Name: ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למד הדמיה כרונית של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אינטראקציות תאיות ותפקידי מיקרוגליה בלמידה ובמחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ל- M. Kondo ו- M. Matsuzaki על שהשאילו לנו את העדשה האובייקטיבית XLPLN25XSVMP. עבודה זו נתמכה כספית מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) על ידי מענק סיוע לעמית מחקר JSPS (18J21331 לר.ק.) ומענקים בסיוע למחקר מדעי (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 ל- S.O.), מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (JP19gm1310003 ו- JP17gm5010003 ל- S.O.), ומסוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית על ידי Moonshot R& (JPMJMS2024 עד H.M).

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם למדיניות ועדת האתיקה של בעלי חיים והוועדה לבטיחות ניסויים רקומביננטיים גנטיים באוניברסיטת טוקיו. עכברי CX3CR1-GFP זכרים ונקבות, בני 2-4 חודשים, שימשו בניסויים. למען בטיחות הנסיינים ושמירה על תנאים סטריליים, כל ההליכים בוצעו עם חלוק לבן, מסכות וכפפות סטריליות. כל המכשירים עוקרו לפני השימוש.
1. הכנת מכשירים ובעלי חיים
<ol><li>הרכיבו צינור מתכת עם תחתית זכוכית (איור 1A).<ol><li>יש למרוח טיפה קטנה של דבק אופטי מרפא UV על קצה אחד של צינור אל-חלד בהתאמה אישית (קוטר חיצוני 3.0 מ"מ, קוטר פנימי 2.8 מ"מ, גובה 1.7 מ"מ). מורחים את הדבק על הקצה העגול של הצינור באופן אחיד. הערה: יש להשתמש בכמות מספקת של דבק כדי לכסות את כל קצה הצינור.</li>
		<li>הניחו מכסה זכוכית עגול (קוטר 3.0 מ"מ, עובי 0.15 ± 0.02 מ"מ) בקצה מכוסה הדבק של צינור המתכת, ולחצו קלות על המכסה כנגד הצינור כך שהרווח בין הצינור לזכוכית יתמלא בדבק. לאחר מכן, התאם את מיקום הזכוכית כך שיתאים לקצה החיצוני של צינור המתכת.</li>
		<li>הקרינו את הזכוכית באור UV למשך זמן מספיק כדי לרפא את הדבק. הערה: ודא שהזכוכית והצינור מחוברים לחלוטין. אם ההדבקה אינה מספקת, הזכוכית עלולה להתפרק לאחר הניתוח, וכתוצאה מכך הדמיה לא מוצלחת או דליפה של נוזל מוחי שדרתי (CSF).</li>
		<li>יש לחטא את צינור המתכת בתחתית הזכוכית המורכב באתנול 70% ולשטוף במי מלח סטריליים כדי להסיר לכלוך.</li>
	</ol></li>
	<li>לעקר את כל כלי הניתוח עם מעקר חום יבש.</li>
	<li>הכינו עכברים לניתוח של השתלת חלון. הערה: עכברים צריכים להיות בגיל המתאים. עדיף שהם מהונדסים גנטית לבטא חלבונים פלואורסצנטיים ב-CA1 ובפיתול המשונן (DG). נקודות אלה מוסברות עוד יותר בחלק הדיון.</li>
</ol>2. הרדמה וקיבוע ראש
<ol><li>מרדימים עכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של קטמין-קסילזין (100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין). ניהול meloxicam (2 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקה תת עורית עבור שיכוך כאבים לפני הניתוח. אשר את היעלמות התגובה לגירויים כואבים, כגון צביטת זנב כדי להבטיח עומק הרדמה נאות. יש להוסיף חצי מנה של קטמין-קסילזין בכל פעם שההרדמה פגה במהלך הניתוח, בדרך כלל שעה לאחר מתן התרופה הראשונית וכל 30 דקות לאחר מכן. השתמש כרית חימום מתחת לגוף כדי לספק תמיכה תרמית ולהחיל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה. הערה: בחירת ההרדמה לניתוח היא חיונית. נקודה זו נידונה בפירוט בחלק הדיון.</li>
	<li>יש למרוח קרם מסיר שיער מהקרקפת. לחטא את הקרקפת מספר פעמים בתנועה מעגלית עם קרצוף פובידון-יוד ואחריו אלכוהול. הניחו את העכבר על משטח הניתוח שהוכן עם כרית סטרילית אטומה למים ומרחו וילונות סטריליים כדי לאבטח את אתר הניתוח. לאחר מכן, לחתוך ולהסיר את הקרקפת באופן מעגלי עם אזמל, כך הקודקוד ואת העצמות העורפית חשופים במלואם בצד הניתוח.</li>
	<li>הסר את רקמת החיבור התת עורית על ידי שפשוף אותה עם צמר גפן תוך מריחת מלח סטרילי כדי לנקות את הדימום. מגרדים בעדינות את משטח הגולגולת עם סכין מיניאטורית עגולה כדי להסיר את periosteum, אשר מסייע לחזק את ההדבקה בין המלט לבין העצם (ראה שלב 2.6).</li>
	<li>יש למרוח חומר תחריט דנטלי על כל המשטח, להמתין עשרות שניות ולשטוף במי מלח סטריליים מספיקים.</li>
	<li>בעזרת דיו עמיד למים מסמנים את אזור העצם שיש להסיר (אזור עגול בקוטר 3.0 מ"מ, במרכזו כ-2.5 מ"מ אחורי וכ-2.5 מ"מ רוחבי לברגמה). לאחר הסימון, יבשו היטב את פני הגולגולת. הערה: המיקום של craniotomy תלוי בגודל של ההיפוקמפוס צריך להיות מותאם לגילאים שונים. אינדיקטורים שימושיים עבור המיקום של craniotomy יוצגו להלן (ראה שלב 3.4.5, הערה).</li>
	<li>חברו את פלטת האלומיניום המלבנית בעובי של 1.0 מ"מ ועם חור בקוטר 5.0 מ"מ במרכז לגולגולת באמצעות מלט שרף דנטלי בהתאם להוראות היצרן.<ol><li>יישרו בזהירות את החור במרכז הלוח עם האזור העגול המסומן בעט (ראו שלב 2.5) כך שלוח האלומיניום יהיה מקביל למשטח המסומן של הגולגולת (איור 1B). ודאו שהמלט אוטם היטב את כל הרווחים בין הצלחת לעצם. המתינו כ-5 דקות עד שהמלט יתקשה מספיק.</li>
	</ol></li>
	<li>הנח את העכבר על התקן אחיזת הראש באמצעות מתאמי זווית דרך הצלחת המצורפת.</li>
</ol>3. השתלת חלון התצפית
הערה: את ההליכים הכירורגיים הבאים יש לבצע תחת מיקרוסקופ סטריאו.
<ol><li>בצע חריץ עגול על הגולגולת באמצעות אגרוף עורי בקוטר של 3.0 מ"מ. ישר את החריץ המעגלי ואת האזור המסומן בעט בשלב 2.5. סובב את האגרוף העורי בלחץ עדין כך שעומק החריץ יגדל בהדרגה. בדוק לעתים קרובות שעומק החריץ קבוע על פני כל ההיקף.</li>
	<li>כאשר האגרוף העורי מגיע לשכבה הפנימית ביותר של הגולגולת, לפני שהוא נוגע בדורה שמתחתיו, הרימו בעדינות את אי העצם המרכזי באמצעות מחט 30 גרם. הערה: דליפת נוזל קלה מתחתית החריץ מעידה על כך שהחריץ קרוב לדורה.</li>
	<li>מוציאים את הדורה בעזרת בורר דורה. הערה: הסרה מלאה של הדורה בתוך חלון הגולגולת היא הכרחית ותחייב כריתה זהירה של שאריות הדורה בפריפריה באמצעות מלקחיים עדינים.</li>
	<li>שאפו בעדינות את הרקמה לחשוף את נאדית ההיפוקמפוס על ידי 23 G או 25 G מחטים קהות המחוברות לשואף. הערה: שלב זה הוא הקריטי ביותר להדמיה מוצלחת. נקודות טכניות מרכזיות לשאיפת הרקמה מתוארות בפירוט בחלק הדיון.<ol><li>שאפו את הפיה, ואת כלי הפיאל.</li>
