טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הדמיה של סחר בתאים: שיטה של תיוג רדיו תאים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מדורגת לתיוג רדיואקטיבי של תאים וזירקוניום-89-DBN ומעקב לא פולשני שלה על ידי PET. טכניקה זו מספקת גם שיטה אמינה ויציבה לתיוג תאים רדיואקטיביים על ידי צימוד קוולנטי של זירקוניום-89-DBN לאמצעי העיקרי של חלבוני פני התא. רופאים ומדענים העובדים עם טיפולים תאיים למחלות נוירולוגיות וסוגי סרטן שונים ימצאו פרוטוקול זה חיוני בהבנת הפרמקוקינטיקה של טיפולים מבוססי תאים באמצעות דימות PET לא פולשני.

הפרוטוקול המפורט מספק הדרכה למשתמשים חדשים ללמוד ולאמץ טכניקת תיוג רדיו זו. צמתים נוספים הכלולים בשלבים הקריטיים יסייעו בפתרון בעיות עבור משתמש חדש. כדי להתחיל, להכין עמוד עם כ 100 מיליגרם של שרף hydroxamate, ולהפעיל אותו על ידי שטיפת העמוד עם שמונה מיליליטר של אצטוניטריל נטול מים טהור ואחריו סומק עם חמישה עד שישה מיליליטר של אוויר.

מעבירים שני מיליליטר של 0.5 חומצה הידרוכלורית רגילה לעמודה. לאחר העברת שטיפה נוספת של חמישה עד שישה מיליליטר אוויר, לטעון את התמיסה המכילה הן זירקוניום-89 והן איטריום טבעי לשרף הידרוקסאמט לאט. שטפו את האיטריום הטבעי הבלתי קשור משרף ההידרוקסאמט עם 20 מיליליטר של שתי חומצות הידרוכלוריות רגילות, ואחריו 10 מיליליטר מים שעברו דה-יוניזציה.

עבור התחמקות זירקוניום בצורה של זירקוניום-89 מימן פוספט, להוסיף 0.5 מיליליטר של 1.2 molar dipotassium phosphate אשלגן dihydrogen פוספט חיץ לעמוד ולאפשר לו לשבת על העמוד במשך 30 דקות. הוסף 1.5 מיליליטר נוספים של חיץ מולארי 1.2 כדי להסיט את הזירקוניום מהעמודה. לאחר מכן, קח כ -120 מיקרוליטר של זירקוניום-89 מימן פוספט שנוסח במאגר ונטרל את התמיסה עם HEPES-KOH ואשלגן פחמתי כדי להשיג pH של 7.528.

הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חמישה מילימולרים טריים מוכנים DFO-Bn-NCS לכ -285 מיקרוליטר של זירקוניום-89 פוספט מימן מנוטרל. ולערבב את הפתרון על ידי pipetting. לאחר בידוד זירקוניום מאיטריום, הוסף 0.5 מיליליטר של חומצה אוקסלית טוחנת אחת לעמוד ואפשר לו לשבת על העמוד במשך דקה אחת כדי להוציא זירקוניום בצורה של זירקוניום-89 אוקסלט.

הוסף 2.5 מיליליטר נוספים של חומצה אוקסלית מולרית אחת לעמודה. כדי להמיר זירקוניום-89 אוקסלט לזירקוניום-89 כלוריד, שטפו את עמוד החלפת האניון עם שישה מיליליטר של אצטוניטריל, ולאחר מכן שטף עם חמישה עד שישה מיליליטר אוויר. לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 10 מיליליטר של מלוחים ואחריו עוד סומק של אוויר.

לאט לאט, טען את התמיסה המכילה זירקוניום-89 אוקסלט על עמודת החלפת האניון הפעיל לפני שתשטוף אותה מחדש באוויר. לאחר מכן, שטפו את העמוד עם 50 מיליליטר מים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר את יון האוקסלט הבלתי קשור. עבור התחמקות זירקוניום בצורה של זירקוניום-89 כלוריד, להוסיף 0.1 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית רגילה אחת לעמוד ולאפשר לו לשבת על העמוד במשך דקה אחת.

