Name: הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למדו הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים באמצעות חלון קרניאלי וזריקת AAV. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים בזמן אמת תוך מזעור חפצי תנועה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר מסאשי קונדו ולד"ר מסאנורי מצוזאקי על אספקת וקטורי הנגיף. עבודה זו נתמכה על ידי Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 to S.O.), הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (JP19gm1310003 ו- JP17gm5010003 ל- S.O. ו- JP19dm0207082 ל- H.M.), מרכז UTokyo למדע אינטגרטיבי של התנהגות אנושית (CiSHuB), סוכנות המדע והטכנולוגיה היפנית Moonshot R&D (JPMJMS2024 עד H.M.), הקרן למדעי המוח (ל H. M).

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים והוועדה לבטיחות ניסויים רקומביננטיים גנטיים של בית הספר לרפואה והפקולטה לרפואה באוניברסיטת טוקיו, ובוצעו בהתאם להנחיותיהן.
1. הכנה
<ol><li>לעקר את כל המכשירים והמנגנונים הדרושים לניתוח באמצעות autoclave או 70% אתנול.</li>
	<li>הכנת פיפטה זכוכית.<ol><li>קבע היטב נימי 75 μL מכויל למחזיק המושך micropipette. הגדר את המושך לתוכנית עם הפרמטרים המומלצים כ- P (לחץ) = 500, חום = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180.</li>
		<li>לאחר סיום התוכנית (בדרך כלל 4.5 עד 5 שניות), הנימים מחולקים לשתי פיפטות זכוכית עם זנבות מתחדדים. לאחר מכן, שברו את החלק הדיסטלי של הזנבות בפינצטה כדי לשמור על קוטר הקצה בטווח של 30-50 מיקרומטר. לשם כך, לשבור את הזנבות 1 ס"מ דיסטלי עד סוף החלק המשופע.</li>
	</ol></li>
	<li>עבור קרניוטומיה, הכינו חלון גולגולתי על-ידי הדבקת דיסק זכוכית חיצוני גדול יותר, בקוטר 4 מ"מ, בעובי 0.15 ± 0.02 מ"מ, לדיסק זכוכית פנימי קטן יותר, בקוטר 2 מ"מ, בעובי 0.525 ± 0.075 מ"מ, באמצעות מגיב ריפוי אור UV (איור 2A).</li>
</ol>2. הזרקת AAV
<ol><li>הכנת מנגנון הזרקה<ol><li>הניחו פיפטה מזכוכית המחוברת למזרק המילטון 26G דרך צינור על מחזיק פיפטה של מכשיר סטריאוטקסי, ולאחר מכן הטו את מחזיק הפיפט 60° קדימה מהציר האנכי (איור 1A,B).</li>
		<li>ממלאים את פיפטת הזכוכית, המזרק וצינור החיבור בפרפין נוזלי. מניחים את המזרק על מזרק מיקרו.</li>
	</ol></li>
	<li>הליך כירורגי הערה: הניתוח הבא בוצע בתא מעוקר. לצורך הניתוח נעשה שימוש בסטריאומיקרוסקופ במידת הצורך.<ol><li>מרדימים עכבר CX3CR1-EGFP זכר (מידע מפורט בטבלת החומרים) בגיל 7 עד 8 שבועות (משקל גוף 22-26 גרם) עם 3% איזופלורן בתא אטום לגזים. לאחר 3 דקות, הוציאו את העכבר מהחדר כאשר הוא מאבד תנועה רצונית למעט נשימה, ולאחר מכן עברו להרדמה רציפה על ידי צינור אף עם 2% איזופלורן. הערה: ידוע כי איזופלורן מפעיל מיקרוגליה. עם זאת, מכיוון שההדמיה מבוצעת 4 שבועות לאחר הניתוח, אין השפעה של איזופלורן על העכברים במהלך ההדמיה. למרות שהרדמה איזופלורנית משמשת למספר דקות כאשר עכברים מונחים במכשיר הסטריאוטקסי לפני הדמיה (שלב 4.2.1), מצאנו כי ההשפעה של הרדמה קצרה זו היא זניחה.</li>
		<li>במהלך הניתוח, שמור על העכבר חם עם כרית חימום ב 37 ° C כדי למנוע היפותרמיה. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים למניעת יובש בקרנית ולתת זריקת מלוקסיקם, תת עורית (5 מ"ג/ק"ג). חבר את העכבר למוט אוזניים עזר, ולאחר מכן קבע את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי עם הצד הגבי שלו כלפי מעלה.</li>
		<li>התאמת ריכוז האיזופלורן לאחוז מתאים (1%-2%) במהלך הניתוח תוך ניטור הנשימה וקצב הלב. הסירו את השיער באמצעות קרם אפילציה וחיטאו את הראש מספר פעמים בתנועה סיבובית עם פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין ואלכוהול. לאחר מכן, להזריק 0.1 מ"ל של 1% לידוקאין תת עורית ולהחיל וילונות סטריליים כדי לאבטח את אתר הניתוח.</li>
		<li>חתכו את הקרקפת לאורך קו האמצע בעזרת מספריים ובצעו את החתך באורך של כ-2 ס"מ, כדי להבטיח חשיפה טובה של הגולגולת מעל קליפת המוח הראייתית הראשונית הימנית. לאחר החתך בקרקפת, השקו את הראש במי מלח לאורך כל ההליך כדי למנוע מהגולגולת והמוח החשופים להתייבש.</li>
		<li>הסר את periosteum על הגולגולת החשופה באמצעות מלקחיים. קדחו את הגולגולת על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות: 3 מ"מ לרוחב לקו האמצע, 0.5 מ"מ קדמי לקו הלמדא, ליצירת חור קטן בקוטר של כ-0.5 מ"מ. יש לשטוף דם ושאריות רקמות מהמקדח, במידת הצורך.</li>
		<li>מלא את פיפטת הזכוכית ב- 1 μL של rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 באמצעות ההליך הבא בטיטר של 8.3 x 1012 גנומים וקטוריים/מ"ל22.<ol><li>מקדמים את המזרק כדי להוציא 1 μL של פרפין נוזלי מפיפטת הזכוכית. מניחים פיסת סרט שקוף, בגודל של כ-2X2 ס"מ, על גולגולת העכבר החשופה ומוציאים טיפה של 1 מיקרוליטר של תמיסת AAV על הסרט באמצעות פיפטר.</li>
			<li>הניחו את קצה פיפטת הזכוכית לתוך טיפת תמיסת AAV על הסרט ומשכו בעדינות את המזרק כדי לשאוף את תמיסת ה- AAV. לאחר הפליטה, סובב את הסטופרקוק בצורת T כדי לשחרר את הלחץ בתוך הצינור ואת פיפטת הזכוכית.</li>
		</ol></li>
		<li>הכניסו את פיפטת הזכוכית לעומק של 500 מיקרומטר מפני השטח של המוח דרך החור שנוצר בשלב 2.2.5, ואז הזריקו 0.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV באמצעות המיקרו-מזרק (איור 1C). השתמש בקצב זרימת נפח ההזרקה של 2.0 μL / h; זריקה של 0.5 μL לוקח 15 דקות, ולאחר מכן לחכות 5 דקות.</li>
		<li>לאחר ההזרקה, למשוך בעדינות את פיפטת הזכוכית ולשטוף את משטח המוח עם מלוחים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. השתלת חלון גולגולת
הערה: השתלת חלון גולגולת מתבצעת לאחר הזרקת AAV באותו היום.
<ol><li>סמן עיגול בקוטר 2.5 מ"מ על הגולגולת, ממורכז 3 מ"מ לרוחב מהלמדא. צור חריץ עגול לאורך הסימן על הגולגולת על ידי קידוח. נקו את הפסולת מכיוון שהיא עלולה להשפיע לרעה על נראות הגולגולת ומרחו מלח במהלך תהליך הקידוח כדי למנוע התחממות.</li>
	<li>כדי לבדוק אם עומק הקידוח בחריץ המעגלי מספיק כדי להסיר את שבר הגולגולת המרכזי, לחץ בעדינות על הגולגולת המרכזית עם מלקחיים. אם הוא נע אנכית עם התנגדות קטנה, עומק הקידוח מספיק.</li>
	<li>כאשר החריץ מגיע לעומק מספיק, הכניסו את קצה המלקחיים לתחתית שבר הגולגולת המרכזי והרימו והוציאו אותו בעדינות כדי לחשוף את פני השטח של המוח (איור 1D).</li>
	<li>בעזרת מחט 27 גרם, דוקרים וקורעים את הדורה בקצה משטח המוח החשוף. הכנס את קצה המלקחיים דרך החור שנוצר בקצה הדורה. החזיקו את הדורה וקילפו אותה כדי לחשוף את פני השטח של המוח. הערה: אם מתרחש דימום, שטפו את משטח המוח במי מלח עד שהדימום ייפסק.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מפזרים סיבים המוסטטיים בזה אחר זה במי מלח בכלי של 3.5 מ"מ, ולאחר מכן מניחים את הסיבים ההמוסטטיים לאורך שולי החור שבו נמצאת הדורה הטרנסקטית.</li>