		<li>שאפו את רקמת קליפת המוח מפני השטח. שמור על עומק פני הרקמה החשופים הומוגני על פני כל חלון הגולגולת. בהדרגה להעמיק את השאיפה עד סיבים של הקפסולה החיצונית נחשפים.</li>
		<li>מקם בזהירות את קצה היניקה לקפסולה החיצונית ליד החדר הצידי (LV) הממוקם בקצה הרוסטרולטרלי של חלון הגולגולת. הסר את שכבת פני השטח של הקפסולה החיצונית הפועלת בכיוון הקואודומדיאלי לכיוון רוסטרולטרלי, ולאחר מכן את השכבה הפנימית הפועלת בכיוון הבינוני. הערה: ניתן להסיר בקלות את הקפסולה החיצונית ליד ה-LV מהמבנה הבסיסי.</li>
		<li>אשר את הסרת הקפסולה החיצונית כולה על ידי בדיקת החשיפה המלאה של פני השטח של הנאדית ואת commissure ההיפוקמפוס הגבי (DHC). הערה: ה-DHC מכסה את החלק הקודומדיאלי של ה-CA1. ניתן להבדיל בין הנאדיות וה- DHC לבין הקפסולה החיצונית על ידי כיווני הסיבים שלהם. כלומר, הסיבים בתוך הנאדית וה- DHC רצים בכיוון הרוסטרומדיאלי לקוודולטרלי, וניתן להבדיל בינם לבין הסיבים בקפסולה החיצונית. הנאדיות וה-DHC מחוברים היטב ל-CA1 ואין לפגוע בהם. יש להסיר את כל שברי הקפסולה החיצונית, שכן כל השברים הנותרים ימנעו מגע ישיר של כיסוי הזכוכית לנאדיות.</li>
		<li>ודא שהדימום נפסק ביסודיות ומלא את החור במי מלח סטריליים עד לגובה פני הגולגולת. הערה: שדה הראייה כאן עוזר לשפוט אם החור נמצא במיקום המתאים לגיל הספציפי של העכבר. באופן אידיאלי, alveus ואת CA1 הבסיסית צריך לתפוס את רוב האזור המרכזי. חלק מה-DHC נראה באזור הקודומדיאלי. ניתן לזהות את הפתח של LV בקצה הרוסטרולטרלי (איור 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנס את צינור המתכת בתחתית הזכוכית (ראה שלב 1.1) אנכית לתוך החור תוך שאיפת עודפי המים שעולים על גדותיהם מצידי הצינור עד שתחתית הזכוכית לוחצת קלות על הנאדית ומשטחת חלקית את CA1 שמתחתיה. הערה: לחץ זה צריך להיות מותאם כראוי. אם הוא חזק מדי, ה-CA1 יינזק. אם הוא חלש מדי, הסטייה הכדורית עקב העקמומיות של CA1 תפגע ברזולוציית ההדמיה במבנים עמוקים.</li>
	<li>בעזרת צמנט שרף דנטלי, קבעו את דופן הצינור המוחדר לגולגולת שמסביב (איור 1C). ודא כי ההיקף כולו אטום היטב וכי אין דליפה של אוויר או CSF. המתינו כ-5 דקות עד שהמלט יתקשה. הערה: אם הצמנט ממוקם כאשר צמיגותו נמוכה, הוא עלול לדלוף לתוך פרנכימה במוח דרך הרווח בין הצינור לגולגולת ולפגוע במוח. לכן, יש ליישם את המלט לאחר התחלת פילמור, מה שמגביר את הצמיגות ומקטין את הדליפה דרך הפער.</li>
	<li>שטפו את הצלחת כולה, את הגולגולת ואת החלק הפנימי של הצינור במי מלח סטריליים כדי להסיר לכלוך.</li>
</ol>4. מיקרוסקופ שני פוטונים מיד לאחר הניתוח לבדיקת איכות הניתוח
<ol><li>מקם את העכבר במכשיר אחיזת הראש מתחת לעדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ הדו-פוטוני ובשלב סריקת XY הממונעת. השתמש בכרית חימום לתמיכה תרמית. נטר וכוונן את עומק ההרדמה כמתואר בשלב 2.1, מכיוון שבדיקת איכות זו עשויה להימשך עד 30 דקות. הערה: עדשה אובייקטיבית עם טבילה במים עם מרחק עבודה (WD) ארוך מ-3 מ"מ וצמצם מספרי גבוה (NA) מומלצת. קולר תיקון של עדשת האובייקט יכול לשפר את הרזולוציה על ידי פיצוי על חוסר התאמה של אינדקס השבירה בין הזכוכית לבין הביו-חומרים.</li>
	<li>מלאו את החלל שבין הזכוכית לעדשה האובייקטיבית במים, תוך הקפדה מיוחדת על מניעת בועות אוויר. במידת הצורך, הרחיבו את שטח לוח המתכת באמצעות סרט פלסטיק, המחזיק יותר מים, כדי לכסות את כל העדשה הקדמית של המטרה.</li>
	<li>הפעל לייזר פועם פמטו-שנייה באורך גל של 920 ננומטר לעירור הגשושיות הפלואורסצנטיות המתבטאות במוח והפעל תוכנה לרכישת תמונה.</li>
	<li>כוונן את המיקוד ל- CA1 באמצעות השלב הממונע ומערכת המיקוד הממונעת. מקם את מבנה המטרה בהנחיית הפלואורסצנטיות הנפלטת מהפרנכימה במוח והאור המוחזר מקצה צינור המתכת תחת הארה רציפה על ידי הלייזר הפועם.</li>
	<li>מדוד את מעמקי פרנכימת המוח הנוגעת בתחתית הזכוכית על ידי התאמת המיקוד למערכת המיקוד הממונעת. השווה את העומקים במיקומים אופקיים שונים כדי לשפוט את היישור של תחתית הזכוכית ומישור ההדמיה.<ol><li>כוונן את זווית ראש העכבר על-ידי הטיית התקן אחיזת הראש עד שתחתית הזכוכית תוגדר להיות מקבילה למישור ההדמיה.</li>
	</ol></li>
	<li>התאם את צווארון התיקון של המטרה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר בעומק מבנה היעד ב- CA1.</li>
	<li>אשרו כי התאים הפלואורסצנטיים בשכבה המולקולרית (ML) של הלהב העליון DG בעומק של 500 מיקרומטר מתחתית הזכוכית ניתנים להדמיה בשדה הראייה כולו. הערה: שלב זה חשוב בשיפוט איכות הניתוח. אם CA1 ניזוק, בצקת מוחית מוקדית מונעת זיהוי פלואורסצנטי בעומק של יותר מ -200 מיקרומטר מפני השטח. רק כאשר אין נזק ל-CA1, והעקמומיות של שכבות CA1 משוטחת כראוי על-ידי הכיסוי שמעליה, ניתן לזהות את אותות ה-DG מיד לאחר הניתוח (איור 2A-D). סעיף התוצאות המייצגות מספק דרך פשוטה לקבוע את הגבול בין CA1 לבין DG.</li>
</ol>5. טיפול לאחר הניתוח
<ol><li>שאפו את המים בתוך הצינור וכסו אותם באטם פלסטיק כדי למנוע כניסת פסולת.</li>
	<li>שמור על העכבר חם והמתן להחלמה מההרדמה.</li>
	<li>מתן meloxicam (2 מ"ג / ק"ג) תת עורית כל 24 שעות כל עוד העכבר מפגין התנהגות הקשורה לכאב.</li>
	<li>הרם את העכבר לאחר הניתוח בדיור בודד במשך מספר שבועות.</li>
</ol>6. In vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של מיקרוגליה באמצעות עכברי CX3CR1-GFP
<ol><li>לאחר השראת הרדמה, לשטוף את החלק הפנימי של צינור המתכת עם מלוחים סטריליים כדי להסיר פסולת. ודאו שנאדית ההיפוקמפוס הלבנה נראית דרך הזכוכית (איור 3A), ושאין סיבוכים כמו דימום לאחר ניתוח.</li>
	<li>הגדר את העכבר מתחת למיקרוסקופ בעל שני פוטונים לפי שלבים 4.1 עד 4.6.</li>
	<li>בדקו את האיכות והעוצמה של תמונות המתקבלות על-ידי עירור של שני פוטונים בהיפוקמפוס (איור 3B). ודא שהתמונות שצולמו לאחר הפחתת בצקת לאחר הניתוח דומות או טובות יותר מאלה שצולמו ביום הניתוח (איור 2A, ראה שלב 4.5). הערה: הידרדרות התמונה מצביעה על נוכחות של נזק לרקמות בתוך המוח.</li>
	<li>ודאו שתאי מיקרוגליה כבר שחזרו את המורפולוגיה המסועפת שלהם (איור 3C). הערה: נתוני ההדמיה של מיקרוגליה מצביעים על כך שנדרשים לפחות 3-4 שבועות כדי שתאי מיקרוגליה יחזרו למצבם הבסיסי.</li>
	<li>בצע הדמיה in vivo בכל שכבות של CA1 למטרה מסוימת של הניסוי.</li>
</ol>