Elute את הזירקוניום מן העמוד עם 0.4 מיליליטר נוספים של חומצה הידרוכלורית נורמלית אחת. יבשו את הזירקוניום-89 כלוריד החמק בבקבוקון בצורת V על ידי הכנסתו לבלוק חימום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס תחת זרימה קבועה של גז חנקן למשך 10 עד 30 דקות, ולאחר מכן הרכיבו מחדש את הזירקוניום-89 כלוריד המיובש במים. הכינו 500 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם כ-6 מיליון תאים ב-500 מיקרוליטר HBSS חוצץ HEPES בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר והוסיפו כ-100 מיקרוליטר של הנוסחה זירקוניום-89-DBN.

מערבבים את הזירקוניום-89-DBN ואת תרחיף התא על ידי פיפטציה עדינה של התמיסה למעלה ולמטה עם מיקרו פיפטה. יש לדגור על התאים ותערובת הזירקוניום-89-DBN על שייקר בסביבות 550 סל"ד בטמפרטורה של 25 עד 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות לצורך סימון תאים. בצע TLC רדיואקטיבי על תגובת תיוג הרדיו של התא באמצעות ממס TLC רדיואקטיבי טרי.

חשב את אחוז הרדיואקטיביות ב- Rf שווה ל- 0.01 עד 0.02 באמצעות המשוואה המוצגת על המסך. בצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר, ערבבו כ-100 מיקרוליטר של הנוסחה זירקוניום-89-DBN עם כ-500 מיקרוליטר של HBSS חוצץ HEPES כדי להשתמש בו כבקרה ללא תאים לתיקון רקע. חשב את אחוז הרדיואקטיביות ב- Rf שווה ל- 0.01 עד 0.02 באמצעות המשוואה המוצגת על המסך, ולאחר מכן חשב את תיוג הרדיו היעיל של התאים על-ידי הפחתת שני אחוזי הרדיואקטיביות המחושבים.

לאחר אישור השלמת תיוג הרדיו, הוסף 600 מיקרוליטר של מדיום שלם מתאים לתאים מקוררים כדי לבצע את המרווה של תגובת תיוג הרדיו. צנטריפוגה את התאים ב 96G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ולהשליך את הסופר-נטנט.

השהה מחדש בעדינות את התאים הכדוריים ב 500 מיקרוליטר של המדיום המצונן על ידי pipeting את המדיום למעלה ולמטה עם מיקרו פיפטה. צנטריפוגו את התאים ב-96G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופר-נטנט. לאחר מכן, חשב את יעילות תיוג הרדיו הסופית לאחר כל השטיפות באמצעות המשוואה המוצגת על המסך.

כדי להבטיח את איכות התאים המסומנים ברדיו, בדקו ויזואלית את התרחיף הסופי של התאים המסומנים ברדיו, ואם אין גושים, בצעו בדיקת כדאיות של טריפאן כחול באמצעות תמיסה כחולה טריפאן 0.4% שהוכנה ב-PBS תוך שעה מרגע תיוג הרדיו ושלבי השטיפה. יעילות הקלציה של DFO-Bn-NCS עבור זירקוניום-89 באמצעות זירקוניום-89 מימן פוספט וזירקוניום-89 כלוריד שונה כפי שנמדד על ידי TLC רדיואקטיבי. היציבות של תאים שונים עם זירקוניום-89 במשך שבעה ימים מוצגת כאן.

שימור רדיואקטיביות של זירקוניום-89 על ידי תאים מסומנים ברדיו נמצא יציב בכל התאים שנחקרו, עם זרם זניח שנצפה במשך שבעה ימים לאחר התווית. יעילות תיוג הרדיו של תאים בסוגי תאים שונים עם זירקוניום-89-DBN מוצגת בטבלה זו. יעילות תיוג הרדיו של התא נעה בין 20% ל-50% כתשואה לא מתוקנת שנצפתה בכדורית התא המסומנת ברדיו לאחר השטיפה.

השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא הוספת DFO-Bn-NCS לתערובת הקלציה והערכת האיכות של תאים מסומנים ברדיו. היישום של טכניקה זו יסייע להבין את הפרמקוקינטיקה של טיפולים מבוססי תאים. זה גם יעלה שאלות לגבי כל צורך קליני לשנות את פרופיל האישור של טיפולים תאיים.