ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

תפקידי תאי המיקרוגליה בהיפוקמפוס עדיין אינם מובנים במלואם. פרוטוקול זה יכול לדמיין ישירות כיצד תאי מיקרוגליה באים במגע ומווסתים נוירונים. הדמיה In vivo של תאי מיקרוגליה ונוירונים במנוחה בהיפוקמפוס הייתה קשה מאוד.

שיטה זו יכולה לפתור בעיה זו. כדי להשתיל את חלון התצפית, בצע חריץ עגול של שלושה מילימטר על הגולגולת באמצעות ניקוב עורי, המבטיח את יישור החריץ עם האזור שסומן קודם לכן. כאשר האגרוף העורי מגיע לשכבה הפנימית ביותר של הגולגולת לפני שהוא נוגע בדורה שמתחתיה, הרימו בעדינות את אי העצם המרכזי באמצעות מחט של 30 מד.

לאחר מכן, בזהירות להסיר את dura באמצעות בורר dura. שאפו את הפיה, כלי הדם הפיאליים ורקמת קליפת המוח מפני השטח. לשמור על עומק פני הרקמה החשופה הומוגני על פני כל חלון הגולגולת ולהעמיק בהדרגה את השאיפה עד לחשיפת סיבי הקפסולה החיצונית.

לאחר מיקום קצה היניקה לקפסולה החיצונית ליד החדר הצידי בקצה הרוסטרולטרלי של חלון הגולגולת, יש להסיר את שכבת פני השטח של הקפסולה החיצונית העוברת בקודומדיאל לכיוון הרוסטרולטרלי. לאחר מכן הסר את השכבה הפנימית הפועלת בכיוון הבינוני. אשר את הסרת הקפסולה החיצונית כולה על ידי בדיקת החשיפה המלאה של פני השטח של הנאדית ואת הקומיסורה של ההיפוקמפוס הגבי.

לאחר שווידאתם שהדימום פסק לחלוטין, מלאו את החור במי מלח סטריליים עד לגובה פני הגולגולת. לאחר מכן, הכנס את צינור המתכת התחתון של הזכוכית במאונך לתוך החור תוך שאיפת עודפי המים העולים על גדותיהם מצידי הצינור עד שתחתית הזכוכית לוחצת קלות על הנאדיות ומשטחת חלקית את CA1 הבסיסי. בעזרת מלט השרף הדנטלי מקבעים את דופן הצינור המוחדר לגולגולת שמסביב.

מקמו את העכבר במכשיר החזקת הראש מתחת לעדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ הדו-פוטוני ובשלב סריקת XY הממונעת. לאחר מכן מלאו את החלל שבין תחתית הזכוכית לעדשת האובייקט במים מבלי ליצור בועות אוויר. כוונן את המיקוד ל- CA1 עם הנחיית פלואורסצנטיות הנפלטת מפרנכימה במוח והאור המוחזר מקצה צינור המתכת תחת הארה רציפה על ידי הלייזר הפועם.

כוונן את זווית ראש העכבר על-ידי הטיית התקן אחיזת הראש כך שתחתית הזכוכית תהיה מקבילה למישור ההדמיה. לאחר מכן התאם את צווארון התיקון של המטרה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר בעומק מבנה היעד ב- CA1. לאחר מכן, אשרו כי התאים הפלואורסצנטיים בשכבה המולקולרית של הפיתול המשונן או DG בעומק של 500 מיקרומטר מתחתית הזכוכית מצולמים בשדה הראייה כולו.

רק במקרה של ניתוח מוצלח, אותות DG ניתן לזהות באופן מיידי. הרם את העכבר לאחר הניתוח בדיור בודד במשך מספר שבועות. מקמו את העכבר המורדם מתחת למיקרוסקופ בעל שני פוטונים.

בצע את ההדמיה של ההיפוקמפוס. בדוק אם האיכות והעוצמה של התמונות שצולמו לאחר הפחתת בצקת לאחר הניתוח טובות יותר או דומות לאלה שצולמו ביום הניתוח. ודא כי מיקרוגליה התאוששו המורפולוגיה המסועפת שלהם.

לאחר מכן בצע הדמיה in vivo על שכבת העניין ב- CA1. תאי המיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP שנלכדו מיד לאחר הניתוח לא הראו הפעלה בולטת. לאחר ניתוח מוצלח ללא השראת בצקת, עומק ההדמיה של שני פוטונים עלה על כל שכבות CA1 והגיע למרחק של 500 מיקרומטר מפני השטח של הניתוח.

תאי המיקרוגליה בשלב הכרוני של יותר משלושה שבועות לאחר הניתוח הציגו עוצמה ורזולוציה פלואורסצנטית גבוהות יותר ופיזור הומוגני יותר עקב בצקת ודלקת מופחתות. תאי מיקרוגליה בכל השכבות כבר שיקמו את המורפולוגיה המסועפת שלהם והציגו גופי תאים חסרי תנועה ותהליכים מודאליים מאוד. התמונות ברזולוציה גבוהה על פני CA1 כולו סופקו במשך מספר חודשים.

האותות מתאי מיקרוגליה פלואורסצנטיים מסייעים לזהות שכבות בהיפוקמפוס. למיקרוגליה בנאדיות היו גופי תאים מוארכים ותהליכים המשתרעים לאורך דרכי האקסונל. מיקרוגליה בשכבת פירמידלה ניתן להבחין על ידי צפיפות נמוכה יותר של התהליכים שלהם.

הגבול בין CA1 ו- DG יכול להיות מזוהה על ידי כלי דם עבים העוברים לאורך הגבול, אשר זוהה טוב יותר על ידי סימון כלי דם עם sulforhodamine 101. כדוגמה ליישום, תאי מיקרוגליה חיוביים GFP ונוירונים פירמידליים מסומנים ב-tdTomato צולמו בו זמנית. תיוג עצבי עזר להבין את מבני השכבות המדויקים של CA1.

הנקודה החשובה ביותר היא להפחית את הנזק לניתוח. הימנע נזק לרקמות על ידי שאיפה. הפעילו לחץ עדין בעת החדרת תחתית הזכוכית ומנעו מצמנט דנטלי לגעת במשטח המוח.

גישה זו תסייע לזהות את תפקיד תאי המיקרוגליה בהיפוקמפוס. לדוגמה, כיצד תאי מיקרוגליה מתקשרים עם תאי עצב, כיצד הם מעורבים בלמידה, וכיצד הם שולטים במחלות מוח.