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).</li>
<li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27(2011).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527(2010).</li>
<li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540(2016).</li>
<li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088(2018).</li>
<li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li>
<li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li>
<li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li>
<li>Böttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li>
<li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li>
<li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li>
<li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li>
<li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li>
<li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li>
<li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li>
<li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li>
<li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
</ol>

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים.

שיטה זו מכילה הליכים כירורגיים מורכבים, אך היא יכולה לספק תמונות ברזולוציה גבוהה על פני CA1 כולו לתקופה ממושכת אם מכינים אותה כראוי. ניסויים עם מספר עכברים אישרו כי איכות התמונה בשלב הכרוני שלאחר הניתוח טובה יותר מזו של הדמיה חריפה לאחר הניתוח. איכות התמונה הטובה יותר נשמרה במשך יותר מחודשיים. הגורם השכיח ביותר לכישלון הוא נזק לא מכוון ל- CA1 במהלך הניתוח, אשר מזוהה בבדיקת האיכות שלאחר הניתוח (ראה שלב 4). זה יכול להיות בגלל פגיעה ישירה על ידי שאיפה, ייבוש של המוח, לחץ מוגזם על ידי הזכוכית, או רעילות מן מלט השיניים בשלב האחרון. סיבה נוספת לכישלון היא דימום לאחר הניתוח, אשר ניתן לאשר דרך החלון התחתון זכוכית בתוך 1 שבוע לאחר הניתוח (ראה שלב 6.1). קרא את הפרוטוקול בקפידה ונקוט בכל אמצעי הזהירות כדי למנוע צרות כאלה.
אפילו עם ההתקנה הנוכחית של מיקרוסקופ שני פוטונים עם גלאי GaAsP במעבדה, הניסיון לצלם את CA1 הגבי דרך קליפת המוח גורם לאובדן משמעותי של רזולוציה עקב פיזור האור הלא זניח. לכן, כדי לקבל רזולוציה מספקת כדי לצפות בתנועה של תהליכים מיקרוגליאליים או היווצרות של קוצים דנדריטיים של נוירונים ב- CA1, הסרת חלק מקליפת המוח שמעל היא בלתי נמנעת, כמו בשיטה הנוכחית. הדרך החלופית היחידה להפחית את היקף הסרת קליפת המוח תוך שמירה על רזולוציית תמונה גבוהה היא להטביע עדשת ממסר, כגון עדשת אינדקס שבירה הדרגתי (GRIN). בגישה זו, עדשת GRIN הונחה בתוך צינור מנחה שהושתל ישירות מעל CA1 עבור הדמיה כרוניתCA1 28,29. הקוטר החיצוני של צינור ההנחיה היה 1.8 מ"מ, שהוא קטן יותר מ-3.0 מ"מ של המכשיר בנייר זה, תוך הפקת רזולוציה גבוהה (NA; 0.82) דומה למערכת כאן (אפקטיבית NA; 0.88). עם זאת, לגישה המשתמשת בעדשת GRIN יש שדה ראייה צר לתצפית ברזולוציה גבוהה ועומק הדמיה קצר המוגבל על ידי WD של עדשת GRIN. לכן, הדמיה של כל שכבות ההיפוקמפוס בשדה ראייה רחב ברזולוציה גבוהה היא יתרון ספציפי של השיטה במאמר זה.
מגבלה של הליך זה היא כי הסרה חלקית של קליפת המוח ודלקת עלולה להיות כמה השפעות מזיקות על ההיפוקמפוס. אולם מאחר שלקליפת המוח שהוסרה אין קלט ישיר להיפוקמפוס, קליפת המוח האנטורינלית אינה ניזוקה, וההיפוקמפוס עצמו אינו נפגע ישירות, ההערכה הכוללת היא שהליקוי התפקודי של ההיפוקמפוס אינו משמעותי. מספר מחקרים קודמים אישרו כי תפקודי ההיפוקמפוס, כולל למידה וזיכרון, נשמרים לאחר השתלת חלון ההיפוקמפוס 25,26,27,30,31,32,33,34. לכן, גישת ההדמיה המתוארת כאן צפויה לדווח נאמנה על תפקודי ההיפוקמפוס לאחר תקופה מספקת לאחר הניתוח.
כיוונים עתידיים של נבדקי מחקר המבוססים על טכניקת הדמיה זו עשויים לכלול גיזום סינפטי שזוהה על ידי הדמיה סימולטנית של מיקרוגליה ונוירונים5, אינטראקציה מיקרוגליאלית הקשורה ללמידה עם סינפסות35, תנועתיות מיקרוגליאה המווסתת על ידי הפעילות העצבית של ההיפוקמפוס36, ותגובות מיקרוגליה לדלקת היקפית או נזק לרקמות7. שיטה זו תסייע גם להבהיר את ההתקדמות של מחלות נוירודגנרטיביות. לדוגמה, במחלת אלצהיימר (AD), חלבוני β עמילואיד וטאו מצטברים במקביל למוות תאי עצב וניוון בהיפוקמפוס, מה שמוביל לתפקוד קוגניטיבי לקוי; דווח כי מיקרוגליה מעורבת בתהליך זה37,38. הדמיה כרונית In vivo של תאי מיקרוגליה ותאי עצב באמצעות מודלים של עכברי אלצהיימר תאפשר לנו לעקוב אחר המתאם בין תפקודי מיקרוגליאה ופתולוגיה עצבית בהיפוקמפוס של מודלים של עכברי אלצהיימר.
מאמר זה מתמקד בדימות מיקרוגליאלי, אך אותו הליך הדמיה ישים לסוגים אחרים של תאי עצב וגליה ב-CA1. בנוסף, הפרוטוקול מוגבל לדימות של עכברים מורדמים, אך ניתן להרחיב את הטכניקה גם לניטור מיקרוגליה בהיפוקמפוס בעכברים ערים. תוצרי התנועה הנגרמים על ידי נשימה, פעימות לב ותנועות גוף, במיוחד בשכבות ההיפוקמפוס העמוקות הרחק מחלון הזכוכית, עשויים להתקיים בניסויים עם עכברים ערים. לכן, ייתכן שתידרש מערכת מתאימה לתיקון תנועה כדי ללכוד מורפולוגיה ודינמיקה של מיקרוגליה.
דיון הקשור לפרוטוקול מומלץ לבחור עכברים בגיל המתאים ושינויים גנטיים לביטוי של בדיקות פלואורסצנטיות עם ספציפיות זמנית ומרחבית (ראה שלב 1.3). עכברים בגיל חודש יכולים לשמש לניסויים, אך עכברים מעל גיל חודשיים קלים יותר לטיפול, עם גודל גופם הגדול יותר ועמידותם בפני לחץ כירורגי. בנוסף, הקפסולה החיצונית ואת alveus של ההיפוקמפוס קשה יותר להפריד בעכברים צעירים. לכן, הסרת הקפסולה החיצונית בעכברים צעירים דורשת מיומנויות כירורגיות (ראה שלבים 3.4.3-4). הערכת הניתוח וההדמיה שלאחריו תהיה פשוטה יותר כאשר עכברים יביעו חלבונים פלואורסצנטיים באופן שכפל ואחיד ב-CA1 וב-DG (ראה שלב 4.7). לפיכך, בניסויים הראשונים של הניתוח, מומלץ להשתמש בעכברים טרנסגניים עם נוירונים מסומנים בדלילות, כגון עכברי Thy1-YFP או Thy1-GFP39, או עכברים עם מיקרוגליה מסומנת, כגון עכברי CX3CR1-GFP24.
עבור ניתוח מוצלח, הבחירה של הרדמה חשובה (ראה שלב 2.1). סוגים שונים של הרדמה עלולים לגרום לדרגות שונות של בצקת מוחית תוך ניתוחית, המשפיעות על רמת הקושי של הניתוח, על המיקום היחסי של צינור המתכת המושתל ועל מידת דחיסת המוח על ידי חלון הזכוכית. גורמים אלה עשויים גם להשפיע על הישרדותם של נוירונים בהיפוקמפוס לאחר הניתוח.
בתהליך השאיפה לחשוף את ההיפוקמפוס (ראה שלב 3.4), יש לציין את הנקודות הבאות כדי למזער את הנזק למוח ולהבטיח הדמיה מוצלחת. כל הזמן לספק מלוחים סטריליים על פני הרקמה על ידי מיקום שקע בצד של חלון הגולגולת. יש למנוע חשיפה של פני הרקמה לאוויר במהלך השאיפה. העיקרון הבסיסי של שאיפת הרקמה הוא הסרת פני הרקמה על ידי זרימת נוזל לתוך קצה היניקה. יש להימנע ממגע ישיר של קצה היניקה לרקמה. התאם את הלחץ השלילי המופעל על צינור היניקה למינימום. שאפו את הרקמה צעד אחר צעד ואשרו כי הדימום נשלט בכל שלב. כאשר הדימום ממושך, יש להמתין עד שהדימום ייפסק באופן ספונטני. יש לשמור על השאיפה ממרחק קצר ממקום הדימום עם זרימה מתמדת של מי מלח סטריליים. שאפו את הרקמה ליצירת חלל גלילי שגודלו מתאים לצינור המתכת בתחתית הזכוכית (ראו שלב 1.1). בחר 23 G מחטים כדי לשאוף כלי pial עבים או שברי רקמות גדולים ומחטים 25 G כדי למצוץ פסולת רקמות קטנות.