	<li>הניחו חלון גולגולת שהוכן בשלב 1.3 על משטח המוח החשוף, ולאחר מכן הדביקו אותו לגולגולת בדבק מיידי תוך לחיצה עדינה על החלון כך שהחלון יהיה במגע הדוק עם הגולגולת.</li>
	<li>לאחר מכן, מרחו דבק מיידי על כל הגולגולת החשופה, ולאחר מכן חברו בזהירות לוחית ראש לגולגולת כך שהחלון ימוקם במרכז החור המרובע של לוחית הראש (איור 2C). ודא שפני השטח של לוח הראש מקבילים לפני השטח של חלון הזכוכית.</li>
	<li>לאחר שהדבק התקשה מספיק, מרחו מלט דנטלי על הגולגולת החשופה כדי לחזק את החיבור בין הראש ללוחית הראש (איור 2). הערה: אם הניסויים כוללים הצגת גירויים חזותיים לעכברים, יש להימנע מאור תועה לאזור ההדמיה. מומלץ להשחיר את המלט על ידי ערבובו עם הפחם הפעיל להפחתת השתקפות האור.</li>
	<li>מוציאים את העכבר מההרדמה לאחר שהמלט התקשה מספיק (כ-20 דקות). לאחר מכן, הכניסו את העכבר לכלוב חדש כדי להתאושש לבד.</li>
	<li>לאחר שאישר את הכרתו ואת תנועתו מרצון, המעידה על התאוששות מלאה, החזיר את העכבר לכלוב הביתי. במהלך ההתאוששות, לנהל מנה שנייה, או יותר במידת הצורך, meloxicam (פעם כל 24 שעות במשך 1-3 ימים) אם התנהגויות ברורות המציין כאב להתרחש.</li>
</ol>4. In vivo הדמיה של שני פוטונים של מיקרוגליה ודינמיקה של סידן עצבי
<ol><li>התרגלות עכברים למכשיר המיקרוסקופ<ol><li>שלושה שבועות לאחר הניתוח, השר הרדמה בעכבר עם 3% איזופלורן, ומקם את העכבר מתחת לעדשת 25x אובייקטיבית של מיקרוסקופ שני פוטונים באמצעות מכשיר סטריאוטקסי מותאם אישית (איור 3C). עבור ההתקנה כאן, העכבר מוגדר על החלק העליון של הליכון מותר לרוץ בחופשיות.</li>
		<li>כ-10 דקות לאחר מכן, הוציאו את העכבר משלב המיקרוסקופ והחזירו אותו לכלוב הביתי. חזור על ההרגלה לפחות 3 פעמים בכל יום חלופי לפני רכישת תמונה של שני פוטונים.</li>
	</ol></li>
	<li>רכישת תמונה של שני פוטונים הערה: אנו ממליצים לבצע את רכישת התמונה יותר מ -4 שבועות לאחר הניתוח, מכיוון שהפעלת מיקרוגליאה חוזרת בהדרגה לרמה הבסיסית.<ol><li>כמו בשלב 4.1, יש להשרות הרדמה בעכבר עם איזופלורן 3% ולהציב את העכבר מתחת לעדשת המטרה של המיקרוסקופ הדו-פוטוני באמצעות מכשיר סטריאוטקסי בהתאמה אישית.</li>
		<li>התקן הצללה בהתאמה אישית וצג LCD לגירוי חזותי כמתואר להלן (איור 3D).<ol><li>מקם את העדשה כך שתתמקד על פני השטח של המוח, ולאחר מכן הגדר מיקום עדשה זה כמיקום Z המקורי. שמור על קואורדינטות x-y קבועות והרם את העדשה האובייקטיבית; הסר את העכבר ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעדשה האובייקטיבית ומההליכון.</li>
			<li>חברו מכשיר הצללה לחלק העליון של פלטת הראש באמצעות סיליקון, אשר מושחר על ידי ערבוב עם אבקת פחם, וודאו שהרווח בין פלטת הראש למכשיר ההצללה אטום היטב.</li>
			<li>מלאו את מכשיר ההצללה במים מזוקקים, ולאחר מכן תקנו שוב את העכבר ואת המסגרת הסטריאוטקסית מתחת למטרה ועל ההליכון. אפסו בזהירות את מישור המוקד על פני המוח, בדקו את עומק עדשת המטרה. הערה: כדי למנוע את הסיכון של פגיעה בעדשת המטרה, הגדר תחילה את קואורדינטות xyz ולאחר מכן החל את התקן ההצללה של עדשת האובייקט. זה גם סביר להתקין את הכיסוי הראשון, ולאחר מכן להתאים את הקואורדינטות, אבל טיפול זהיר הכרחי עבור אפשרות זו.</li>
			<li>כסו את עדשת האובייקט ברדיד אלומיניום שחור כדי למנוע זיהום אור מצג ה-LCD המשמש לגירוי חזותי דרך עדשת האובייקט (איור 3D). הגדר צג LCD בגודל 10 אינץ' בגודל 12.5 ס"מ מול עיני העכבר כדי להציג גירויים חזותיים (איור 3D).</li>
		</ol></li>
		<li>הגדר את מסנני איסוף הפליטה הפלואורסצנטית לפלואורסצנטיות EGFP (מסנן פליטה של 525/50 ננומטר) ולפלואורסצנטיות R-CaMP (מסנן פליטה של 593/46 ננומטר) ואת אורך גל העירור ל- 1,000 ננומטר. קבל תמונות ברזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרומטר/פיקסל באמצעות יעד NA של 25x 1.1 ו-GaAsP PMTs.</li>
		<li>מצאו את אזור ההדמיה שבו ניתן לצלם בו-זמנית תאי עצב R-CaMP(+) ותאי מיקרוגליה מסוג EGFP(+) בשכבה 2/3. עבור מערך זה, הנתונים שהתקבלו באיור 4 ובווידאו 1 היו בעומק של 100 מיקרומטר מפני השטח של הפיאל, באמצעות תצוגה מקדימה של תמונה חיה. שמור על עוצמת לייזר עירור נמוכה ככל האפשר כדי למנוע הלבנת אור ונזק הנגרם על ידי טמפרטורה מקומית מוגברת באזור ההדמיה.</li>
		<li>קבל תמונות בקצב פריימים של 30 הרץ. במקביל לרכישת התמונה, הצג גירויים חזותיים נסחפים ב-100% ניגודיות, 1.5 הרץ, 0.04 מחזורים למעלה ב-12 כיוונים ב-6 כיוונים מ-0° עד 150° בצעדים של 30° לעכבר17.</li>
		<li>לאחר רכישת התמונה, הוציאו את העכבר משלב המיקרוסקופ, נתקו את מכשיר ההצללה ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעכבר והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.</li>
	</ol></li>
	<li>רישום נתונים<ol><li>המר ושמור את נתוני התמונה שנרכשו (תבנית nd2 במקרה זה) כסדרה של קובצי תמונה tiff לכל ערוץ צבע, באמצעות פיג'י או התוכנה שסופקה עם המיקרוסקופ.</li>
		<li>החל Turboreg, תוסף של פיג'י, כדי לבצע רישום עם מצב = תרגום. השתמשו בתמונה ממוצעת כתמונת הייחוס עם קובצי התמונה tiff של ערוץ EGFP.</li>
		<li>בצעו את העיבוד הבא עבור כל מסגרת באמצעות MATLAB. הערה: למרות ש- MATLAB משמש בעיבוד הבא, התיאור מתמקד בעיקר בכוונה של כל שלב, כך שניתן יהיה לנתח נתונים על ידי תוכנות תכנות אחרות כגון Python.<ol><li>השתמש בפונקציה imread כדי לקרוא שתי תמונות EGFP tiff לפני ואחרי רישום של אותה מסגרת, בהתאמה. השתמש בפונקציה imread כדי לקרוא את תמונת R-CaMP tiff של אותה מסגרת.</li>
			<li>השתמש בפונקציה normcorr2 כדי לחשב את פונקציית המתאם בין המשתנים הווקטוריים של שתי תמונות GFP שנקראו בשלב 4.3.3.1.</li>
			<li>השתמש בפונקציה max כדי לזהות את האינדקס הליניארי עם המתאם הצולב הגבוה ביותר של פונקציית המתאם, ולאחר מכן השתמש בפונקציה ind2sub כדי לחשב את מיקום התנועה של התמונה הרשומה מהתמונה המקורית שלה.</li>
			<li>השתמש בפונקציה imwarp כדי לתרגם את תמונת R-CaMP למיקום המחושב בשלב 4.3.3.3 ולאחר מכן השתמש בפונקציית הכתיבה כדי לשמור את התמונה הרשומה של R-CaMP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>יצירת עקבות סידן<ol><li>בצעו את העיבוד הבא באמצעות MATLAB. השתמש בפונקציה imread כדי לקרוא את כל התמונות הרשומות של R-CaMP tiff שנוצרו בשלב 4.3.3.4. אם התמונות הרשומות כבר נטענו כמשתנה בסביבת העבודה, השמט שלב זה.</li>
		<li>השתמש בפונקציה mean כדי ליצור תמונת הקרנת זמן. השתמש בפונקציה imshow כדי להציג את התמונה הממוצעת כאיור; השתמש בפונקציה roipoly כדי ליצור מסיכת ROI בינארית של מבנה המטרה (עמוד השדרה הדנדריטי בנתונים אלה).</li>
		<li>באמצעות פונקציית הממוצע עם התמונות המתקבלות על ידי הכפלת המסיכה הבינארית בתמונות של כל מסגרת כמשתני קלט, חשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בתוך החזר ההשקעה עבור כל מסגרת.</li>
