציוד וכספים מוגבלים. התועלת המדהימה של C. elegans מוצגת, המדגישה את היכולת לבצע ניתוחים גנטיים רבי עוצמה בביולוגיה של ההזדקנות ללא צורך בתשתית נרחבת. לבסוף, המגבלות של כל ניתוח וגישות חלופיות נדונות לשיקול דעת.

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

פרוטוקול זה מציג את העלות הנמוכה ביותר ואת השיטות הטכנולוגיות הנמוכות ביותר לשירות הזדקנות באלגנס ים. אורגניזם מודל משפיע בביולוגיה של ההזדקנות. היתרון הגדול ביותר של שיטות אלה הוא קלות היישום, באמצעות ציוד בעלות נמוכה וחומר.הפיכתם למקובלים על כל חוקר ללא קשר לניסיון או למימון זמין. כמחקרי הזדקנות ותיקים יש שונות טבעית בבריאות בתוך אוכלוסיות. לכן, חיוני שהניסויים יבוצעו על בעלי חיים בריאים, מוזנים היטב ומסונכרנים היטב.כדי להבטיח נכות קרע התחל בהכנת מדיית גידול נמטודה של ליטר אחד או צלחת אוגר NGM. מוסיפים 2.5 גרם של טון פפ, 3.0 גרם של נתרן כלורי ו 20 גרם של אוגר לתוך בקבוק ליטר אחד עם מוט ערבוב ומוסיפים מים מזוקקים לנפח סופי של 970 מיליליטר. יש לחטא את תמיסת האוגר NGM בבקבוקון של ליטר אחד באמצעות אוטוקלאב סטנדרטי או מעקר מדיה.ולתת את הפתרון לערבב עד שהוא מתקרר ל 60 עד 75 מעלות צלזיוס. בזמן שהתמיסה מתקררת, מחממים אמבט חרוזים ל-65 עד 70 מעלות צלזיוס. לאחר שתמיסת האוגר NGM מתקררת ל-60 עד 75 מעלות צלזיוס.מוסיפים את התוספים הנוזליים ומאפשרים לתמיסה להתערבב לחלוטין במשך חמש דקות. לאחר מכן טבלו את הבקבוקון באמבט חרוזים בטמפרטורה של 65 עד 70 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהתקשורת להתמצק תוך כדי מזיגה לצלחת. פיפטה תשעה עד 11 מיליליטר של התמיסה לתוך כל צלחת 60 מיליליטר.בסיום, החזירו את הפיפטה לתמיסה המחוממת כדי לשמור על הטמפרטורה ולמנוע התמצקות של כל מדיה בפיפטה. חזור על התהליך עבור כל הצלחות ולאפשר NGM צלחת להתמצק בן לילה. לאחר שהתמצקו, השתמשו בהם לזריעה של צלחות עם חיידקים או אחסנו את הצלחות במיכלים אטומים למשך עד שלושה חודשים בארבע מעלות צלזיוס כדי לסנכרן את התולעים באמצעות הלבנה.אספו את הנמטודות על ידי שפיכת כמות קטנה של תמיסת M9 על צלחת המכילה את התולעים מבלי למלא את צלחת הפטרי יתר על המידה. לאחר מכן סובבו את תמיסת M nine בעדינות כדי לשחרר תולעים ממדשאות החיידקים. לאחר מכן, לאסוף תולעים gravid בוגר לתוך צינור 15 מיליליטר עם פיפטה סרולוגית.הימנעות מפירסינג האוגר עם קצה הפיפטה. גלולו את החיות על ידי centr במשך 30 שניות ב 1100 פעמים G, ולשאוף את supernatant. מוסיפים חמישה מיליליטר מתמיסת ההלבנה שזה עתה הוכנה לכדור התולעת, ובודקים את התולעים תחת מיקרוסקופ מנתח כל כמה דקות יחד עם רעידות נמרצות לסירוגין עד שכל גופי התולעת הבוגרים מומסים ורק ביצים נשארות בתערובת.לאחר מכן, גלולו את הביצים על ידי סיבוב תערובת הלבנת הביצים למשך 30 שניות ב-1100 פעמים G ושאפו את תמיסת ההלבנה. לאחר מכן לשטוף את הביצים כדוריות על ידי הוספת עד 15 מיליליטר של תמיסת M9 ולהפוך את הצינור ארבע או חמש פעמים כדי לפזר את הביצים ואת הפתרון. שוב, צנטריפוגה את הצינור במשך 30 שניות ב 1100 פעמים G כדי לזרוק את הביצים ולשאוף את הפתרון M9.בצע את הכביסה ארבע פעמים כדי לחסל כל אקונומיקה מתערובת הביצים. לאחר השטיפה הרביעית שואפים את תמיסת M9 מ 100 microliters עד שני מיליליטר בהתאם למספר הכולל של תולעים מולבן. נערו את הביצים ביסודיות כדי לפרק את הגושים ולוודא שהביצים עוברות החייאה מלאה בתמיסת M9.לחלופין, בעלי חיים יכולים להיות L אחד נעצר עבור סנכרון זמני הדוק יותר על ידי הוספת 10 עד 12 מיליליטר של תמיסת M9 לכדור הביצה בצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. תנו לתולעים להסתובב ברוטטור עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להעריך את הביצה או L ריכוז אחד פיפטה ארבעה מיקרוליטר של תערובת הביצים על צלחת NGM יושב עם חיידקים.