תאי מיקרוגליה הם תאי החיסון ומקרופאגים רקמתיים היחידים השוכנים במוח. בנוסף לתפקודם כתאי חיסון, כגון תגובה מהירה לדלקת, הוכח שהם ממלאים מגוון תפקידים פיזיולוגיים בתחזוקה ועיצוב מחדש של מעגלים עצביים, כגון גיזום סינפטי, ויסות פלסטיות סינפטית, ובקרה על פעילות עצבית 1,2,3,4,5 . אינטראקציות פיזיולוגיות בין תאי מיקרוגליה ונוירונים מעוררות עניין גובר הן בהתפתחות מעגלים עצביים והן בנוירוביולוגיה של מחלות. ניתוח הפיזיולוגיה של מיקרוגליה in vivo דורש שיטות לצפייה במיקרוגליה ללא נזק לרקמות ותגובות דלקתיות. עם זאת, תאי מיקרוגליה רגישים לדלקת ומשנים באופן דרמטי את צורתם ותפקודם בתגובה לנזק לרקמות 6,7.
הדמיית שני פוטונים in vivo היא כלי אידיאלי ללכידת הדינמיקה הפיזיולוגית של מיקרוגליה8. יישומים ראשוניים של דימות in vivo של שני פוטונים חשפו את התנועה הדינמית של תהליכים מיקרוגליאליים למעקב סביבתי בקליפת המוח של עכבר בוגר 9,10. מחקרי ההדמיה הבאים של שני פוטונים הרחיבו עוד יותר את ניטור in vivo של מיקרוגליה לניתוח אינטראקציות תפקודיות ומבניות עם נוירונים 5,11,12,13,14. עם זאת, עומק ההדמיה של מיקרוסקופ שני פוטונים קונבנציונאלי הוגבל לפחות מ -1 מ"מ מפני השטח של המוח15,16. אילוץ זה מסביר את המחסור במחקרים קודמים שדיווחו על התנהגות תאי מיקרוגליה באזורי מוח עמוקים, כמו ההיפוקמפוס.
מחקרי ריצוף RNA שנערכו לאחרונה חשפו הטרוגניות אזורית ניכרת של מיקרוגליה, מה שהעלה את האפשרות לתפקידים תפקודיים מובהקים 17,18,19,20,21. לכן, יש צורך להקליט אינטראקציות מיקרוגליאה עם נוירונים באזורים שונים במוח, אבל קשיים טכניים הקשו על מחקרים כאלה. בפרט, מעורבות פעילה של מיקרוגליאה בעיצוב מחדש של סינפסות דווחה כקריטית בהתפתחות הרשת העצבית של ההיפוקמפוס ותפקודיה הקשורים לזיכרון22,23. עם זאת, שיטות יעילות להתבוננות במיקרוגליה בהיפוקמפוס in vivo ללא עוררין לא היו זמינות.
פרוטוקול זה מסביר את ההליכים לתצפית כרונית in vivo של מיקרוגליה במנוחה ב- CA1 של ההיפוקמפוס הגבי באמצעות טכניקות כירורגיות מבוקרות במדויק. הדמיה דו-פוטונית של אזור CA1 בעכברי CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), אשר מבטאת GFP במיקרוגליה24, אפשרה תצפית על תאי המיקרוגליה המסועפים בכל שכבות ה-CA1 ברזולוציה מספקת. הפרוטוקול כולל מספר טיפים להשתלה מוצלחת של חלון התצפית ותנאי הדמיה מתאימים. בנוסף, הדמיה בו זמנית של נוירונים פירמידליים מיקרוגליה ב CA1 מוצג כדוגמה יישום. היתרונות, המגבלות והפוטנציאלים של טכניקה זו נדונים גם הם.

<table><tbody><tr><td>23 גרם מחטים קהות</td><td>NIPRO</td><td>02-166</td><td>קצות יניקה לשאיפה.</td></tr><tr><td>25 גרם מחטים קהות</td><td>NIPRO</td><td>02-167</td><td>קצות יניקה לשאיפה.</td></tr><tr><td>אגרופים עוריים 3 מ"מ (DermaPunch)</td><td>Maruho</td><td>213001610</td><td>כלים לקרניוטומיה.</td></tr><tr><td>30 גרם מחטים</td><td>Dentronics</td><td>מחט חד פעמית מס' 30</td><td>כלים לקרניוטומיה.</td></tr><tr><td>לייזר פועם פמטו-שנייה</td><td>ספקטרה-פיזיקה</td><td>MaiTai Deep See</td><td>A Ti: לייזר ספיר המשמש באורך גל של 920 ננומטר.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td>מיקרוסקופ להדמיית CA1.</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV לתיוג עצבי.</td></tr><tr><td>AAV1-hSyn-Cre</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV לתיוג עצבי.</td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית להדמיה דו-פוטונית</td><td>אולימפוס</td><td>XLPLN25XSVMP</td><td>25& אובייקטיבי עם מרחק עבודה ארוך, צמצם מספרי גבוה וצווארון תיקון</td></tr><tr><td>שואבים</td><td>Shin-ei Industries</td><td>KS-500</td><td>כלים לשאיפה.</td></tr><tr><td>לוחות אלומיניום</td><td>Narishige</td><td>CP-1</td><td>לוחות עשויים אלמינום לקיבוע ראש.</td></tr><tr><td>קרם אפילציה כימי</td><td>YANAGIYA</td><td></td><td>קרם להסרת שיער סביב מקום הניתוח.</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית עגולים</td><td>Matsunami Glass</td><td>3&phi; מס' 1</td><td>כיסויים מודבקים לצינורות נירוסטה.</td></tr><tr><td>עכברי CX3CR1-GFP</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>008451</td><td>עכברים טרנסגניים להדמיית מיקרוגליה.</td></tr><tr><td>צינורות נירוסטה גליליים</td><td>MORISHITA</td> צינורות מתכת <td>בהתאמה אישית</td><td>להשתלה. קוטר חיצוני 3.0 מ"מ, קוטר פנימי 2.8 מ"מ, גובה 1.7 מ"מ.</td></tr><tr><td>חומר תחריט שיניים</td><td>Sun Medical</td><td>204610461</td><td>משמש לחריטת עצמות הגולגולת.</td></tr><tr><td>צמנט שרף דנטלי (Super-Bond C& ב)</td> <td>סאן מדיקל</td><td>204610555</td><td>צמנט דנטלי.</td></tr><tr><td>קוטפי Dura (מיקרו נקודות)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10063-15</td><td>כלים להסרת דורה.</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים (Dumont #5)</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11252-20</td><td>כלים כירורגיים.</td></tr><tr><td>מרכז המחקר הביולוגי</td> <td>של מלקחיים</td><td>PRI13-3374</td><td>משמש לחיטוי אתר הניתוח.</td></tr><tr><td>מכשיר החזקת ראש</td><td>Narishige</td><td>MAG-2</td><td>מכשיר החזקת הראש של עכברים עם מכווני זווית</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>מרכז המחקר הביולוגי</td><td>BWT-100A ו-HB-10</td><td>כלים למתן תמיכה תרמית לעכבר במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>ALA Scientific</td><td>HEATINGPAD-1 ו-Hot-1</td><td>Tools כדי לספק תמיכה תרמית לעכבר בהתקן החזקת הראש.</td></tr><tr><td>קטמין (קטלר)</td><td>Daiichi Sankyo Company</td><td>S9-001665</td><td>הרדמה במהלך ניתוח.</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td>משככי כאבים במהלך ניתוח.</td></tr><tr><td>משחה עיניים</td><td>Sato Pharmaceutical</td><td></td><td>משמש למניעת יובש בעיניים במהלך ניתוח.</td></tr><tr><td>תמיסת קרצוף פובידון-יוד</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>2612701Q1137</td><td>משמש לחיטוי אתר הניתוח.</td></tr><tr><td>סכינים מיניאטוריות עגולות</td><td>Surgistar</td><td>4769</td><td>כלים כירורגיים.</td></tr><tr><td>אזמל</td><td>MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td><td>450-098-67</td><td>כלי כירורגי חד פעמי.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופים סטריאו מיקרוסקופים</td><td>Leica Microsystems</td><td>S8 APO</td><td>לניתוח.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח סטרילית</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>3311401A2026</td><td>תמיסת כביסה במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>כרית סטרילית עמידה למים</td><td>AS ONE</td><td>8-5945-01</td><td>פלטפורמה כירורגית.</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7635</td><td>צבע להדמיית כלי in vivo.</td></tr><tr><td>וילון כירורגי</td><td>Medline Industries</td><td>MP-0606F6T</td><td>וילון מחורר לניתוח.</td></tr><tr><td>אור UV</td><td>Toshiba</td><td>GL15</td><td>משמש לריפוי הדבקים.</td></tr><tr><td>דבקים אופטיים לריפוי UV</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>דבקים להדבקת כיסויים לצינורות נירוסטה.</td></tr><tr><td>קסילזין (סלקטל 2%)</td><td>באייר</td><td></td><td>הרדמה במהלך הניתוח.</td></tr></tbody></table>

ב vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

מיקרוגליה, תאי החיסון היחידים השוכנים במוח, משתתפים באופן פעיל בתחזוקת מעגלים עצביים על ידי שינוי סינפסות ועוררות עצבית. מחקרים אחרונים חשפו את ביטוי הגנים הדיפרנציאלי ואת ההטרוגניות התפקודית של תאי מיקרוגליה באזורי מוח שונים. התפקודים הייחודיים של הרשת העצבית של ההיפוקמפוס בלמידה ובזיכרון עשויים להיות קשורים לתפקידים הפעילים של תאי מיקרוגליה בעיצוב מחדש של סינפסות. עם זאת, תגובות דלקתיות המושרות על ידי הליכים כירורגיים היו בעייתיות בניתוח מיקרוסקופי של שני פוטונים של מיקרוגליה בהיפוקמפוס. כאן מוצגת שיטה המאפשרת תצפית כרונית של תאי מיקרוגליה בכל שכבות ההיפוקמפוס CA1 דרך חלון הדמיה. שיטה זו מאפשרת ניתוח של שינויים מורפולוגיים בתהליכים מיקרוגליאליים במשך יותר מחודש אחד. הדמיה ארוכת טווח וברזולוציה גבוהה של תאי מיקרוגליה במנוחה דורשת הליכים כירורגיים זעיר פולשניים, בחירת עדשה אובייקטיבית מתאימה וטכניקות הדמיה אופטימליות. התגובה הדלקתית החולפת של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס עשויה למנוע הדמיה מיד לאחר הניתוח, אך תאי המיקרוגליה משחזרים את המורפולוגיה השקטה שלהם תוך מספר שבועות. יתר על כן, דימות נוירונים בו זמנית עם מיקרוגליה מאפשר לנו לנתח את האינטראקציות של סוגי תאים מרובים בהיפוקמפוס. טכניקה זו עשויה לספק מידע חיוני על תפקוד מיקרוגליה בהיפוקמפוס.

באמצעות טכניקה זו, ניתן לצפות באופן כרוני בתאי מיקרוגליה מסועפים ושקטים בכל שכבות ה-CA1 הגבי, כולל שכבת אוריין (SO), שכבת פירמידל (SP), שכבה רדיאטום (SR) ושכבה לקונוסום-מולקולרית (SLM), במיוחד 3-4 שבועות לאחר הניתוח כאשר הדלקת שוככת. אם הניתוח מבוצע כראוי, ניתן לבצע הדמיה עד מספר חודשים לאחר הניתוח. חלק זה מכיל שלושה נושאים שימושיים להערכת הדמיה תוך-חיונית. ראשית, תמונות לדוגמה מיד לאחר הניתוח ובשלב הכרוני מסופקות כהפניות להליכים כירורגיים והדמיות מתאימים. שנית, המורפולוגיה הייחודית של תאי מיקרוגליה, עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם ופיזור כלי הדם בשכבות ספציפיות בהיפוקמפוס מתוארים כדי לסייע לקוראים להעריך את עומק ההדמיה הנע בין הנאדיות ל-DG. שלישית, מובאת דוגמה יישומית הממחישה הדמיה סימולטנית של נוירונים ותאי מיקרוגליה.
התמונות המייצגות של תאי מיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP מיד לאחר ניתוח מוצגות באיור 2. אם אין נזק נראה לעין ל-CA1 והעקמומיות של שכבות CA1 משוטחת כראוי על-ידי הכיסוי שמעליה, עומקי הדמיה של שני פוטונים של מיקרוגליה עולים על כל שכבות ה-CA1 ומגיעים ל-500 מיקרומטר מפני השטח של הניתוח, שם קיימים ML או שכבת תאי הגרגיר (GCL) של ה-DG (איור 2A; ראו שלב 4.7 ואיור 4E). תאי מיקרוגליה מעט פחות מסועפים, במיוחד בשכבה הקרובה לפני השטח הניתוחיים בהשוואה לאלה שבהיפוקמפוס השלם. אף על פי כן, הם אינם מפגינים הפעלה בולטת, מה שמרמז על הליכים כירורגיים נאותים (איור 2B). מצד שני, בצקת ב-CA1 הנגרמת על-ידי נזק לרקמות תגביל את עומק ההדמיה ל-200 מיקרומטר (איור 2C). נזק לרקמות גורם גם להפעלה חריגה של תאי מיקרוגליה, כמו למשל הצטברות של תהליכי בליטה לכיוון פני השטח של הרקמה החופשית (איור 2D; השוו לתמונה העליונה של איור 2B). אלה סימנים לניתוח לא מתאים.
התמונות המייצגות של תאי מיקרוגליה בשלב הכרוני יותר מ-3 שבועות לאחר הניתוח מוצגות באיור 3. ניתן לצלם תאי מיקרוגליה שוב מעבר ל-CA1 אל השכבות העמוקות יותר של ה-DG עם עוצמה ורזולוציה פלואורסצנטיות גבוהות יותר ועם פיזור הומוגני יותר (ראו שלב 6.3, איור 3B). איכות ההדמיה טובה יותר מזו שמיד לאחר הניתוח (איור 2A). הבדל זה עשוי להיות מוסבר על ידי בצקת מופחתת ודלקת. תאי מיקרוגליה בכל השכבות כבר שיקמו את המורפולוגיה המסועפת שלהם (איור 3C), שונה מהמראה שלהם לאחר הניתוח (איור 2B). הדמיה בהילוך מהיר של תאי מיקרוגליה ב-CA1 חושפת את גופי התאים הנייחים ואת תהליכי התנועה הגבוהים למעקב (וידאו 1-2). ההתנהגות התנועתית שלהם דומה לדיווח הקודם על דינמיקה של תהליכים מיקרוגליאליים בקליפת המוח9.
זה פשוט להגדיר את שכבות ההיפוקמפוס המדומות בהתבסס על ההתפלגות והעומק של גופי תאים עצביים, באמצעות עכברים המבטאים בדיקות פלואורסצנטיות בנוירונים בהיפוקמפוס25,26,27. ללא סיוע של מידע מיקום על גופי תאי העצב, האותות ממיקרוגליה פלואורסצנטית בלבד מספקים כמה רמזים לזיהוי שכבות ההיפוקמפוס (איור 3B). לתאי מיקרוגליה בנאדיות יש גופי תאים מוארכים ותהליכים שנוטים להתפשט לאורך דרכי האקסונל (איור 4A). ניתן להבחין בתאי מיקרוגליה בשכבות אחרות על ידי גופי התא העגולים שלהם ותהליכים המקרינים ללא כיוונים מועדפים. מיקרוגליה ב SP הם בין נוירונים פירמידליים צפופים וניתן להבחין על ידי צפיפות נמוכה יותר של תהליכים מיקרוגליאליים. השכבות שמעל ומתחת ל-SP מזוהות כ-SO ו-SR, בהתאמה (איור 4B). אי אפשר להבחין בין SR ו-SLM בהתבסס על תכונות מיקרוגליה בלבד. הגבול בין CA1 ל-DG מזוהה על-ידי כלי דם עבים שעוברים לאורך הגבול (איור 4C). ניתן לזהות טוב יותר את כלי הדם האלה על-ידי סימון כלי דם עם צבעים כגון סולפורהודאמין 101 (SR101; 5 מילימול, 4 מיקרוליטר/גרם משקל גוף) המוזרקים תוך צפקית (איור 4D). האות הפלואורסצנטי מתאי מיקרוגליה יורד בחדות ב-DG בהשוואה ל-CA1 שמעליו, כנראה בשל ההבדל במקדם השבירה של מבנים אלה. פער זה בעוצמת הפלואורסצנטיות עשוי גם לסייע בהגדרת הגבול בין DG ו-CA1. כדוגמה ליישום, מוצגת הדמיה סימולטנית של תאי מיקרוגליה חיוביים ל-GFP ותאי עצב פירמידליים המסומנים ב-tdTomato (איור 4E). בניסוי זה, עכברי CX3CR1-GFP קיבלו זריקה של וירוס הקשור באדנו (AAV) לביטוי tdTomato בנוירונים הפירמידליים בהיפוקמפוס. תיוג עצבי יעזור להבין את מבני השכבה המדויקים של CA1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> איור 1: שרטוטים סכמטיים להשתלת חלון התצפית . (A) מבט חתך רוחב של צינור המתכת המורכב מתחתית הזכוכית. חיפוי זכוכית עגול נצמד לקצה האחד של צינור הנירוסטה הגלילי. (B) מבט חתך רוחב של לוח האלומיניום המחובר לגולגולת. הצלחת צריכה להיות מקבילה למשטח המסומן של הגולגולת כדי לא להפריע לעדשה האובייקטיבית, הממוקמת קרוב לצלחת לצורך מיקוד. (C) מבט חתך רוחב של הצינור המושתל. תחתית הזכוכית צריכה להיות מחוברת היטב לנאדיות ההיפוקמפוס כדי ללחוץ בעדינות ולשטח את פני השטח של CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> איור 2: הדמיה In vivo של תאי מיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP מיד לאחר הניתוח. (A) שחזור תלת-ממדי מייצג מהדמיית CA1 in vivo של עכבר CX3CR1-GFP ביום שלאחר הניתוח (POD) 0 (רוחב: 511 מיקרומטר, גובה: 511 מיקרומטר, עומק: 550 מיקרומטר). ניתן לצלם את תאי המיקרוגליה הפלואורסצנטיים ב-ML של ה-DG בעומק של 500 מיקרומטר מתחתית הזכוכית דרך ה-CA1 כולו. (B) מיקרוגליה טיפוסית מלאה ב-GFP המתקבלת ב-(A) מוצגת כהקרנות בעוצמה מרבית (MIPs) של ערימות תמונות בעובי 20 מיקרומטר בעומקים של 100, 300 ו-520 מיקרומטר מתחתית הזכוכית. מורפולוגיה מיקרוגליאלית ניתנת לזיהוי מה-CA1 השטחי ל-ML של ה-DG, אם כי עם הידרדרות תמונה נראית לעין ב-DG. מיקרוגליה, במיוחד בשכבה הקרובה למשטח הניתוח, פחות מסועפת אך אינה מציגה הפעלה ברורה. פסי קנה מידה, 50 מיקרומטר. (C) שחזור תמונה תלת-ממדית מייצג של CA1 שניזוק בניתוח. הנתונים נרכשו מעכבר CX3CR1-GFP על POD 0 (רוחב: 399 מיקרומטר, גובה: 399 מיקרומטר, עומק: 450 מיקרומטר). פלואורסצנטיות מיקרוגליה ניתנת לזיהוי רק עד לעומק של 200 מיקרומטר, בניגוד ל-CA1 (A) שלא ניזוק עם מיקרוגליה פלואורסצנטית שזוהתה בעומק של 500 מיקרומטר. (D) התמונה האופיינית של מיקרוגליה פעילה באופן חריג ב-(C). MIP של ערימות תמונות GFP בעובי 20 מיקרומטר בעומק של 60 מיקרומטר מראה תהליכי בליטה מיקרוגליאליים המשתרעים לכיוון פני הרקמה החשופים בניתוח. המורפולוגיה הכוללת של מיקרוגליה שונה מהתמונה המוצגת ב-(B). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> איור 3: הדמיה In vivo של תאי מיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP בשלב הכרוני. (A) המראה המייצג של החלון המושתל ב-CA1 הגבי הימני בשלב הכרוני. דרך תחתית הזכוכית, הסיבים הלבנים של הנאדיות נצפים בבירור ללא דימום לאחר הניתוח. ה-DHC וה-LV נראים בחלקם באזור הקואודומדיאלי ובקצה הרוסטרולטרלי, בהתאמה. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. (B) שחזור תלת-ממדי מייצג מהדמיית CA1 כרונית in vivo של עכבר CX3CR1-GFP ב-POD 24 (רוחב: 511 מיקרומטר, גובה: 511 מיקרומטר, עומק: 670 מיקרומטר). בהשוואה לתמונות מיד לאחר ניתוח (איור 2A), תאי מיקרוגליה מראים התפלגות הומוגנית יותר וניתן לראות אותם בבירור רב יותר בשכבות העמוקות יותר של DG בגלל הפחתת בצקת ודלקת. (C) תמונות אופייניות של מיקרוגליה מ-(B) עם מורפולוגיה מסועפת משוחזרת במלואה מוצגות כ-MIPs של ערימות תמונות GFP בעובי של 20 מיקרומטר בעומקים של 100, 280 ו-500 מיקרומטר מפני השטח של הניתוח. פסי קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> איור 4: רמזים לזיהוי כל שכבה של ההיפוקמפוס במהלך דימות in vivo ודוגמה ליישום של שיטה זו. (A) התמונה האופיינית של מיקרוגליה בנאדיות של עכברי CX3CR1-GFP בשלב הכרוני. גופים ותהליכים של תאי מיקרוגליאה המשתרעים לאורך דרכי האקסונל מוצגים ב-MIP של ערימות תמונות GFP בעובי של 10 מיקרומטר ובעומק של 15 מיקרומטר. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של מיקרוגליה ב-SO, SP ו-SR בשלב הכרוני המוצגות כ-MIP של ערימות תמונות GFP בעובי 5 מיקרומטר. הצפיפות המקומית של תהליכים מיקרוגליאליים נמוכה יותר ב-SP מאשר ב-SO או SR שמסביב בגלל הנוירונים הפירמידליים הצפופים ב-SP. פסי קנה מידה, 100 מיקרומטר. (C) כלי הדם העבים העוברים לאורך הגבול בין CA1 ל-DG יכולים להיות מזוהים רק על ידי פלואורסצנטיות מיקרוגליה. מוצגת הקרנה בעוצמה ממוצעת של ערימות תמונות GFP אריחים בעובי 90 מיקרומטר בפאזה הכרונית בעומק של כ-500 מיקרומטר. החלל של אות GFP מתאים לכלי עבה. סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. (D) (עליון) התמונה של אותו שדה ראייה כמו C לאחר הזרקה intraperitoneal של SR101. סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר. (תחתון) שחזור תלת-ממדי של תמונות האריחים לאחר הזרקת SR101 (רוחב: 2.60 מ"מ, גובה: 1.73 מ"מ, עומק: 0.69 מ"מ). ניתן לזהות בקלות את כלי הדם העבים העוברים לאורך הגבול בין CA1 ל- DG על ידי פלואורסצנטיות SR101 תוך וסקולרית. (E) (משמאל) שחזור תלת-ממדי של ה-CA1 וה-DG (רוחב: 255 מיקרומטר, גובה: 255 מיקרומטר, עומק: 730 מיקרומטר) ו-MIP של פלואורסצנטיות GFP ו-tdTomato ב-SP העשוי מערימות תמונה בעובי 20 מיקרומטר. שבוע לפני הניתוח, 1.5 μL של תערובת של AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5.0 x 1012 vg/mL) ו-AAV1-hSyn-Cre (1.0 x 109 vg/mL) הוזרק לתוך ההיפוקמפוס של עכבר CX3CR1-GFP כדי לתייג את תאי העצב בדלילות. ההדמיה בוצעה על POD 0. SP ו- GCL מזוהים בקלות על ידי המיקום של גופי תאים עצביים. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: הדמיה בהילוך מהיר של מיקרוגליה SO בשלב הכרוני. MIP של תמונות GFP נערם בעובי 20 מיקרומטר בהדמיה בהילוך מהיר של מיקרוגליה SO, מונפש כך 28 דקות לשחק בשנייה אחת. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>
וידאו 2: הדמיה בהילוך מהיר של מיקרוגליה SR בשלב הכרוני. התמונה MIP של GFP נערמת בעובי של 20 מיקרומטר בהדמיה בהילוך מהיר של מיקרוגליה SR, מונפשת כך ש-28 דקות משחקות בשנייה אחת. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

תפקידי תאי המיקרוגליה בהיפוקמפוס עדיין אינם מובנים במלואם. פרוטוקול זה יכול לדמיין ישירות כיצד תאי מיקרוגליה באים במגע ומווסתים נוירונים. הדמיה In vivo של תאי מיקרוגליה ונוירונים במנוחה בהיפוקמפוס הייתה קשה מאוד.שיטה זו יכולה לפתור בעיה זו. כדי להשתיל את חלון התצפית, בצע חריץ עגול של שלושה מילימטר על הגולגולת באמצעות ניקוב עורי, המבטיח את יישור החריץ עם האזור שסומן קודם לכן. כאשר האגרוף העורי מגיע לשכבה הפנימית ביותר של הגולגולת לפני שהוא נוגע בדורה שמתחתיה, הרימו בעדינות את אי העצם המרכזי באמצעות מחט של 30 מד.לאחר מכן, בזהירות להסיר את dura באמצעות בורר dura. שאפו את הפיה, כלי הדם הפיאליים ורקמת קליפת המוח מפני השטח. לשמור על עומק פני הרקמה החשופה הומוגני על פני כל חלון הגולגולת ולהעמיק בהדרגה את השאיפה עד לחשיפת סיבי הקפסולה החיצונית.לאחר מיקום קצה היניקה לקפסולה החיצונית ליד החדר הצידי בקצה הרוסטרולטרלי של חלון הגולגולת, יש להסיר את שכבת פני השטח של הקפסולה החיצונית העוברת בקודומדיאל לכיוון הרוסטרולטרלי. לאחר מכן הסר את השכבה הפנימית הפועלת בכיוון הבינוני. אשר את הסרת הקפסולה החיצונית כולה על ידי בדיקת החשיפה המלאה של פני השטח של הנאדית ואת הקומיסורה של ההיפוקמפוס הגבי.לאחר שווידאתם שהדימום פסק לחלוטין, מלאו את החור במי מלח סטריליים עד לגובה פני הגולגולת. לאחר מכן, הכנס את צינור המתכת התחתון של הזכוכית במאונך לתוך החור תוך שאיפת עודפי המים העולים על גדותיהם מצידי הצינור עד שתחתית הזכוכית לוחצת קלות על הנאדיות ומשטחת חלקית את CA1 הבסיסי. בעזרת מלט השרף הדנטלי מקבעים את דופן הצינור המוחדר לגולגולת שמסביב.מקמו את העכבר במכשיר החזקת הראש מתחת לעדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ הדו-פוטוני ובשלב סריקת XY הממונעת. לאחר מכן מלאו את החלל שבין תחתית הזכוכית לעדשת האובייקט במים מבלי ליצור בועות אוויר. כוונן את המיקוד ל- CA1 עם הנחיית פלואורסצנטיות הנפלטת מפרנכימה במוח והאור המוחזר מקצה צינור המתכת תחת הארה רציפה על ידי הלייזר הפועם.כוונן את זווית ראש העכבר על-ידי הטיית התקן אחיזת הראש כך שתחתית הזכוכית תהיה מקבילה למישור ההדמיה. לאחר מכן התאם את צווארון התיקון של המטרה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר בעומק מבנה היעד ב- CA1. לאחר מכן, אשרו כי התאים הפלואורסצנטיים בשכבה המולקולרית של הפיתול המשונן או DG בעומק של 500 מיקרומטר מתחתית הזכוכית מצולמים בשדה הראייה כולו.רק במקרה של ניתוח מוצלח, אותות DG ניתן לזהות באופן מיידי. הרם את העכבר לאחר הניתוח בדיור בודד במשך מספר שבועות. מקמו את העכבר המורדם מתחת למיקרוסקופ בעל שני פוטונים.בצע את ההדמיה של ההיפוקמפוס. בדוק אם האיכות והעוצמה של התמונות שצולמו לאחר הפחתת בצקת לאחר הניתוח טובות יותר או דומות לאלה שצולמו ביום הניתוח. ודא כי מיקרוגליה התאוששו המורפולוגיה המסועפת שלהם.לאחר מכן בצע הדמיה in vivo על שכבת העניין ב- CA1. תאי המיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP שנלכדו מיד לאחר הניתוח לא הראו הפעלה בולטת. לאחר ניתוח מוצלח ללא השראת בצקת, עומק ההדמיה של שני פוטונים עלה על כל שכבות CA1 והגיע למרחק של 500 מיקרומטר מפני השטח של הניתוח.תאי המיקרוגליה בשלב הכרוני של יותר משלושה שבועות לאחר הניתוח הציגו עוצמה ורזולוציה פלואורסצנטית גבוהות יותר ופיזור הומוגני יותר עקב בצקת ודלקת מופחתות. תאי מיקרוגליה בכל השכבות כבר שיקמו את המורפולוגיה המסועפת שלהם והציגו גופי תאים חסרי תנועה ותהליכים מודאליים מאוד. התמונות ברזולוציה גבוהה על פני CA1 כולו סופקו במשך מספר חודשים.האותות מתאי מיקרוגליה פלואורסצנטיים מסייעים לזהות שכבות בהיפוקמפוס. למיקרוגליה בנאדיות היו גופי תאים מוארכים ותהליכים המשתרעים לאורך דרכי האקסונל. מיקרוגליה בשכבת פירמידלה ניתן להבחין על ידי צפיפות נמוכה יותר של התהליכים שלהם.הגבול בין CA1 ו- DG יכול להיות מזוהה על ידי כלי דם עבים העוברים לאורך הגבול, אשר זוהה טוב יותר על ידי סימון כלי דם עם sulforhodamine 101. כדוגמה ליישום, תאי מיקרוגליה חיוביים GFP ונוירונים פירמידליים מסומנים ב-tdTomato צולמו בו זמנית. תיוג עצבי עזר להבין את מבני השכבות המדויקים של CA1.הנקודה החשובה ביותר היא להפחית את הנזק לניתוח. הימנע נזק לרקמות על ידי שאיפה. הפעילו לחץ עדין בעת החדרת תחתית הזכוכית ומנעו מצמנט דנטלי לגעת במשטח המוח.גישה זו תסייע לזהות את תפקיד תאי המיקרוגליה בהיפוקמפוס. לדוגמה, כיצד תאי מיקרוגליה מתקשרים עם תאי עצב, כיצד הם מעורבים בלמידה, וכיצד הם שולטים במחלות מוח.

in-vivo-chronic-two-photon-imaging-microglia-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

מקור: בוסקו, א., .  In vivo דינמיקה של הפעלת מיקרוגליה ברשתית במהלך ניוון עצבי: הדמיה אופטלמוסקופית קונפוקלית ומורפומטריית תאים בגלאוקומה של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)} סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה. עכבר טרנסגני עם מיקרוגליה ברשתית המבטאת חלבון פלואורסצנטי ממוקם מתחת לאופטלמוסקופ. תאורת אינפרא אדום משמשת לאיתור ראש עצב הראייה (ONH), ומישור המוקד נוצר באמצעות כלי דם ברשתית כציוני דרך. לאחר מכן משתמשים בהדמיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את המיקרוגליה...

הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה

מקור: }Ulivi, A. F., et. al. הדמיה אורכית דו-פוטונית של ההיפוקמפוס הגבי CA1 בעכברים חיים. J. Vis. exp. (2019)} }סרטון זה מדגים הדמיה אורכית של שני פוטונים של נוירונים פירמידליים בעלי תווית פלואורסצנטית בעכבר חי,  הצגת ההכנה, יישור הצינורית וההדמיה של דנדריטים ועמוד שדרה דנדריטי כדי לחקור את המבנה העצבי באזור CA1 בהיפוקמפוס.

הדמיה אורכית דו-פוטונית של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית בהיפוקמפוס של עכבר חי 

Source: Nishimura, C. et al. כימות של ארכיטקטורת כלי דם מוחיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודל עכבר של דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נימים בקליפת המוח במוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הוא מתאר את השלבים להזרקת צבע פלואורסצנטי לעכבר מורדם עם חלון קליפת המוח דק הגולגולת, הכנת ההתקנה להדמיה ורכישת תמונות מפורטות של מבנים מיקרו-וסקולריים במוח לניתוח.

 מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה In Vivo של מיקרו-כלי דם במוח העכבר 

מקור: Kamei, R., et. al., In vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את תהליך ההתקנה וההדמיה של מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס CA1 (Cornu ammonis 1) ובפיתול המשונן, מה שמבטיח יישור אופטי אופטי והערכת שלמות מבנית.

הדמיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

למד הדמיה כרונית של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אינטראקציות תאיות ותפקידי מיקרוגליה בלמידה ובמחלות נוירולוגיות.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

גלה סרטונים נוספים