		<li>כפי שתואר קודם לכן17, למשתנה המתקבל בשלב 4.4.3, יש להחיל את מסנן התדרים Butter worth בחיתוך = 1.6 שניות, לחיתוך רעש בתדר גבוה, ולאחר מכן להחיל את מסנן חציון הזזה בחלון הזמן = 200 שניות, לחיתוך רעש בתדר נמוך.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Andoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+reverses+behavioral+and+synaptic+abnormalities+after+maternal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation.</a> Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43-mediates+astroglial+metabolic+networks+contribute+to+the+regulation+of+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle.</a> Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).</li>
<li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+disrupt+mesolimbic+reward+circuitry+in+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain.</a> Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li>
<li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4, 27(2011).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Andoh, M., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+synaptic+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate synaptic development and plasticity.</a> Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).</li>
<li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li>
<li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).</li>
<li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglia+directly+monitor+the+functional+state+of+synapses+in+vivo+and+determine+the+fate+of+ischemic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals.</a> Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).</li>
<li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 10000527(2010).</li>
<li>Liu, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+network+activity+controls+microglial+process+surveillance+in+awake+mice+via+norepinephrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).</li>
<li>Kim, T. H., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+large-scale+neural+ensemble+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics.</a> Cell. 185 (1), 9-41 (2022).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).</li>
<li>Ohtsuki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+visual+selectivity+among+clonally+related+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex.</a> Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).</li>
<li>Maruoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Bernier, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surveillance+of+the+brain+by+microglia+via+cAMP-regulated+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia.</a> Cell Reports. 27 (10), 2895(2019).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+anesthesia-specific+alterations+in+microglial+surveillance+and+photodamage-directed+motility+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).</li>
<li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLife. 6, 26839(2017).</li>
<li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).</li>
<li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מתארים את הפרוטוקול של הזרקת AAV וקרניוטומיה להדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים, כמו גם עיבוד נתונים. טכניקה זו יכולה לחשוף את התיאום בין דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בסקאלות זמן הנעות בין תת-שנייה לעשרות שניות.
פרוטוקול הניתוח כולל מספר שלבים תובעניים מבחינה טכנית. הזרקת AAV היא אחד השלבים הקריטיים. הזרקת AAV לא מוצלחת עלולה לגרום לירידה משמעותית בביטוי של R-CaMP. ישנן שתי סיבות עיקריות: פיפטות זכוכית סתומות ונזק לרקמות. סתימת פיפטות זכוכית מפחיתה או חוסמת לחלוטין את פליטת תמיסת AAV. ניתן להימנע ממצב זה על ידי צביעת תמיסת AAV בצבע כגון ירוק מהיר ומאשר ויזואלית את הצלחת ההזרקה. נזק לרקמות הנגרם על ידי הזרקת AAV מונע ביטוי גנים אקסוגניים בסמוך למרכז אתר ההזרקה. הנזק שנגרם על ידי הזרקת AAV עשוי להיגרם על ידי עלייה פתאומית בשטף מקצה פיפטת הזכוכית לאחר הצטברות הלחץ בתוך הפיפטה. לכן, היציאה של תמיסת AAV מפיפטת הזכוכית צריכה להיות קבועה במהלך ההזרקה. בחירת פיפטות זכוכית בקוטר מעט רחב יותר בקצותיהן תפתור בעיה זו. בהשתלת חלון גולגולתי, מהירות הניתוח היא קריטית. אם הניתוח אורך זמן רב מדי, רקמת המוח עלולה להיפגע קשות. לפיכך, תרגול חוזר הוא הכרחי כדי להבטיח את המהירות ואת החלקות של הניתוח. בנוסף, במהלך 4 השבועות שבין הניתוח להדמיה, איכות ההדמיה עשויה להיפגע על ידי התחדשות רקמות בין חלון הגולגולת לרקמת המוח בשיטה הקונבנציונלית17. השיטה כאן מתגברת על בעיה זו על ידי יישום משקפיים עבים עבור דיסק הזכוכית הפנימי של חלונות הגולגולת כדי לעכב התחדשות רקמות ולשמור על החלון נקי. במערכת המתוארת כאן, השפעה זו ניכרה באמצעות דיסק זכוכית פנימי בעובי של 0.525 ± 0.075 מיקרומטר.
השיטה יכולה להיות מיושמת בהצלחה על עכברים מעל גיל 4 שבועות, אך היישום על עכברים צעירים עלול להיות בעייתי. בעכברים צעירים, הגולגולת מראה צמיחה מהירה ובולטת, מה שגורם לחוסר התאמה בין עצם הגולגולת לחלון הזכוכית.
בכמה מחקרים חדשניים, נעשה שימוש בדימות in vivo של שני פוטונים כדי לחקור אינטראקציות מיקרוגליה-נוירון 12,21,23. במיוחד בעבודה החלוצית של מרליני ואחרים, הם ביצעו סימולטני in vivo הדמיה של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בתוך גופי התא21. בשיטה זו, על ידי שימוש במשקפיים פנימיים עבים יותר עבור חלונות גולגולת, אנו יכולים לדכא ארטיפקטים תנועתיים בכיוון העומק ולהשיג מדידה יציבה של פעילות עצבית במיקרו-מבנים, כגון עמוד שדרה דנדריטי. שיטה זו תסייע לחקור אינטראקציות של תהליך סינפסה-מיקרוגליאה בעכברים ערים.
לאחרונה, מחקר במבחנה הראה כי לתהליכים מיקרוגליאליים דקים דמויי פילופודיה יש תנועתיות מהירה יותר מאשר תהליכים עבים, דבר המצביע על חשיבות תנועתיותם המהירה יותר במעקב19. המערכת כאן יכולה לעקוב אחר תנועתיות של תהליכים מיקרוגליאליים דקים ברזולוציה זמנית בין תת-שנייה לכמה עשרות שניות. מאפיין זה מסייע להבהיר את המשמעות הפונקציונלית של תנועתיותם למעקב in vivo.
בעתיד, השילוב של טכניקת הדמיה זו עם התערבויות, כגון אופטוגנטיקה24 או כימוגנטיקה25, המיושמות על מעגלים עצביים מקומיים או קשרים עצביים בין-אזוריים ישפוך אור על תפקודים מיקרוגליאליים חדשים בהתפתחות סינפטית ופלסטיות אשר מפסלים מאפיינים של מעגלים עצביים. כמו כן, שילוב נוסף של הדמיה, התערבות ומשימות התנהגותיות יתרום לחשיפת התיאום בין תאי מיקרוגליה ונוירונים העומדים בבסיס התנהגויות ספציפיות.

ישנן עדויות הולכות וגדלות לכך שהמצב הפנימי של הגוף משפיע כל הזמן על תפקודי המוח אצל בעלי חיים 1,2,3,4,5. לפיכך, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של תפקודי המוח, חיוני להבהיר כיצד תאי גלייה במוח מנטרים תנאים ביולוגיים בפריפריה ומעבירים את המידע לנוירונים.
מיקרוגליה, תאי מערכת החיסון במוח, מעורבים בהתפתחות סינפטית ובפלסטיות, אשר מפסלים מאפיינים של מעגלים עצביים במוח 6,7,8,9. לדוגמה, עבודתם החלוצית של Wake et al. הראתה כי תהליכים מיקרוגליאליים יוצרים מגע עם סינפסות באופן תלוי פעילות עצבית בניאוקורטקס של עכבר וכי איסכמיה מלאכותית גורמת לאובדן סינפסות בעקבות מגע ממושך עם מיקרוגליה10. טרמבליי ועמיתיו מצאו כי שינוי החוויה החזותית משנה את אופן האינטראקציה של מיקרוגליאה עם סינפסות. במהלך התקופה הקריטית שבה תחלופת עמוד השדרה הדנדריטי בקליפת המוח הראייתית הראשונית (V1) מוגברת על ידי חסך דו-עיני, הסתגלות כהה מפחיתה את תנועתיות התהליכים המיקרוגליאליים ומגדילה הן את תדירות המגע שלהם עם שסעים סינפטיים והן את מספר התכלילים התאיים במיקרוגליה11. תוצאות אלה מצביעות על כך שתהליכים מיקרוגליאליים חשים פעילות עצבית וסביבתם כדי לעצב מחדש מעגלים עצביים. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי מעקב מיקרוגליאה שונה בין תנאי ערות למצב של הרדמה, דבר המצביע על החשיבות של ניסויים בעכברים ערים לחקר תקשורת נוירון-מיקרוגליה בתנאים פיזיולוגיים12.
דימות סידן דו-פוטוני In vivo הוא כלי רב עוצמה לרישום דינמיקת סידן, המשקפת ירי עצבי מתמשך, במאות נוירונים בו זמנית בחיהחיה 13,14,15. דימות סידן בנוירונים דורש בדרך כלל רזולוציה טמפורלית של יותר מכמה הרץ כדי לעקוב אחר תגובות עצביות מהירות16,17. לעומת זאת, מחקרים קודמים שעקבו אחר דינמיקה של מיקרוגליה דגמו מבנים מיקרוגליאליים ברזולוציה טמפורלית נמוכה יחסית של פחות מ-0.1 הרץ18,19,20. מחקר שנערך לאחרונה יישם הדמיה סימולטנית של שני פוטונים כדי להבין תקשורת נוירון-מיקרוגליה21. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד תהליכים מיקרוגליאליים דינמיים מגיבים לפעילות העצבית הסובבת ברזולוציה זמנית של יותר מכמה הרץ בעכברים ערים. על מנת לטפל בבעיה זו, אנו מתארים שיטת הדמיה סימולטנית in vivo של שני פוטונים של פעילות עצבית ודינמיקה מיקרוגליאלית עם רזולוציה טמפורלית גבוהה מ-1 הרץ בעכברים ערים. שיטה זו מאפשרת לנו להשיג הדמיה יציבה בעכברים ערים בקצב פריימים גבוה יותר (מקסימום, 30 הרץ עם גודל מסגרת פיקסל של 512 x 512 פיקסלים) ומספקת דרך נוחה יותר לחקור את התנהגות המעקב של מיקרוגליה או את האינטראקציה שלהם עם פעילות עצבית בעכברים ערים.

<table><tbody><tr><td>צג LCD 10 אינץ'</td><td>EIZO</td><td>DuraVision FDX1003</td><td>להצגת גירויים חזותיים סורגים</td></tr><tr><td>26G מזרק המילטון</td> מחט <td>המילטון</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>27G</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>AAV-hSyn-R-CAMP1.07</td><td>N/A</td><td>N/A מתנה</td><td>באדיבות ממעבדתו של פרופ' מטסוזאקי&nbsp;</td></tr><tr><td>אבקת פחם פעיל</td><td>Nacalai tesque</td><td>07909-65</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום שחור</td><td>THORLABS</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-EGFP עכבר</td><td>מעבדה ג'קסון</td><td>IMSR_JAX: 005582</td><td>CX3CR-1EGFP/+ עכברי נוק-אין/נוק-אאוט המבטאים EGFP במיקרוגליה במוח תחת שליטת Cx3cr1 locus האנדוגני.</td></tr><tr><td>DENT SILICONE-V</td><td>Shofu Inc</td><td>N/A</td><td>לחיבור מכשיר הצללה לצלחת ראש</td></tr><tr><td>מלט דנטלי (שרף מהיר, נוזל)</td> <td>Shofu Inc</td><td>N/A</td><td>AB</td></tr><tr><td>מלט דנטלי (שרף מהיר, אבקה)</td> <td>Shofu Inc</td><td>N/A</td><td>B צבע 3</td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה נימית זכוכית</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>דיסק זכוכית (גדול)</td> <td>Matsunami</td><td>N/A</td><td>בקוטר 4 מ"מ, 0.15 ופלוסמן; עובי 0.02 מ"מ</td></tr><tr><td>דיסק זכוכית (קטן)</td> <td>Matsunami</td><td>N / A</td><td>בקוטר 2 מ"מ, 0.525 & plusmn; עובי 0.075 מ"מ</td></tr><tr><td>לוחית ראש</td><td>מותאמת אישית</td><td>N/A</td><td>חומר: SUS304, עובי: 0.5 מ"מ, ראה איור 2B לצורה</td></tr><tr><td>סיבים המוסטטיים</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ תוכנת</td><td></td> פיג'י <td>תוכנה חינמית</td><td>לרישום נתונים</td></tr><tr><td>דבק מיידי (ארון אלפא)</td> <td>Daiichi Sankyo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>אסטרזנקה</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 2017b</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>לרישום ועיבוד נתונים</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-100</td><td></td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ עירור רב-פוטוני</td><td>NIKON</td><td>N/A</td><td>השם המסחרי הוא "A1MP+".</td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית</td><td>NIKON</td><td>N/A</td><td>השם המסחרי הוא "CFI75 apochromat 25xC W".</td></tr><tr><td>פרפין נוזלי</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Psychtoolbox</td><td></td><td>תוכנה חינמית</td><td>להצגת גירויים חזותיים סורגים</td></tr><tr><td>מכשיר הצללה</td><td>מותאם אישית</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי</td><td>Narishige מכשיר מדעי</td><td>SR-611</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי</td><td>מותאם אישית</td><td>N/A</td><td>לקיבוע עכברים תחת מיקרוסקופ דו-פוטוני</td></tr><tr><td>Stopcock</td><td>ISIS</td><td>VXB1079</td><td></td></tr><tr><td>משי כירורגי</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>הליכון</td><td>מותאם אישית</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV חומר ריפוי אור</td><td>Norland Products Inc</td><td>NOA 65</td><td></td></tr><tr><td>וופורייזר</td><td>Penlon</td><td>Sigma Delta</td><td>מכונת הרדמה</td></tr></tbody></table>

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

מאחר שתפקודי המוח נמצאים תחת השפעה מתמשכת של אותות שמקורם ברקמות היקפיות, חיוני להבהיר כיצד תאי גלייה במוח חשים תנאים ביולוגיים שונים בפריפריה ומעבירים את האותות לנוירונים. מיקרוגליה, תאי מערכת החיסון במוח, מעורבים בהתפתחות סינפטית ובפלסטיות. לכן, תרומת תאי המיקרוגליה לבניית מעגלים עצביים בתגובה למצב הפנימי של הגוף צריכה להיבחן באופן ביקורתי על ידי הדמיה תוך-חיונית של הקשר בין דינמיקה מיקרוגליאלית לפעילות עצבית.
במאמר זה אנו מתארים שיטה לדימות סימולטני של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים. וירוס הקשור באדנו המקודד R-CaMP, אינדיקטור סידן מקודד גן של חלבון פלואורסצנטי אדום, הוזרק לשכבה 2/3 של קליפת המוח הראייתית העיקרית בעכברים טרנסגניים CX3CR1-EGFP המבטאים EGFP במיקרוגליה. לאחר הזרקה ויראלית, חלון גולגולת הותקן על פני המוח של האזור המוזרק. הדמיית שני פוטונים In vivo בעכברים ערים 4 שבועות לאחר הניתוח הראתה כי פעילות עצבית ודינמיקה מיקרוגליאלית יכולות להיקלט בו זמנית ברזולוציה טמפורלית של תת-שנייה. טכניקה זו יכולה לחשוף את התיאום בין דינמיקה מיקרוגליאלית לבין פעילות עצבית, כאשר הראשון מגיב למצבים אימונולוגיים היקפיים והאחרון מקודד את מצבי המוח הפנימיים.

ביצענו הזרקת AAV והשתלת חלון גולגולת ב-V1 של עכבר מהונדס CX3XR1-EGFP בן 8 שבועות כמתואר בפרוטוקול זה. ארבעה שבועות לאחר הניתוח ביצענו סימולטני in vivo הדמיה של שני פוטונים של פעילות עצבית מבוססת R-CaMP ודינמיקה מיקרוגליאלית בשכבה 2/3 של V1 (איור 4 ווידאו 1). במהלך ההדמיה, העכבר הונח על הליכון והורשה לרוץ בחופשיות. התמונות נרכשו בקצב פריימים של 30 הרץ עם רזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרומטר לפיקסל באמצעות מטרות 25x, 1.1 NA ו- GaAsP PMTs. הן EGFP והן R-CaMP היו מעוררים באורך גל של 1,000 ננומטר, ופלואורסצנטיות EGFP (מסנן פליטה של 525/50 ננומטר) ופלואורסצנטיות R-CaMP (מסנן פליטה של 593/46 ננומטר) נאספו בו זמנית. לאחר רישום הנתונים שנרכשו כדי למזער את תוצרי התנועה, כל ארבע פריימים הוערכו בממוצע למסגרת אחת כדי להפחית את רעשי הרקע. גירויים חזותיים מגרגרים הוצגו לעכבר, והתגובות החזותיות של תאי עצב ועמוד שדרה דנדריטי בודד נותחו (איור 4D). תהליכי מיקרוגליאה הראו דינמיקה מהירה ושינו את המורפולוגיה שלהם תוך 10 שניות (איור 4E ווידאו 1). כפי שמפורט בסעיף הדיון, כאשר הזרקת AAV נכשלה, לא ניתן היה לזהות את הביטוי של R-CaMP. אם הניתוח לא הצליח, לא ניתן היה להבחין באותות של EGFP ו- R-CaMP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig01.jpg"> איור 1: הזרקת AAV . (A) פיפטת זכוכית חוברה למזרק המילטון 26 גרם באמצעות צינור סיליקון. (B) ההגדרה להזרקת AAV. (C) תמיסת AAV הוזרק דרך פיפטת זכוכית המוטה 60° קדימה מהציר האנכי. (D) תרשים סכמטי של הליך הגולגולת הפתוחה (המתואר בשלב 3.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig02v2.jpg"> איור 2: חלון גולגולת ולוחית ראש . (A) תרשים סכמטי של השתלת חלון גולגולתי. (ב) נעשה שימוש בלוחיות ראש בהתאמה אישית. עבור הדמיה בהמיספרה הימנית, יש להשתמש בזרוע הקצרה יותר בצד ימין. (C) מבט גבי של עכבר עם חלון גולגולת ולוחית ראש מושתלת. (D) מבט בהגדלה גבוהה של חלון הגולגולת המוצג באיור 2C. (E) מבט גבי של עכבר הקבוע במכשיר סטריאוטקסי בהתאמה אישית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig03.jpg"> איור 3: ההכנה לדימות in vivo של שני פוטונים. (A) מבט גבי על התקן הצללה. (B) מבט מהצד על התקן הצללה. (C) מבט על עכבר עם התקן ההצללה על לוחית הראש מתחת לעדשת המטרה. העכבר מונח על ההליכון. (D) מבט תחת מיקרוסקופ עירור שני פוטונים. צג המציג גירויים חזותיים ממוקם בצד ימין של הדמות. עדשת האובייקט מכוסה במכשיר ההצללה ובנייר אלומיניום שחור כדי למנוע אור מהצג לעדשת האובייקט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64111/64111fig04.jpg"> איור 4: דינמיקה של מיקרוגליה ותגובות חזותיות בעמוד שדרה דנדריטי. (A-C) תמונות ממוצעות בזמן של תאי מיקרוגליה מסוג EGFP (+) ותאי עצב מסוג R-CaMP(+) בשכבה 2/3 של V1 בעכבר מהונדס CX3XR1-EGFP בן 12 שבועות. עוצמת האות בכל ערוץ נורמלה באופן עצמאי. (D) תגובות חזותיות בעמוד השדרה הדנדריטי. דיאגרמות פסים עם חצים שחורים מציינות את כיוון הגירויים הסורגים המוצגים בתזמון המצוין על ידי עמודות אפורות. אצל עקבות סידן, קווים אפורים מציינים תגובות אינדיבידואליות, וקו שחור מציין את הממוצע שלהן. בכניסה הימנית, ראש חץ צהוב מציין את עמוד השדרה הדנדריטי שבו נוצר אזור העניין (ROI) כדי לרכוש את עקבות הסידן. (E) תהליך מיקרוגליה (ראש חץ ציאן) הראה נסיגה מהירה תוך 10 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/64111fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: הדמיה של שני פוטונים של פעילות עצבית ודינמיקה מיקרוגליאלית. נתוני הדמיה של תאי עצב מסוג EGFP(+) ותאי עצב מסוג R-CaMP(+) בשכבה 2/3 של V1 בעכבר מהונדס CX3XR1-EGFP בן 12 שבועות. בצד שמאל של הסרט, מגנטה מציינת R-CaMP בתאי עצב, וירוק מציין EGFP במיקרוגליה. מרכז הסרט מתאים לאות EGFP, והצד הימני מתאים לאות R-CaMP. עוצמת האות בכל ערוץ נורמלה באופן עצמאי. קצב הפריימים של הסרט מהיר פי 40 מהקצב בפועל. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64111/220330CatMovieForJoVE_IntNormalized-2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.</a>