לאחר מכן לספור ולחשב את הביצים הנוכחים לכל microliter של מדיה. חזור על הספירה שלוש או ארבע פעמים כדי לשפר את הקירוב, בהתבסס על צלחת הקירוב, את המספר המתאים של ביצים או L אחד נעצר בעלי חיים על צלחת אוגר NGM זרע עם חיידקים לפי בחירה. למדוד את התנהגות הקטר של התולעים באמצעות ת'ראש.העבר מספר קטן של תולעים בוגרות ביום הראשון מצלחת אוגר NGM על 10 עד 20 מיקרוליטרים של תמיסת M9 תחת היקף ניתוח. לאחר מכן התמקדו בתולעת אחת בכל פעם וספרו את מספר הפעמים שהדגימה עוברת מהיווצרות קעורה לקמורה תוך 15 שניות. השתמש מונה יד טיימר ולחזור על ההליך עבור 10 עד 15 תולעים.יישון התולעים לגיל הרצוי וחזרה על מדידות ת'ראש בכל הגילאים הרצויים. כפי שניתן לדמיין, תולעים מבוגרות יותר ת'ראש במהירויות נמוכות משמעותית. למדידות כמות ופוריות.ב-10 עד 15 תולעי Caenorhabditis elegans, בודדו את L ארבע תולעים לצלחת אוגר NGM נפרדת שנזרעה עם חיידקים לפי בחירה. אפשרו לבעלי חיים לגדול בן לילה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס והבטיחו כי אצווה חדשה של צלחות שנזרעה מוכנה ליום המחרת. כדי למדוד את כמות הביצים שהוטלו על ידי Caenorhabditis elegans מעבירים את התולעים הבוגרות ללהב אוגר NGM טרי שנזרע עם החיידק שנבזז כל 12 עד 24 שעות במשך שבעה עד שמונה ימים או עד שהביצים כבר לא נראות לעין וסופרים את מספר הביצים המוטלות על הצלחות.כדי למדוד את גודל הגזע של Caenorhabditis elegans העבירו את התולעים הבוגרות לצלחת אוגר NGM טרייה עם חיידקים כל 12 עד 24 שעות, או שבעה עד שמונה ימים או עד שהצאצאים כבר לא נראים לעין. שמור את כל הצלחות המכילות ביצים ב 20 מעלות צלזיוס. יומיים לאחר העברת תולעים.סופרים את הצאצאים המפותחים על הצלחת. ספרו את כל התולעים החיות והמתפתחות בשלב L ארבע או מוקדם יותר כדי להבטיח שדור F Two לא יבלבל את התוצאות. הסר את כל התולעים מהצלחת בזמן שהן נספרות.שמרו על הלוחות במשך יום-יומיים נוספים לפני שתבקיעו אותם שוב, כדי להבטיח שכל בעלי החיים עם עיכוב בבקיעה או בהתפתחות לא יפספסו. ההשפעה של שיטת העיקור על תוחלת החיים של נמטודות N2 מסוג בר הראתה ששינויים בתוחלת החיים של התולעים שגדלו על לוחות האוגר של NGM היו דומים לאלה של תולעים שגדלו על לוחות האוגר של NGM או של ארבע חיות מוטנטיות BN2 שגדלו על לוחות האוגר של NGM. החיה קצרת הימים HSF הראתה ירידה משמעותית בתוחלת החיים של כל התנאים.ירידה משמעותית במספר הביצים המוטלות ובגודל הביצים נמצאה ב-HSF על פני חיות ביטוי בהשוואה לבקרות הסוג הפראי. חלק מבעלי החיים של HSF one over expression הפגינו סטריליות מלאה המצביעה על כך שבריאות הרבייה יכולה להיות בקורלציה הפוכה עם אריכות ימים. שיעור הת'ראש סיפק שיטה אמינה למדידת הבריאות במהלך ההזדקנות כפי שנמדדה על ידי ירידה משמעותית בת'ראש בבעלי חיים זקנים בהשוואה לצעירים.הישרדות ללחץ הם מבחנים אמינים למדידת בריאות אורגניזמים, Tunicamycin אשר גורם ללחץ רשתית הביא לתוחלת חיים מופחתת ללא קשר לריכוז בהשוואה לבקרת DMSO. הרמות הגבוהות של paraquat קיצרו באופן משמעותי את תוחלת החיים בעוד שריכוזים נמוכים של paraquat הגדילו את תוחלת החיים עקב השפעה הורמטית. במבחני הסובלנות התרמו, ביטוי היתר של HSF אחד הגדיל את הסובלנות התרמומית ב-37 מעלות צלזיוס לכל ניסויי תוחלת החיים וההזדקנות.חשוב לזכור כי טכניקות עיקור יכולות להיות בעלות השפעה פליאוטרופית על בריאות האורגניזם, אשר משפיעה על התוצאות. קיימות גישות רבות נוספות ומשלימות למדידת טווח הבריאות אם יש ציוד ותשתית זמינים, כולל מדידות של שעתוק, צבירת חלבונים בתרגום, אברון, מורפולוגיה ותפקודים מטבוליים.

