Name: פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למד ליצור קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9 בתיווך נגיף לנטי. שיטה זו מאפשרת חקר מהיר ויעיל של תפקוד גנים בשריר ללא צורך ביצירת בעלי חיים נוק-אאוט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מטעם האגודה הצרפתית contre les myopathies (AFM-Téléthon) ומ-Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
<li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutics%3A+current+challenges+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li>
<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li>
<li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li>
<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+%28p.Y4864H%29+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li>
<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

צעד מרכזי בדרך לאפיון גנים בעלי תפקוד לא ידוע המעורבים בפתולוגיות הוא פיתוח מודלים תאיים רלוונטיים לחקר תפקודם של גנים אלה. השימוש בעריכת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 הוא תחום מחקר הולך וגדל באופן אקספוננציאלי, ופיתוח מודלים של נוק-אאוט כפי שהוצגו כאן הוא בין היישומים הנפוצים ביותר שלו. בהקשר זה, אנו מציעים כאן פרוטוקול רב-תכליתי לפיתוח נוק-אאוט של קו תאים אנושיים בכל גן בעל עניין, המאפשר אפיון של גן זה במודל תא אנושי רלוונטי. הפרוטוקול המוצג כאן יכול לשמש במיובלסטים מונצחים כמו גם ב- iPSC, ולכן יכול למעשה לגרום לייצור של כל...

עם התקדמות ריצוף הגנים וזיהוי מוטציות בגנים בעלי תפקודים לא ידועים ברקמה מסוימת, פיתוח מודלים תאיים רלוונטיים להבנת תפקודו של גן מטרה חדש ולאישור מעורבותו במנגנונים הפתופיזיולוגיים הקשורים מהווה כלי חיוני. בנוסף, מודלים אלה הם בעלי חשיבות עליונה לפיתוחים טיפוליים עתידיים 1,2, ומהווים חלופה מעניינת לפיתוח מודלים של בעלי חיים נוק-אאוט בקו ישר עם ההמלצות הבינלאומיות לצמצום השימוש בבעלי חיים בניסויים. עריכת גנים באמצעות CRISPR/Cas9 היא בין הכלים החזקים ביותר הקיימים כיום, מה שאיפשר פיתוח של מודלים רבים של נוק-אאוט/נוק-אין, ואימות גנים ממוקד באמצעות CRISPR/Cas9 הוא בין היישומים הנפוצים ביותר של CRISPR/Cas93. ההצלחה של עריכת גנים נשענת על היכולת להכניס את כלי הקריספר (הרנ"א המנחים והנוקלאז Cas9) במודל תאי המטרה, מה שיכול להוות אתגר בתאים רבים שקשה לבצע טרנספקט, כגון תאי שריר4. ניתן להתגבר על אתגר זה באמצעות שימוש בנגיף, בדרך כלל lentivirus, שיש לו את היתרון הגדול להתמר ביעילות סוגי תאים רבים ולספק את הטרנסג'ן שלו. אבל החיסרון העיקרי שלה הוא השילוב של הטרנסגן בגנום של התא המארח, מה שמוביל לשינוי פוטנציאלי של גנים הממוקמים באתר האינטגרציה ולביטוי הקבוע של הטרנסגן, שבמקרה של הנוקלאז Cas9 יגרום לתוצאות מזיקות5. פתרון חכם הוצע על ידי מריאן ועמיתיו6, המורכב מהכנסה לתאים של רנ"א מנחה המכוון לגן Cas9 עצמו, מה שמוביל להשבתת Cas9. התאמה של אסטרטגיה זו מוצגת כאן כפרוטוקול ידידותי למשתמש ורב-תכליתי המאפשר לדפוק כמעט כל גן בתאים קשים להעברה.
מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לגרום להשבתה של גן בעל עניין בתאי שריר מונצחים. ניתן להשתמש בו כדי להפיל כל גן בעל עניין, בסוגים שונים של תאים מונצחים. הפרוטוקול המתואר כאן מכיל שלבים לתכנון הרנ"א המנחים ושיבוטם לפלסמידים לנטי-ויראליים, לייצור כלי הקריספר בווקטורים לנטי-ויראליים, להתמרת התאים עם נגיפי הלנטי-וירוסים השונים, ולשיבוט התאים כדי לייצר קו תאים ערוך הומוגני.
באמצעות פרוטוקול זה, פותחו תאי שרירי שלד אנושיים מונצחים עם מחיקה של קולטן ריאנודין מסוג 1 (RyR1), תעלת סידן חיונית המעורבת בשחרור סידן תוך תאי ובהתכווצות שרירים7. הנוק-אאוט (KO) של הגן אושר ברמת החלבון באמצעות כתם מערבי, וברמה התפקודית באמצעות הדמיית סידן.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד CACNA1S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>CalPhos ערכת טרנספקציה של יונקים</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>ערכת טרנספקציה</td></tr><tr><td>כתם קל נגד עכבר IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP נוגדן משני</td></tr><tr><td>כתם קל נגד ארנב IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP נוגדן משני</td></tr><tr><td>Fluo-4 בדיקות</td><td>מולקולריות</td> ישירות <td>F10472</td><td>הדמיית סידן</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) ארנב mAb&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> <td>#2118</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>ערכת קשירה</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity עם GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix לתגובת PCR עם נאמנות גבוהה Taq פולימראז ו-dNTPs</td></tr><tr><td>נוגדן שרשרת כבדה מיוזין</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; </td><td>ערכת הכנה 740424 Maxi לטיהור פלסמידים</td></tr><tr><td>ג'ל NucleoSpin וניקוי PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>טיהור DNA</td></tr><tr>ערכת <td>740952</td><td>רקמות NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>למיצוי DNA</td></tr><tr><td>מתא One Shot Stbl3 מוכשר כימית&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>תאים מוכשרים כימית</td></tr><tr><td>פלסמיד #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>פלסמיד לנטי-ויראלי המקודד את ה-SpCas9 (עבור LV-Cas9)</td></tr> <tr><td>פלסמיד #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>עמוד שדרה לנטי-ויראלי להכנסת קלטת עם מדריכים (עבור LV-guide-target)</td></tr> <tr><td>פלסמיד #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>פלסמיד לנטי-ויראלי המקודד אריזה לנטיוויראלית GAG POL</td></tr><tr><td>פלסמיד #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>חלבון מעטפת המקודד פלסמיד לנטי-ויראלי לייצור חלקיקים רטרו-ויראלים ו-MuLV</td></tr><tr><td>V5 Tag נוגדן חד-שבטי</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>XL10-Gold תאים אולטרה-מוכשרים</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>תאים מוכשרים כימית</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr></tbody></table>

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/cas9 בתיווך נגיף לנטי

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

יישום חשוב אחד של חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/Cas 9 הוא פיתוח של קווי תאים נוק-אאוט, במיוחד כדי לחקור את תפקודם של גנים/חלבונים חדשים הקשורים למחלה, שזוהו במהלך האבחון הגנטי. לצורך פיתוח קווי תאים כאלה, יש להתיר שתי סוגיות עיקריות: החדרת כלי הקריספר (ה-Cas9 וה-RNA המנחה) ביעילות גבוהה לתאים שנבחרו, והגבלת פעילות ה-Cas9 למחיקה הספציפית של הגן הנבחר. הפרוטוקול המתואר כאן מוקדש להחדרת כלי הקריספר בתאים קשים להעברה, כגון תאי שריר. פרוטוקול זה מבוסס על שימוש ב- lentiviruses, המיוצרים עם פלסמידים הזמינים לציבור, שעבורם מתוארים כל שלבי השיבוט כדי להתמקד בגן בעל עניין. הבקרה על פעילות Cas9 בוצעה באמצעות התאמה של מערכת שתוארה בעבר בשם KamiCas9, שבה התמרת התאים עם נגיף לנטי המקודד RNA מנחה המכוון ל- Cas9 מאפשרת ביטול הדרגתי של ביטוי Cas9. פרוטוקול זה יושם על פיתוח קו תאי שריר אנושיים RYR1-knock out, אשר אופיין עוד יותר ברמת החלבון והתפקוד, כדי לאשר את הנוקאאוט של תעלת סידן חשובה זו המעורבת בשחרור סידן תוך תאי בשרירים ובצימוד עירור-התכווצות. ההליך המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם על גנים אחרים בתאי שריר או בתאים אחרים שקשה להעבירם ולייצר כלים חשובים לחקר גנים אלה בתאים אנושיים.

פרוטוקול זה יושם על מיובלסטים מונצחים מנבדק בריא15 (מה שמכונה תאי HM, עבור מיובלסטים אנושיים), שבו RyR1 אופיין בעבר16, על מנת להפיל את הגן RYR1 המקודד את החלבון RyR1. התכנון של ה-RNA המנחה נעשה כדי למחוק את הרצף המקיף חלק מאקסון 101 ואינטרון 101 של הגן. מחיקה של חלק מאקסון 101 צפויה לגרום לשיבוש מסגרת הקריאה. בנוסף, אקסון 101 מקודד את הנקבובית של החלבון ולכן נדרש לייצר תעלת סידן פונקציונלית. לחולים רבים הסובלים ממיופתיה חמורה הקשורה ל-RyR1 יש מוטציה באזור זה של הגן...

הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור מיובלסטים נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9, החל מתכנון של רנ"א מנחים ועד לשיבוט תאי ואפיון של שיבוטים נוק-אאוט.

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

פרוטוקול זה מאפשר התפתחות של נוק-אאוט של תאי שריר בכל גן, על מנת לחקור עוד יותר את תפקודו של גן זה בשריר. היתרון הוא שזה זול ומהיר יותר מהתפתחות של חיות נוק-אאוט לחקור כל גן. טכניקה זו יכולה לשמש, למשל, כדי לחקור את המעורבות של גן שזוהה לאחרונה במיופתיה.אם הטכניקה המתוארת כאן מיושמת על תאי iPS היא יכולה להוביל להתפתחות של תאי נוק-אאוט עבור כל גן בכל סוג של תאים. כדי להתחיל באשכולות של חזרות פלינדרומיות קצרות באופן קבוע או מחיקת גנים בתיווך CRISPR, השתמש תחילה בכלי דפדפן גנומיים כמו ensembl. כדי לזהות את גן המטרה יחד עם רצפי הדנ"א משני צידי גופו.כדי לקבל את רשימת האקסונים של הגנים, תחילה לחץ על התעתיק של רצף קידוד החלבונים ולאחר מכן על אקסונים. לאחר מכן, לחץ על הורד רצף ובחר רק רצף גנומי כדי להוריד את רצף הקונצנזוס המלא של הגן כולו. גלול את רשימת האקסונים והאינטונים של הגן כדי לבחור את הממוקדים.לתכנון רנ"א מנחה, בחרו תחילה רצפי נוקלאוטידים של האינטרונים במעלה הזרם ובמורד הזרם של רצף המטרה. לאחר מכן עבור אל אתר כגון crispr.tefor. נטו ולהשתמש ברצפים שנבחרו כדי לתכנן שני רנ"א מנחים, כל אחד באורך 20 נוקלאוטידים ללא המוטיב הסמוך Protospacer המופרד על ידי כמה מאות זוגות בסיסים.לאחר מכן קבעו את רצף המשלים ההפוך עבור כל רנ"א מנחה והזמינו את הפריימרים. כדי לבנות קלטות RNA מנחות לשיבוט פלסמיד, תחילה הפעל PCR עם קבוצה אחת של פריימרים באמצעות המתכון והתוכנית המתוארים בטקסט, ולאחר מכן הפרד את מוצרי ה- PCR בג'ל 1% אגרוז באמצעות מאגר Tris-borate-EDTA. לאחר מכן לבלות את השבר הזוגי בן 300 הבסיסים ולטהר באמצעות ערכה.באופן דומה, לאחר הרצת PCR נוסף עם ערכת הפריימרים האחרת, מטהרים מקטע דנ"א ארוך של זוג 400 בסיסים ל-20 מיקרוליטרים של מאגר אלוטציה. כדי להחדיר את קלטות ה-RNA המנחות לתוך עמוד שדרה של פלסמיד לנטי-ויראלי, הגדר תחילה תגובת עיכול כפולה של הפלסמיד עם אנזימי ההגבלה חג המולד 1 ו-Blp 1 כמתואר בטקסט. לאחר הדגירה של צינור התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, דוגרים אותה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז מפעילים את תוצר העיכול בג'ל אגרוז של 1% ומטהרים את הפלסמיד של זוגות של כ-10 קילו-בייס באמצעות ערכה מתאימה.כמו כן לכמת את המוצר המטוהר על ידי מדידת הצפיפות האופטית. כדי ללטף את קלטת הרנ"א המנחה עם הפלסמיד, הכינו תערובת תגובה עם הרנ"א המנחה המטוהר, הדנ"א, האנזים והמים של הפלסמיד הליניארי לנפח סופי של 10 מיקרוליטרים, ואז דגגרו את צינור התגובה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי ליצור את הפלסמיד הסופי, הנקרא pGuide. לייצור נגיף הלנטי, זרעו תחילה צלחת באורך 145 ס"מ עם מיליון תאי HEK 293 ב-DMEM עם גלוקוז גבוה ופירובט בתוספת 10% FBS ו-1%פניצילין או סטרפטומיצין.לאחר מכן מגדלים את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים בחממת פחמן דו-חמצני של 5%. ביום הרביעי לבדוק את התאים כדי להבטיח 60 עד 65% מפגש. לאחר מכן להכין את תמיסת הטרנספקציה המורכבת מפלסמיד העניין, הפלסמיד המקודד את מעטפת הנגיף, פלסמיד האריזה הלנטי-ויראלית פלסמיד psPAX2, וסידן פוספט.התאם את הנפח הסופי ל- 1000 מיקרוליטרים באמצעות מים. לאחר מכן הוסיפו את תמיסת הטרנספקציה באופן טיפתי למיליליטר אחד של 2X HBS תחת תסיסה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוסף את הפתרון באופן טיפתי לתאים.עבור התפלגות הומוגנית של תמיסת הטרנספקציה, הטה בעדינות את הצלחת לכל הכיוונים, ואז הדגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו-חמצני של 5% למשך חמש שעות לפחות. לאחר מכן, להסיר את המדיה מן הצלחות ולשטוף את התאים עם PBS כדי להיפטר מגיבים transfection, ולאחר מכן להוסיף 12 מיליליטרים של מדיום טרי. לאחר 48 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, רכזו את המדיה מכל הצלחות לצינור.שים את הצינור בדלי אטום וצנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז סנן את הסופרנאטנט באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר וצנטריפוגה את התסיס ב 68, 300 פעמים G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות רוטור דלי מתנדנד. לאחר הסרת ה-supernatant, שמרו את הצינורות הפוכים על מגבת נייר בארון בטיחות למשך חמש עד 10 דקות להסרה מקסימלית של נוזלים מהכדורים. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות HEC ושמרו על הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.לאחר מכן החיזרו את הכדור על ידי צנרת. לאחר איסוף כל הכדורים המחודשים, הכינו אליקוטים של 10 או 25 מיקרוליטרים, ואז אחסנו את האליקוטים במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת הצמדה במימן נוזלי. עבור התמרת מיובלסט, זרע ראשון כל באר של צלחת של 96 בארות עם 100 מיקרוליטרים של מדיום התפשטות המכיל 10, 000 תאי מיובלסט.למחרת, הוסף נפחים מחושבים מראש של מדריכי LV ו- LV Cas9 לתאים בארון בטיחות. לאחר חמישה ימים של דגירה, שחררו את התאים מהבאר על ידי הוספת טריפסין. לאחר ספירת מספרי התאים, העבירו את התאים מבארות עם 40% עד 50% מפגש לצלחת חדשה.לאחר חמש שעות של דגירה, הוסיפו נפחים מחושבים של רוצח LV בריבוי של זיהום של 20 ודגירה במשך חמישה עד עשרה ימים או לפחות שני מעברים בין לבין. לאפיון פונקציונלי של שיבוטים ערוכים גנטית על ידי הדמיית סידן, צלחת 50, 000 תאים במרכז צלחת 35 מילימטרים מצופה למינין. כדי לגרום להבחנה, הוסף את מדיום ההבחנה כמתואר בטקסט.לאחר שישה ימים של דגירה, הורידו את מדיום התרבית ותחמו את התאים בעט הידרופובי. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של Fluo-4 Direct, מדולל אחד לאחד במדיום ההבחנה, למיו-טיובים המובחנים. לאחר דגירה של הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם כרית קרבס בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר גלוקוז.לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של פי 10 למדוד את הווריאציות הפלואורסצנטיות בקצב של פריים אחד לשנייה למשך 90 שניות ולבחור שדה עם לפחות 10 מיו-טיובים. לאחר הסרת חיץ Krebs נוסף, לעורר את התאים עם שני מיליליטרים של אשלגן כלורי עבור דה פולריזציה של ממברנה או שני מיליליטרים של metacresol florochloral או 4CmC או RyR1 גירוי ישיר. דמיינו את הווריאציה הפלואורסצנטית לאחר הגירוי, ואז כימתו את השונות הפלואורסצנטית בכל מיויוטיוב.פרוטוקול זה יכול לשמש בהצלחה כדי להפיל את הגן RyR1 ממיובלסטים אנושיים, מה שהביא לדנ"א גנומי קצר יותר בתאים. נוק-אאוט RyR1 אושר גם ברמת החלבון מכיוון שלא ניתן היה לזהות את החלבון RyR1 בתאים הממוקדים על ידי כתם מערבי. היעדר פעילות RyR1 במיוטובים המובחנים מתאי הנוק-אאוט של RyR1 אומת עוד יותר על ידי הדמיית סידן Fluo-4 לאחר גירוי RyR1 ישיר על ידי 4CmC או גירוי עקיף על ידי דפולריזציה של ממברנה הנגרמת על ידי אשלגן כלוריד.הרצף שיימחק צריך להידרש לחיזוי של חלבון פונקציונלי. טכניקה זו אידיאלית לפיתוח כלים פוסט-גנומיים לחקר המעורבות של גנים חדשים במחלות שרירים.

development-knock-out-muscle-cell-lines-using-lentivirus-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

ככל שפרוטוקולים הקשורים לקריספר הופכים שימושיים ונגישים יותר ויותר, סיבוכים ומכשולים עדיין יכולים להיווצר בתנאי ניסוי ספציפיים. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של קו תאים אנושיים נוקאאוט של סרין/תראונין-חלבון קינאז 1 (RIPK1/RIP1) באמצעות CRISPR/Cas9 ומדגיש אתגרים פוטנציאליים בהם נתקלים במהלך תהליך זה.

יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

פרטים מוצגים על איך מיפוי QTL עם גנום שלם רצף גנטי מבוסס ניתן להשתמש כדי לזהות הגן עמידות התרופה ב Toxoplasma gondii וכיצד ניתן לאמת זאת עם מערכת CRISPR / Cas9 כי ביעילות עריכת יעד גנומי, במקרה זה גן ההתנגדות לסמים.

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

למד ליצור קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות CRISPR/Cas9 בתיווך נגיף לנטי. שיטה זו מאפשרת חקר מהיר ויעיל של תפקוד גנים בשריר ללא צורך ביצירת בעלי חיים נוק-אאוט.

פיתוח קווי תאי שריר נוק-אאוט באמצעות עריכת גנים של קריספר/Cas9 בתיווך נגיף לנטי

גלה סרטונים נוספים