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לחקור את התנהגות המעקב של מיקרוגליה או את האינטראקציה עם נוירונים. היתרון של שיטה זו הוא כי חפצי תנועה אינם מזהמים בקלות נתוני הדמיה בגלל קיבוע ראש חזק.כמו כן, שחזור לאחר הדמיה בקצב פריימים גבוה מאפשר לנו לחסל חפץ תנועה מהנתונים. בשיטה זו, הזרקת AAV וניתוח השתלת חלון גולגולתי הם תובעניים מבחינה טכנית. כישלון נפוץ בהתחלה, אז בבקשה אל תהיו מתוסכלים ותתאמנו יותר.כדי להכין את מכשיר ההזרקה, הניחו פיפטה מזכוכית המחוברת למזרק המילטון בעל 26 מד דרך צינור על מחזיק פיפטה של מכשיר סטריאוטקסי. לאחר מכן, הטה את מחזיק פיפטה 60 מעלות קדימה מן הציר האנכי. ממלאים את פיפטת הזכוכית, את המזרק ואת צינור החיבור בפרפין נוזלי ומניחים את המזרק על מיקרו-מזרק.לנהל שיכוך כאבים לעכבר מורדם ולחבר את מוטות האוזן עזר. לאחר מכן, תקן את החיה על המכשיר הסטריאוטקסי עם הצד הגבי שלה כלפי מעלה. לאחר הסרת שיער מאתר הניתוח וחיטוי אזור הניתוח, בצעו חתך באורך שני סנטימטרים בקרקפת לאורך קו האמצע, מה שמבטיח חשיפה טובה של הגולגולת מעל קליפת המוח הראייתית הראשונית הימנית.השתמש במלקחיים כדי להסיר את periosteum על הגולגולת החשופה. קדח את הגולגולת על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות שלושה מילימטרים לרוחב לקו האמצע ו -5 מיליליטר קדמי לקו הלמדא כדי ליצור חור קטן בקוטר של כ -0.5 מילימטרים. לאחר מכן, הניחו פיסת סרט שקוף בגודל של כשני סנטימטרים על שני סנטימטרים על גולגולתו החשופה של העכבר.להוציא מיקרוליטר אחד של טיפת תמיסת AAV על הסרט באמצעות פיטר. מקדמים את המזרק. ומניחים קצה פיפטה מזכוכית לתוך טיפת תמיסת AAV על הסרט ומושכים בעדינות את המזרק כדי לשאוף את תמיסת ה- AAV.לאחר מכן, הכנס את פיפטת הזכוכית לעומק של 500 מיקרומטר מפני השטח של המוח דרך החור שנוצר בגולגולת. לאחר מכן, הזריקו 0.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV באמצעות המיקרו-מזרק בקצב זרימה של נפח הזרקה של שני מיקרוליטרים לשעה. למשוך את המחט ולשטוף את פני המוח עם מלוחים.צור חריץ עגול לאורך הסימן על הגולגולת על ידי קידוח. נקו את הלכלוך כדי להבטיח ראות של הגולגולת ומרחו מי מלח למניעת חימום במהלך הקידוח. לחץ בעדינות על הגולגולת המרכזית עם מלקחיים.עומק הקידוח מספיק אם הוא נע אנכית עם התנגדות מועטה. כאשר החריץ מגיע לעומק מספיק, הכנס את קצה המלקחיים לתחתית שבר הגולגולת המרכזי. הרימו והסירו אותו בעדינות כדי לחשוף את פני השטח של המוח.באמצעות מחט של 27 מד, דוקרים וקורעים את הדורה בקצה משטח המוח החשוף. הכניסו את קצה המלקחיים דרך החור שנוצר בקצה הדורה וקילפו אותו כדי לחשוף את פני השטח של המוח. לאחר פיזור סיבים המוסטטיים בזה אחר זה במי מלח, מניחים את הסיבים ההמוסטטיים לאורך שולי החור שבו נמצאת הדורה הטרנסקטית.הניחו את חלון הגולגולת על משטח המוח החשוף ולאחר מכן הדביקו אותו לגולגולת עם דבק מיידי תוך לחיצה עדינה על החלון. לאחר מכן, מרחו דבק מיידי על כל הגולגולת החשופה. לאחר מכן, חברו בזהירות לוחית ראש לגולגולת כדי לאתר את חלון הגולגולת במרכז החור המרובע של לוחית הראש.לאחר שהדבק התקשה מספיק, מרחו מלט דנטלי על הגולגולת החשופה כדי לחזק את החיבור בין הראש ללהב הראש. כדי להתקין את התקן ההצללה בהתאמה אישית וצג LCD לגירוי חזותי, מקם תחילה את העדשה כך שתתמקד על פני השטח של המוח ולאחר מכן הגדר מיקום עדשה זה כמיקום Z המקורי. שמור על קואורדינטות XY קבועות והרם את עדשת המטרה.הסר את העכבר ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעדשה האובייקטיבית. חברו מכשיר הצללה בחלק העליון של לוחית הראש באמצעות סיליקון, וודאו שהרווח בין לוחית הראש למכשיר ההצללה אטום היטב. מלאו את מכשיר ההצללה במים מזוקקים.לאחר מכן, תקן את העכבר עם המסגרת הסטריאוטקסית מתחת לעדשה האובייקטיבית. אפסו בזהירות את מישור המוקד על פני המוח, בדקו את עומק עדשת המטרה. כסה את עדשת האובייקט ברדיד אלומיניום שחור כדי למנוע זיהום אור מצג ה- LCD.הגדר צג LCD בגודל 10 אינץ' בגודל 12.5 ס"מ מול עיני העכבר כדי להציג גירויים חזותיים. הגדר את מסנני איסוף ההגשה הפלואורסצנטיים עבור EGFP ו- R-CaMP ואת אורך גל העירור ל- 1, 000 ננומטר. קבל תמונות ברזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרון לפיקסל.מצא את אזור ההדמיה שבו נוירונים חיוביים R-CaMP ומיקרוגליה חיובית EGFP ניתן לצלם בו זמנית. בשכבה 2, 3. רכוש תמונות בקצב מסגרות של 30 הרץ.במקביל לרכישת התמונה, הציגו גירויים חזותיים נודדים לעכבר ב-12 כיוונים בשישה כיוונים, מאפס ל-150 מעלות בצעדים של 30 מעלות. לאחר רכישת התמונה, הסר את העכבר משלב המיקרוסקופ. נתקו את מכשיר ההצללה ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעכבר, והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.באמצעות פרוטוקול זה, הזרקת AAV והשתלת חלון גולגולתי בוצעו בקליפת המוח הראייתית העיקרית של עכבר מהונדס בן שמונה שבועות, ולאחר מכן שני דימות פוטונים של פעילות עצבית מבוססת R-CaMP ודינמיקה מיקרוגליאלית בשכבה 2, 3. גירויים חזותיים מגרגרים הוצגו לעכבר והתגובות החזותיות בעמוד השדרה האדנדריטי נותחו באמצעות עקבות סידן. תהליכי מיקרוגליאה הראו דינמיקה מהירה ושינו את המורפולוגיה שלהם תוך 10 שניות.באמצעות דימות של שני פוטונים בשכבה 2, 3 של קליפת המוח הראייתית הראשונית בעכבר מהונדס בן 12 שבועות, R-CaMP נצפה בנוירונים, שנראה כאן במגנטה. EGFP נצפה במיקרוגליה, נראה בירוק. אותות בודדים נצפו גם עבור EGFP ו- R-CaMP.הזרקת AAV מוצלחת היא קריטית לשיטה זו. הסיבות העיקריות להזרקת AAV כושלת הן פיפטות זכוכית השעון והנזק לרקמות. התנהגות המעקב אחר תאי מיקרוגליה והאינטראקציה של תאי המיקרוגליה של סנאפ זוהו כנפוצים במנגנונים פתוגניים שונים, כמו מחלת אלצהיימר.השיטה שלנו מועילה למחקר המתמקד בתחום זה.

simultaneous-imaging-microglial-dynamics-neuronal-activity-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

מקור: Kamei, R., et. al., In vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את תהליך ההתקנה וההדמיה של מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס CA1 (Cornu ammonis 1) ובפיתול המשונן, מה שמבטיח יישור אופטי אופטי והערכת שלמות מבנית.

הדמיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

שיטה זו יוצרת סביבה מוחשית, מוכרת לעכבר כדי לנווט ולחקור במהלך הקלטות מיקרוסקופיות הדמיה או תא בודד אלקטרו, אשר דורשות קיבוע איתן של ראשו של בעל החיים.

פלטפורמה הרימה-Air-מרוצף שטוחה: שיטה חדשה לשילוב עם התנהגות מיקרוסקופית או אלקטרופיזיולוגיה על Awake לנוע בחופשיות מכרסמים

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

מאמר זה מדגים את הכנת חלון הדמיה בהתאמה אישית בתוספת קנולה עירוי והשתלתו על אזור CA1 של ההיפוקמפוס בעכברים.

הליך גולגולתי להדמיית פעילויות עצביות בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.

הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

למדו הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים באמצעות חלון קרניאלי וזריקת AAV. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים בזמן אמת תוך מזעור חפצי תנועה.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

גלה סרטונים נוספים