אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

ליזוזומים הם מערכות סילוק האשפה של התא. הפעילויות הליזוזומיות הן דינמיות מאוד וקשות מאוד ללכידה. במחקר זה פיתחנו גישה של פרוטאומיקה לתיוג קרבה כדי לפענח את המיקרו-סביבה הליזוזומלית בתאי עצב אנושיים חיים.

גישה זו לוכדת את חלבוני קרום הליזוזום ואת האינטראקציות היציבות והחולפות עם הנוירונים שמקורם בליזוזום וב-iPSC. תפקוד לקוי של ליזוזומלי מעורב מאוד במחלות מוח שונות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי להבין מחלות מוח שונות ולספק מטרות מולקולריות פוטנציאליות לתכנון טיפולים חדשים.

כדי להתחיל את ההליך לתיוג קרבה, התבונן בנוירונים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם חיים ובריאים. קח חצי נפח של מדיום מהתרבית כדי לערבב עם פנול ביוטין והוסף אותו בחזרה לנוירונים בריכוז סופי של 500 מיקרומולר למשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. התחל את תגובת הסימון על ידי הוספת תמיסת מי חמצן טרייה לתרבית הנוירונים בריכוז סופי של מילימולר אחד.

לאחר דגירה של דקה, שאפו את המדיום ושטפו את התרבות שלוש פעמים עם חיץ מרווה. הטה את הצלחת כדי לשאוף את כל שאריות החיץ. לאחר הוספת חיץ ליזיס קר כקרח, יש לגרד את התא לצינורות קרים של 1.5 מיליליטר.

סונו את הצינורות באמבט מים קרים כקרח בהספק של יותר מ-100 וואט למשך 15 דקות עם מחזורים חלופיים של 40 שניות דולקים ו-20 שניות כבויים. לאחר תזה של תאים, יש להוסיף אצטון קר במינוס 20 מעלות צלזיוס לדגימה בנפח של פי ארבעה מתמיסת התאים-ליזאט. מערבולת לזמן קצר ודגירה במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לזרז חלבונים ולהסיר שאריות ביוטין פנול.

צנטריפוגה של צינור ליזאט התא ב 16, 500 פעמים G במשך 10 דקות בשתי מעלות צלזיוס ולהסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה חלבון. לאחר מכן, לשטוף את הכדור פעמיים עם מיליליטר אחד של אצטון במינוס 20 מעלות צלזיוס, ואחריו צנטריפוגה והסרה של supernatant. לאחר מכן, יבש את כדור החלבון עם רכז ואקום במשך דקה אחת.

הוסף מאגר תזה תא כדי להמיס לחלוטין את הכדור עם מערבולת או סוניקציה. קח 20 microliters של aliquot כדי לקבוע את ריכוז החלבון הכולל על ידי בדיקת DCA. אחסן את תמיסת התאים הנותרת במינוס 80 מעלות צלזיוס.

קח את דגימת החלבון ליזאט ממקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס ונקה את צינור הדגימה למשך 30 שניות להפשרה מהירה. מערבולת, צנטריפוגה לזמן קצר עם צנטריפוגה מיני ספסל, ומניחים את צינור הדגימה על קרח. לאחר מכן, להעביר 250 microliters של streptavidin חרוז מגנטי slurry לכל צינור 1.5 מיליליטר.

מניחים את הצינורות האלה על מתלה מגנטי למשך דקה אחת, שוטפים את החרוזים שלוש פעמים במיליליטר אחד של תמיסת 2% נתרן דודציל סולפט, ומסירים את המאגר השיורי. בהתבסס על ריכוז החלבון הכולל של התא ותוצאות בדיקת טיטרציית החרוזים, הוסף את הכמות המחושבת של דגימת החלבון הדרושה עבור 250 מיקרוליטרים של חרוזי החרוז המגנטי של סטרפטאווידין. לאחר מכן, הוסיפו את מאגר התזה של התאים לתערובת החרוזים-ליזאט המגנטיים לנפח הכולל של מיקרוליטר אחד וסובבו את הצינור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, צנטריפוגה את צינור הדגימה לזמן קצר על מיקרוצנטריפוגה ספסל ולהניח את הצינור על מתלה מגנטי למשך דקה אחת כדי להסיר את supernatant. לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של מאגר כביסה A עם חמש דקות של סיבוב בטמפרטורת החדר. חזור על התהליך עם כל חיץ כביסה פעמיים, ברצף, עם חיץ B, חיץ C וחיץ D בארבע מעלות צלזיוס.

מניחים את הצינור על מתלה מגנטי למשך דקה אחת ומסירים את הסופרנטנט. לאחר מכן, החזירו את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של TCEP של חמישה מילימולרים במאגר Tris של 50 מילימולר כדי לדגור במשך 30 דקות על תרמומיקסר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן תוספת IAA של 15 מילימולאר למשך 30 דקות בחושך ותוספת TCEP של חמישה מילימולרים למשך חמש דקות כדי להרוות את שאריות IAA. צנטריפוגה את צינור הדגימה לזמן קצר על מיקרוצנטריפוגה והנח את הצינור על מתלה מגנטי למשך דקה אחת כדי להסיר supernatant.

