ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר
6 ביולי 2022
מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.
תפקידי תאי המיקרוגליה בהיפוקמפוס עדיין אינם מובנים במלואם. פרוטוקול זה יכול לדמיין ישירות כיצד תאי מיקרוגליה באים במגע ומווסתים נוירונים. הדמיה In vivo של תאי מיקרוגליה ונוירונים במנוחה בהיפוקמפוס הייתה קשה מאוד.
שיטה זו יכולה לפתור בעיה זו. כדי להשתיל את חלון התצפית, בצע חריץ עגול של שלושה מילימטר על הגולגולת באמצעות ניקוב עורי, המבטיח את יישור החריץ עם האזור שסומן קודם לכן. כאשר האגרוף העורי מגיע לשכבה הפנימית ביותר של הגולגולת לפני שהוא נוגע בדורה שמתחתיה, הרימו בעדינות את אי העצם המרכזי באמצעות מחט של 30 מד.
לאחר מכן, בזהירות להסיר את dura באמצעות בורר dura. שאפו את הפיה, כלי הדם הפיאליים ורקמת קליפת המוח מפני השטח. לשמור על עומק פני הרקמה החשופה הומוגני על פני כל חלון הגולגולת ולהעמיק בהדרגה את השאיפה עד לחשיפת סיבי הקפסולה החיצונית.
לאחר מיקום קצה היניקה לקפסולה החיצונית ליד החדר הצידי בקצה הרוסטרולטרלי של חלון הגולגולת, יש להסיר את שכבת פני השטח של הקפסולה החיצונית העוברת בקודומדיאל לכיוון הרוסטרולטרלי. לאחר מכן הסר את השכבה הפנימית הפועלת בכיוון הבינוני. אשר את הסרת הקפסולה החיצונית כולה על ידי בדיקת החשיפה המלאה של פני השטח של הנאדית ואת הקומיסורה של ההיפוקמפוס הגבי.
לאחר שווידאתם שהדימום פסק לחלוטין, מלאו את החור במי מלח סטריליים עד לגובה פני הגולגולת. לאחר מכן, הכנס את צינור המתכת התחתון של הזכוכית במאונך לתוך החור תוך שאיפת עודפי המים העולים על גדותיהם מצידי הצינור עד שתחתית הזכוכית לוחצת קלות על הנאדיות ומשטחת חלקית את CA1 הבסיסי. בעזרת מלט השרף הדנטלי מקבעים את דופן הצינור המוחדר לגולגולת שמסביב.
מקמו את העכבר במכשיר החזקת הראש מתחת לעדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ הדו-פוטוני ובשלב סריקת XY הממונעת. לאחר מכן מלאו את החלל שבין תחתית הזכוכית לעדשת האובייקט במים מבלי ליצור בועות אוויר. כוונן את המיקוד ל- CA1 עם הנחיית פלואורסצנטיות הנפלטת מפרנכימה במוח והאור המוחזר מקצה צינור המתכת תחת הארה רציפה על ידי הלייזר הפועם.
כוונן את זווית ראש העכבר על-ידי הטיית התקן אחיזת הראש כך שתחתית הזכוכית תהיה מקבילה למישור ההדמיה. לאחר מכן התאם את צווארון התיקון של המטרה כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר בעומק מבנה היעד ב- CA1. לאחר מכן, אשרו כי התאים הפלואורסצנטיים בשכבה המולקולרית של הפיתול המשונן או DG בעומק של 500 מיקרומטר מתחתית הזכוכית מצולמים בשדה הראייה כולו.
רק במקרה של ניתוח מוצלח, אותות DG ניתן לזהות באופן מיידי. הרם את העכבר לאחר הניתוח בדיור בודד במשך מספר שבועות. מקמו את העכבר המורדם מתחת למיקרוסקופ בעל שני פוטונים.
בצע את ההדמיה של ההיפוקמפוס. בדוק אם האיכות והעוצמה של התמונות שצולמו לאחר הפחתת בצקת לאחר הניתוח טובות יותר או דומות לאלה שצולמו ביום הניתוח. ודא כי מיקרוגליה התאוששו המורפולוגיה המסועפת שלהם.