surveying-low-cost-methods-to-measure-lifespan-healthspan

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה...

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

סרטון זה מתאר שיטה מסורתית מבוססת לוחות למדידת תוחלת החיים של C. elegans. הפרוטוקול לדוגמה מודד את תוחלת החיים של תולעים שטופלו ב-RNAi.

ניתוח תוחלת חיים: מדידת אריכות ימים של C. elegans

כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול נמטודות בודדות מבודדות על מדיה מוצקה בהתקנים מרובי בארות מיקרו-מפוברקים. גישה זו מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך חייהם עבור מגוון פנוטיפים הקשורים להזדקנות ולבריאות, כולל פעילות, גודל וצורת גוף, גיאומטריה של תנועה והישרדות.

תרבית ארוכת טווח וניטור של Caenorhabditis elegans מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות

פלטפורמת ההדמיה "מכונת תוחלת החיים" הופכת את התצפית לכל החיים על אוכלוסיות גדולות לאוטומטית. אנו מראים את השלבים הנדרשים לביצוע בדיקות תוחלת חיים, עמידות ללחץ, פתוגנזה והזדקנות התנהגותית. איכות והיקף הנתונים מאפשרים לחוקרים לחקור התערבויות בהזדקנות למרות נוכחות שונות ביולוגית וסביבתית.

מבחני הזדקנות ותוחלת חיים התנהגותיים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות מכונת תוחלת החיים

אנו מתארים מורבידוסטט בעלות נמוכה וניתן להגדרה המאפשר לאפיין עמידות לתרופות אנטיביוטיות על ידי התאמה דינמית של ריכוז התרופה. ניתן לשלב את המכשיר עם פלטפורמה מיקרופלואידית מרובבת. ניתן להרחיב את הגישה למחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות.

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

למד שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב-Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מספק טכניקות פשוטות לסינכרון תולעים ומדידת השפעות ההזדקנות בנמטודות.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים