הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים
23 באוגוסט 2022
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.
הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לחקור את התנהגות המעקב של מיקרוגליה או את האינטראקציה עם נוירונים. היתרון של שיטה זו הוא כי חפצי תנועה אינם מזהמים בקלות נתוני הדמיה בגלל קיבוע ראש חזק.
כמו כן, שחזור לאחר הדמיה בקצב פריימים גבוה מאפשר לנו לחסל חפץ תנועה מהנתונים. בשיטה זו, הזרקת AAV וניתוח השתלת חלון גולגולתי הם תובעניים מבחינה טכנית. כישלון נפוץ בהתחלה, אז בבקשה אל תהיו מתוסכלים ותתאמנו יותר.
כדי להכין את מכשיר ההזרקה, הניחו פיפטה מזכוכית המחוברת למזרק המילטון בעל 26 מד דרך צינור על מחזיק פיפטה של מכשיר סטריאוטקסי. לאחר מכן, הטה את מחזיק פיפטה 60 מעלות קדימה מן הציר האנכי. ממלאים את פיפטת הזכוכית, את המזרק ואת צינור החיבור בפרפין נוזלי ומניחים את המזרק על מיקרו-מזרק.
לנהל שיכוך כאבים לעכבר מורדם ולחבר את מוטות האוזן עזר. לאחר מכן, תקן את החיה על המכשיר הסטריאוטקסי עם הצד הגבי שלה כלפי מעלה. לאחר הסרת שיער מאתר הניתוח וחיטוי אזור הניתוח, בצעו חתך באורך שני סנטימטרים בקרקפת לאורך קו האמצע, מה שמבטיח חשיפה טובה של הגולגולת מעל קליפת המוח הראייתית הראשונית הימנית.
השתמש במלקחיים כדי להסיר את periosteum על הגולגולת החשופה. קדח את הגולגולת על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות שלושה מילימטרים לרוחב לקו האמצע ו -5 מיליליטר קדמי לקו הלמדא כדי ליצור חור קטן בקוטר של כ -0.5 מילימטרים. לאחר מכן, הניחו פיסת סרט שקוף בגודל של כשני סנטימטרים על שני סנטימטרים על גולגולתו החשופה של העכבר.
להוציא מיקרוליטר אחד של טיפת תמיסת AAV על הסרט באמצעות פיטר. מקדמים את המזרק. ומניחים קצה פיפטה מזכוכית לתוך טיפת תמיסת AAV על הסרט ומושכים בעדינות את המזרק כדי לשאוף את תמיסת ה- AAV.
לאחר מכן, הכנס את פיפטת הזכוכית לעומק של 500 מיקרומטר מפני השטח של המוח דרך החור שנוצר בגולגולת. לאחר מכן, הזריקו 0.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV באמצעות המיקרו-מזרק בקצב זרימה של נפח הזרקה של שני מיקרוליטרים לשעה. למשוך את המחט ולשטוף את פני המוח עם מלוחים.
צור חריץ עגול לאורך הסימן על הגולגולת על ידי קידוח. נקו את הלכלוך כדי להבטיח ראות של הגולגולת ומרחו מי מלח למניעת חימום במהלך הקידוח. לחץ בעדינות על הגולגולת המרכזית עם מלקחיים.
עומק הקידוח מספיק אם הוא נע אנכית עם התנגדות מועטה. כאשר החריץ מגיע לעומק מספיק, הכנס את קצה המלקחיים לתחתית שבר הגולגולת המרכזי. הרימו והסירו אותו בעדינות כדי לחשוף את פני השטח של המוח.
באמצעות מחט של 27 מד, דוקרים וקורעים את הדורה בקצה משטח המוח החשוף. הכניסו את קצה המלקחיים דרך החור שנוצר בקצה הדורה וקילפו אותו כדי לחשוף את פני השטח של המוח. לאחר פיזור סיבים המוסטטיים בזה אחר זה במי מלח, מניחים את הסיבים ההמוסטטיים לאורך שולי החור שבו נמצאת הדורה הטרנסקטית.
הניחו את חלון הגולגולת על משטח המוח החשוף ולאחר מכן הדביקו אותו לגולגולת עם דבק מיידי תוך לחיצה עדינה על החלון. לאחר מכן, מרחו דבק מיידי על כל הגולגולת החשופה. לאחר מכן, חברו בזהירות לוחית ראש לגולגולת כדי לאתר את חלון הגולגולת במרכז החור המרובע של לוחית הראש.
לאחר שהדבק התקשה מספיק, מרחו מלט דנטלי על הגולגולת החשופה כדי לחזק את החיבור בין הראש ללהב הראש. כדי להתקין את התקן ההצללה בהתאמה אישית וצג LCD לגירוי חזותי, מקם תחילה את העדשה כך שתתמקד על פני השטח של המוח ולאחר מכן הגדר מיקום עדשה זה כמיקום Z המקורי. שמור על קואורדינטות XY קבועות והרם את עדשת המטרה.
הסר את העכבר ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעדשה האובייקטיבית. חברו מכשיר הצללה בחלק העליון של לוחית הראש באמצעות סיליקון, וודאו שהרווח בין לוחית הראש למכשיר ההצללה אטום היטב. מלאו את מכשיר ההצללה במים מזוקקים.
לאחר מכן, תקן את העכבר עם המסגרת הסטריאוטקסית מתחת לעדשה האובייקטיבית. אפסו בזהירות את מישור המוקד על פני המוח, בדקו את עומק עדשת המטרה. כסה את עדשת האובייקט ברדיד אלומיניום שחור כדי למנוע זיהום אור מצג ה- LCD.
הגדר צג LCD בגודל 10 אינץ' בגודל 12.5 ס"מ מול עיני העכבר כדי להציג גירויים חזותיים. הגדר את מסנני איסוף ההגשה הפלואורסצנטיים עבור EGFP ו- R-CaMP ואת אורך גל העירור ל- 1, 000 ננומטר. קבל תמונות ברזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרון לפיקסל.
מצא את אזור ההדמיה שבו נוירונים חיוביים R-CaMP ומיקרוגליה חיובית EGFP ניתן לצלם בו זמנית. בשכבה 2, 3. רכוש תמונות בקצב מסגרות של 30 הרץ.
במקביל לרכישת התמונה, הציגו גירויים חזותיים נודדים לעכבר ב-12 כיוונים בשישה כיוונים, מאפס ל-150 מעלות בצעדים של 30 מעלות. לאחר רכישת התמונה, הסר את העכבר משלב המיקרוסקופ. נתקו את מכשיר ההצללה ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעכבר, והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.
באמצעות פרוטוקול זה, הזרקת AAV והשתלת חלון גולגולתי בוצעו בקליפת המוח הראייתית העיקרית של עכבר מהונדס בן שמונה שבועות, ולאחר מכן שני דימות פוטונים של פעילות עצבית מבוססת R-CaMP ודינמיקה מיקרוגליאלית בשכבה 2, 3. גירויים חזותיים מגרגרים הוצגו לעכבר והתגובות החזותיות בעמוד השדרה האדנדריטי נותחו באמצעות עקבות סידן. תהליכי מיקרוגליאה הראו דינמיקה מהירה ושינו את המורפולוגיה שלהם תוך 10 שניות.
באמצעות דימות של שני פוטונים בשכבה 2, 3 של קליפת המוח הראייתית הראשונית בעכבר מהונדס בן 12 שבועות, R-CaMP נצפה בנוירונים, שנראה כאן במגנטה. EGFP נצפה במיקרוגליה, נראה בירוק. אותות בודדים נצפו גם עבור EGFP ו- R-CaMP.
הזרקת AAV מוצלחת היא קריטית לשיטה זו. הסיבות העיקריות להזרקת AAV כושלת הן פיפטות זכוכית השעון והנזק לרקמות. התנהגות המעקב אחר תאי מיקרוגליה והאינטראקציה של תאי המיקרוגליה של סנאפ זוהו כנפוצים במנגנונים פתוגניים שונים, כמו מחלת אלצהיימר.
השיטה שלנו מועילה למחקר המתמקד בתחום זה.
סקירה כללית
מחקר זה מתווה פרוטוקול המשלב הזרקה של נגיף אסוציאטיבי-אדנו (AAV) עם השתלת חלון גולגולתי, כדי לאפשר דימות סימולטני של דינמיקה של מיקרוגליה ושל פעילות נוירונלית בעכברים ערים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון את התנהגות הניטור של המיקרוגליה ואת האינטראקציות שלהן עם נוירונים, תוך מזעור של ארטיפקטים של תנועה במהלך הדימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- דימות מוחי
- נוירוביולוגיה
רקע
- מיקרוגליה ממלאת תפקיד חיוני בבריאות המוח ובמחלות שלו.
- דימיון בזמן אמת של דינמיקת המיקרוגליה הוא קריטי להבנת תפקודיה.
- AAV משמש באופן נפוץ להעברת חומר גנטי ביישומים של מדעי העצב.
- קיבוע ראש בעכברים ערים מפחית ארטיפקטים של תנועה במהלך הדימיון.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לדימות אינטראקציה בין מיקרוגליה לנוירונים.
- שיפור ההבנה של הדינמיקה של מיקרוגליה ושל הפעילות הנוירונלית בתנאים פיזיולוגיים.
- מיזעור זיהום נתונים כתוצאה מארטפקטים של תנועה במהלך הדימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרוטוקול כולל הזרקת AAV והשתלת חלון גולגולתי בקליפת המוח הוויזואלית הראשונית בעכברים ערים.
- המודל הביולוגי מורכב מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים.
- שלבים מרכזיים כוללים קואורדינטות סטראאוטקסיות מדויקות להזרקה והליכים כירורגיים להצבת החלון הגולגולתי.
- הדימוי בוצע באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית בקצב פריימים של 30 Hz.
- עקבות סידן מנוירונים וממיקרוגליה נותחו בתגובה לגירויים ויזואליים.
תוצאות עיקריות
- נדעו דינמיקות מהירות בתהליכי המיקרוגליה, אשר שינו את המורפולוגיה שלהם בתוך 10 שניות.
- דימוג סימולטני חשף פעילות נוירונלית ודינמיקות של מיקרוגליה בתגובה לגירויים חזותיים.
- הפרוטוקול תיקף את היעילות של AAV וחלונות קרניאליים לצורך דימוג באיכות גבוהה.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים, ומספקת תובנות לגבי דינמיקה מוחית.
- המחקר תורם כלים בעלי ערך להבנת התפקידים של מיקרוגליה במנגנונים נוירונליים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול חקירה של השפעותיהם של התערבויות שונות על פעילות מיקרוגליאלית ונוירונלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות סימולטני של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות נוירונלית בעכברים ערים מאפשר בחינה ישירה של אינטראקציות נוירו-אימונולוגיות ברזולוציה של תא בודד. יכולת זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובביטחון ניבויי בתיקוף מוקדם של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS), במיוחד עבור מודלים של מחלות נוירו-דלקתיות ומחלות נוירו-דגנרטיביות. שילוב של קריאות גליאליות-נוירונליות בזמן אמת מקדם החלטות לגבי תיק המטרות על ידי הבהרת מעורבות הנתיבים ותוצאות תפקודיות במערכות רלוונטיות מבחינה תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים תחת תנאים פיזיולוגיים ובתנאי גרייה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור דינמיקת תאי מערכת החיסון לפעילות נוירונלית in vivo.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור היפותזות של דלקת עצבית ופלסטיות סינפטית.
- משפר את הביטחון החזוי לגבי מעורבות מטרות ב-CNS ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקימה מערכות דימות in vivo שעברו תיקוף להערכה כמותית של תגובות עצביות ומיקרוגליאליות.
- מספקת מערכי נתונים הניתנים לשחזור עם מינימום ארטיפקטים של תנועה לצורך ניתוח וסריקה בהמשך.
- מאפשרת סטנדרטיזציה של פרוטוקולי גירוי חזותי ופרמטרי דימות לפיתוח בדיקות (assays).
- תומכת בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על אינטראקציות נוירו-אימוניות.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים למנגנונים נוירו-אימונולוגיים הרלוונטיים למחלה הנצפים בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית בבני אדם.
- מאפשרת רצף משלב הגילוי דרך התיקוף הפרה-קליני באמצעות מעקב אחר תגובות תאיות דינמיות.
- תומכת בקידום מותאם-סיכון של תוכניות למודולציה סינפטית ולנוירו-דלקת.
- מספקת מועמדים לסמנים ביולוגיים תרגומיים המבוססים על דפוסי פעילות תאית בזמן אמת.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול דימוי זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לבחינה מבוססת השערות של אינטראקציות נוירו-אימוניות בעכברים ערים ובמצב של התנהגות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על השגחה של מיקרוגליה ואיתות בין נוירונים לגליה בתגובה לגירויים פריפריאליים ומרכזיים.
- סריקה: מספק פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור המתאימים למחקרי הפרעה גנטית או תרכובות.
- אנליטיקה: מספק עקבות סידן ברזולוציה גבוהה ונתונים מורפולוגיים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמה למנגנונים רלוונטיים למחלה ופיתוח סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת דימות in vivo הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למטרות והתערבויות שונות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של דימות in vivo וצמצום ארטיפקטים של תנועה לקבלת נתונים הדירים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וקידום יעיל של תוכניות נוירו-אימונולוגיות מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של נכסי CNS בהתבסס על ראיות פונקציונליות in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בניתוח סטריאוטקסי, הזרקת AAV והשתלת חלון גולגולתי.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה דו-פוטונית ולתשתית דימות מתקדמת.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי דימות וניתוח נתונים בין הצוותים השונים.
- ניתן להתאמה לאזורי מוח שונים ולמודלים טראנסגניים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- שיעורי הכשלון הטכני הראשוניים עשויים להיות גבוהים; המיומנות משתפרת עם תרגול וניסיון.