לאחר מכן בצע הדמיה in vivo על שכבת העניין ב- CA1. תאי המיקרוגליה בעכברי CX3CR1-GFP שנלכדו מיד לאחר הניתוח לא הראו הפעלה בולטת. לאחר ניתוח מוצלח ללא השראת בצקת, עומק ההדמיה של שני פוטונים עלה על כל שכבות CA1 והגיע למרחק של 500 מיקרומטר מפני השטח של הניתוח.
תאי המיקרוגליה בשלב הכרוני של יותר משלושה שבועות לאחר הניתוח הציגו עוצמה ורזולוציה פלואורסצנטית גבוהות יותר ופיזור הומוגני יותר עקב בצקת ודלקת מופחתות. תאי מיקרוגליה בכל השכבות כבר שיקמו את המורפולוגיה המסועפת שלהם והציגו גופי תאים חסרי תנועה ותהליכים מודאליים מאוד. התמונות ברזולוציה גבוהה על פני CA1 כולו סופקו במשך מספר חודשים.
האותות מתאי מיקרוגליה פלואורסצנטיים מסייעים לזהות שכבות בהיפוקמפוס. למיקרוגליה בנאדיות היו גופי תאים מוארכים ותהליכים המשתרעים לאורך דרכי האקסונל. מיקרוגליה בשכבת פירמידלה ניתן להבחין על ידי צפיפות נמוכה יותר של התהליכים שלהם.
הגבול בין CA1 ו- DG יכול להיות מזוהה על ידי כלי דם עבים העוברים לאורך הגבול, אשר זוהה טוב יותר על ידי סימון כלי דם עם sulforhodamine 101. כדוגמה ליישום, תאי מיקרוגליה חיוביים GFP ונוירונים פירמידליים מסומנים ב-tdTomato צולמו בו זמנית. תיוג עצבי עזר להבין את מבני השכבות המדויקים של CA1.
הנקודה החשובה ביותר היא להפחית את הנזק לניתוח. הימנע נזק לרקמות על ידי שאיפה. הפעילו לחץ עדין בעת החדרת תחתית הזכוכית ומנעו מצמנט דנטלי לגעת במשטח המוח.
גישה זו תסייע לזהות את תפקיד תאי המיקרוגליה בהיפוקמפוס. לדוגמה, כיצד תאי מיקרוגליה מתקשרים עם תאי עצב, כיצד הם מעורבים בלמידה, וכיצד הם שולטים במחלות מוח.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לדימוי כרוני in vivo של מיקרוגליה במצב מנוחה באזור CA1 של ההיפוקמפוס בעכבר, תוך שימוש בגישה כירורגית ובמיקרוסקופיה דו-פוטונית. המחקר בוחן כיצד מיקרוגליה מקיימת אינטראקציה עם נוירונים ואת תפקידיה בתהליכי המוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דימות מוחי
רקע
- תפקודי המיקרוגליה בהיפוקמפוס אינם מובנים במלואם.
- דימוי in vivo של מיקרוגליה ונוירונים במצב מנוחה הציב אתגרים משמעותיים.
- פרוטוקול זה נועד למלא את הפער שזוהה בדימוי של מיקרוגליה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לצפייה בהתנהגות מיקרוגליה ובאינטראקציה שלה עם נוירונים.
- צמצום הנזק הניתוחי במהלך תהליך הצפייה.
- אספקת תובנות לגבי תפקידי המיקרוגליה בלמידה ובהפרעות מוחיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש במיקרוסקופיית פוטון כפול לצורך הדימוי.
- דימוי כרוני in vivo התמקד באזור ה-CA1 של ההיפוקמפוס בעכבר.
- השיטה כללה טכניקות כירורגיות מדויקות כדי למזער את הנזק לרקמה.
- שפופרות מתכת בעלות תחתית זכוכית שימשו להשגת גישה אופטית ויציבות.
- לאחר הניתוח, העכברים נוטרו לצורך התאוששות והדימוי בוצע מספר שבועות לאחר מכן.
תוצאות עיקריות
- מיקרוגליה שיחזרו את המורפולוגיה המסתעפת ואת התהליכים שלהם לאחר הניתוח.
- רזולוציית דימות משופרת אפשרה תצפית מפורטת על התנהגות המיקרוגליה.
- מורפולוגיות שונות של מיקרוגליה זוהו בשכבות השונות של ההיפוקמפוס.
- אינטראקציות נוירונליות נבחנו באמצעות דימות כפול של מיקרוגליה המסומנת ב-GFP ונוירונים פירמידליים המסומנים ב-tdTomato.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת תצפית ארוכת טווח על דינמיקה של מיקרוגליה in vivo.
- הממצאים תומכים בהבנת האינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים בהקשר של למידה ומחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות דו-פוטוני כרוני in vivo של מיקרוגליה בהיפוקמפוס של עכבר מאפשר תצפית ישירה ואורכית של אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים באזור מוחי רלוונטי למחלה. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות עבור פורטפוליים של נוירו-דלקת וניוון עצבי. דימות ברזולוציה גבוהה ועם פולשנות מינימלית לאורך שכבות ההיפוקמפוס מקדם את הביטחון החזוי בתוכניות גילוי מוקדמות ומדעי עצבים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של דינמיקת תהליכי המיקרוגליה ומגע עם נוירונים in situ.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מתאם בין מורפולוגיית המיקרוגליה למצבים נוירונליים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים עבור היפותזות טיפוליות המכוונות למיקרוגליה.
- מספק רזולוציה מרחבית וזמנית להבהרת מעורבות של מסלולים במעגלים היפוקמפליים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבססת פלטפורמה מאומתת in vivo לכימות תגובות מיקרוגליאליות לתרכובות מועמדות.
- מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות.
- מאפשר סריקה של התערבויות המשפיעות על אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים בהקשר של רקמה טבעית.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) עבור מחקרים אורכיים והשוואה צולבת של תנאי ניסוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות לצורך מחקר על ניוון עצבי ונוירו-דלקת.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אחר התנהגות מיקרוגליה לאורך זמן.
- תומך בהחלטות קידום מבוססות התאמת סיכונים על בסיס מדדים תפקודיים in vivo.
- מספק תובנות לגבי סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתאם בין פנוטיפים של דימות לבין התקדמות המחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת (Pipeline & Workflow Integration)
שיטת דימות זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים לתיקוף טרנסלציונלי במסלולי מחקר בנוירוביולוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקידי המיקרוגליה בעיצוב מחדש של סינפסות ובבקרה עצבית.
- סריקה: מספק נתוני דימוי כמותיים וניתנים לשחזור להערכת תרכובות ברקמה חיה.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של מורפולוגיית מיקרוגליה, ניידות של זקיפים ואינטראקציות בין תאים בשכבות ההיפוקמפוס.
- מחקר תרגומי: מקל על ההתאמה למודלים של מחלות ועל פיתוח ביומרקרים לאורכיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת דימוי in vivo רב-פעמית הניתנת להתאמה למטרות ולהתערבויות נוירוביולוגיות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוירו-אימוניות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה בדימות כרוני ומשפר את השחזוריות בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים אורכיים עתירי תוכן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות למחקר דלקות עצביות (neuroinflammation) וניוון עצבי (neurodegeneration).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, מיקרוסקופיה דו-פוטונית וטיפול בבעלי חיים.
- דורש גישה לתשתית דימות מתקדמת וליכולות סימון פלואורסצנטי.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת של פרוטוקולי ניתוח ודימות בין צוותים שונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- דלקת זמנית לאחר הניתוח מגבילה דימות מיידי ומחייבת תקופות התאוששות להשגת איכות נתונים אופטימלית.
שאלות נפוצות בביופרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Implantation of the Observation Window
2:34
Two‐Photon Microscopy Immediately After Surgery for Quality Check
3:55
In Vivo Chronic Two‐Photon Imaging of Microglia Using CX3CR1‐GFP Mice
4:29
Results: In Vivo Imaging of Microglia in CX3CR1‐GFP Mice
6:20
Conclusion
