טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של דגימות קריו-EM ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגביר את הריכוז ולהקל על עיבוד התמונה. ניתן להגדיל את ריכוזי הדגימה לפני הכנת הרשת, וניתן להתאים את כתם הקליפה כך שיגרום לפיזור צפוף של דגימות חד-שכבתיות לאיסוף נתונים יעיל ביותר. כדי להתחיל, ערמו שתי חתיכות של נייר סינון נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר והניחו סרט פרפין ארוך בצמוד אליו כשהנייר פונה כלפי מעלה.

הניחו פיסת נייר סינון תת-מיקרוני על גבי שתי פיסות נוספות של נייר סינון. מקמו את המלקחיים נגד נימים כאשר הרגל הכפופה פונה כלפי מעלה והרגל הישרה פונה כלפי מטה ובחרו רשת של 600 רשתות עם הצד החלק או המבריק כלפי מעלה. מניחים את המלקחיים על צלחת פטרי או משטח מוגבה אחר כדי למנוע מגע של הרשת הנקייה עם פריטים אחרים.

מוציאים את הנייר מסרט הפרפין ומושכים את הצדדים ליצירת שפה קטנה. פיפטה שתי טיפות של 150 מיקרוליטר כך שתמיסת טרהלוז של 4% בערך סנטימטר עד שני סנטימטרים מצד קצר אחד של סרט הפרפין. שתי הטיפות צריכות להיות במרחק של כסנטימטר אחת זו מזו.

לאחר מכן, על ספסל נפרד או על הרצפה, לשפוך חנקן נוזלי לתוך מיכל קצף פוליסטירן קטן ומניחים מיכל רשת cryo-EM קטן בחנקן הנוזלי. כסו את מיכל קצף הפוליסטירן במגבונים נטולי מוך. כדי להציף את סרט הפחמן מהנציץ, השתמשו ב-Dumont 5 Ragps וגעו בצד אחד של הנציץ בזווית קלה כלפי מטה על אחת מטיפות תמיסת הטרהלוז.

הזיזו את הנציץ כלפי מטה כדי לאפשר למתח המים להתרומם מסרט הפחמן באיטיות. שחררו את הנציץ ברגע שסרט הפחמן צף על פני השטח של הטיפה. בדוק חזותית את סרט הפחמן כדי למנוע שימוש בפחמן עם נזק בצורה של שברים.

הכנס את הרשת המוחזקת על ידי מלקחיים אנטי נימים בזווית של 20-30 מעלות לתוך טיפת טרהלוז במיקום סמוך, ולאחר מכן מרכז את הרשת מתחת לסרט הפחמן. הרימו את סרט הפחמן, שמרו על הרשת באותו כיוון והורידו לאט את הרשת על פני השטח של טיפת הטרהלוז השנייה מבלי לשבור את מתח הפנים של הטיפה. פעולה זו תסיר סרט פחמן מיותר שאולי עטף את שפת הרשת לצד המחוספס.

סובבו את המלקחיים האנטי-נימים והניחו אותם על צלחת פטרי כשצד הפחמן של הרשת פונה כלפי מטה. פיפטה 1.3 מיקרוליטר של הדגימה לתוך מניסקוס טרהלוז קל על גבי הרשת. לאחר מכן, פיפטה את הפתרון כ 8-10 פעמים לערבב ולהפיץ את trehalose ואת הדגימה משני צידי הרשת.

פיפטה אחת או יותר 1.7 טיפות מיקרוליטר של תמיסת טרהלוז על סרט הפרפין תוך כדי דגירה של תמיסת הטרהלוז לדוגמה על הרשת למשך דקה אחת. סובבו את הרשת בחזרה למקומה המקורי כאשר סרט הפחמן פונה כלפי מעלה ולחצו את הרשת על נייר הסינון התת-מיקרוני באמצעות מלקחיים אנטי-נימיים. לאחר שהתמיסה נספגה על ידי נייר הסינון וסרט הפחמן שוכב שטוח, המתן שלוש שניות לפני הרמת הרשת והזזתה אנכית על טיפת 1.7 מיקרוליטר של תמיסת טרהלוז.

ניתן לחזור על שלבים אלה בין אחת לשלוש חזרות או יותר, בהתאם למדגם. הכתים את הרשת על שתי פיסות נייר הסינון ולאחר מכן הרם את הרשת מנייר הסינון. לאחר כ-13 שניות, בהתאם ללחות ולמאגר הדגימה, צללו את הרשת לתוך החנקן הנוזלי במיכל הקלקר הקטן והניחו אותו במיכל הרשת cryo-EM או העבירו אותו ישירות לסינון קריו-EM או לאיסוף נתונים.

דגימת גביש דו-ממדית של לויקוטרין C4 סינתאז אנושי הנתון לשיטת כתמי הקליפה מוצגת כאן. האזור שמשמאל לחץ צומצם במידה רבה לגבישים דו-ממדיים חד-שכבתיים באזור מגע בין סרט הפחמן לפס הרשת שהוכתם בקליפה ולאחר מכן הוזז. האזור שמימין לחץ לא הושפע מכתם הקליפה.

החצי התחתון של התמונה מייצג את האזורים עם דו-שכבתיות גדולות, בעיקר חד-שכבתיות של ליפידי פוספו, כתוצאה מיישום של כתם הקליפה. החצי העליון לא היה באזור מגע בין מוט הרשת לבין סרט הפחמן, ולכן הכיל ליפוזומים שלמים עם שני דו-שכבתיים פוספוליפידים. ריבוע הרשת של רשת של 400 רשתות שינוי מציג את טביעת הרגל של סרגל הרשת ואת האזורים המוכתמים בקילוף שהתקבלו כתוצאה מכך, כמו גם את האזורים שלא היו במגע עם סרגל רשת או שהיו נתונים לפחות איטרציות של כתמי קילוף.

תמונות אלה הראו את הכתם של רשת EM שהוכנה על ידי הזרקה אחורית על נייר סינון תת-מיקרוני באמצעות סרט פחמן דק מאוד. התמונות הן מסגרות בודדות במגע ראשוני עם הממברנה, 1, 000 אלפיות השנייה לאחר מגע, ו -2, 000 אלפיות השנייה לאחר מגע. החץ מציין ריבועי רשת שבהם לחץ נימי קרע את סרט הפחמן.

הימנעות משברים בסרט הפחמן ושילוב נייר סינון תת-מיקרוני עם טיפת טרהלוז של 1.7 מיקרוליטר ליניקה ולאחר מכן הפרדת השכבות הם שלבים מרכזיים. הדגימות המוכתמות בקליפה משמשות לאיסוף נתוני cryo-EM ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן לעיבוד תמונה לקביעת המבנה. כתם הקליפה מאפשר קביעה מובנית של גבישי חלבון דו-ממדיים חד-שכבתיים שהיו בעבר עבים מדי עבור cryo-EM.

יתר על כן, הוא יכול לרכז דגימות שונות לשכבות בודדות על סרט פחמן.