הוסף 200 מיקרוליטרים של TCEP של חמישה מילימולרים במאגר Tris של 50 מילימולר כדי להשעות מחדש את החרוזים. הוסיפו מיקרוגרם אחד של תערובת טריפסין/Lys-C למשך 14 שעות ב-1, 200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר 14 שעות, הוסיפו 0.2 מיקרוגרם נוספים של תערובת טריפסין/Lys-C למשך שלוש שעות, סובבו את צינורות הדגימה והניחו אותם על מדף מגנטי למשך דקה אחת.

לאחר מכן, העבירו את הפפטיד לצינורות הנקיים. לאחר מכן, לשטוף את החרוזים עם 50 microliters של 50-millimolar Tris buffer עם ניעור במשך חמש דקות, לשלב את פפטידים supernatants, ולהוסיף 30 microliters של 10% חומצה trifluoroacetic לצינור כדי להפחית את ה- pH לפחות משלושה. לאחר פפטיד התפלה וייבוש.

השהה מחדש את דגימות הפפטידים במאגר LC לצורך ניתוח LC-MS. העבר את הסופרנטנט לבקבוקון דגימת LC כדי לנתח אותו באמצעות ננו-LC-MS. בקובץ השיטה LC-MS, הוסף רשימת אי-הכללה מותאמת אישית של LC-MS עם מסות ספציפיות וטווחי זמן שמירה עבור פסגות פפטידים מזהמים בשפע רב, כגון סטרפטאבידין, טריפסין ו- Lys-C.

נתח את הנתונים הגולמיים של LC-MC באמצעות תוכנה לניתוח נתונים של פרוטאומיקה. כלול שתי ספריות FASTA מסד נתונים של Swiss-Prot Homo sapiens, וספריית FASTA אוניברסלית חדשה שנבנתה עם קידומת מזהמת במזהה UniProt.הגדר את פרמטרי ניתוח הנתונים עם שיעור גילוי שגוי של 1% עבור זיהויים ספקטרליים של חלבונים ופפטידים. בחר עיכול טריפסין עם שלושה מחשוף שהוחמצו, שינוי קבוע של מתילציה של ציסטין קרבמידיל, שינוי משתנה של חמצון מתיונין, ואצטילציה סופנית של חלבון.

לכימות ללא תוויות, נרמל את עוצמות השיא של הפפטיד MS-I לקרבוקסילאז PCCA שעבר ביוטינילציה אנדוגנית והפחת את השינויים בניסויי תיוג הקרבה. ייצוא תוצאות רמת החלבון מתוכנת הפרוטאומיקה כקובץ אקסל. לפני הניתוח הסטטיסטי, הסר חלבונים וחלבונים מזהמים עם PSM אחד בלבד או ללא תוצאת כימות.

מורפולוגיות של תאים בנקודות זמן שונות של תאי העצב מסוג iPSC המחישו את הצמיחה החוצה של הנוריט במהלך תקופת ההתמיינות בת שלושת הימים. לאחר שעברו ללוחות מצופים פולי-L-אורניתין בתווך הנוירונים, הנויריטים יצרו רשת בין נוירונים והרחבות אקסונאליות הפכו גלויות יותר לאחר ההתבגרות תוך שבועיים. בהדמיה הפלואורסצנטית, פעילות ה-LAMP1 של חלבונים ביוטיניליים הוכתמה על ידי סטרפטווידין והתמקמה עם צביעת LAMP1 בתאי עצב.

התוצאות של בדיקת טיטרציית החרוזים הדגימו ירידה של אותות חלבון ביוטינילציה שלא נלכדו בעת הגדלת כמות חרוזי הסטרפטאווידין. חמישה מיקרוליטרים של חרוזי סטרפטווידין היו אופטימליים עבור 50 מיקרוגרם של חלבוני קלט מדגימות LAMP1 apex אנדוגניות. העיכול על החרוזים עם תערובת טריפסין/Lys-C הביא ליותר זיהויים של חלבונים ופפטידים ופחות מחסורים בהשוואה לטריפסין לבדו.

בנוסף, 1 עד 1.5 מיקרוגרם של טריפסין/Lys-C נמצאו אופטימליים לעיכול על חרוזים כדי לקבל את המספר הגבוה ביותר של חלבונים מזוהים ואת האחוז הנמוך ביותר של מחשוף שהוחמצו. חלבוני ממברנה ליזוזומליים ידועים היו מוגברים ב-LAMP1 apex לעומת ללא בקרת apex. חלבונים שעברו ביוטינילציה אנדוגנית נמצאים בשפע רב, אך נותרים ללא שינוי.

המונח GO וניתוח רשת חלבונים הציעו כי חלבוני ממברנה ליזוזומליים יציבים ואינטראקטורים ליזוזומליים חולפים הקשורים לסחר אנדוליזוזומלי ולהובלה הועשרו בפרוטאומיקה של LAMP1 apex. יש להרוות את תיוג הקרבה של Apex בדקה אחת בדיוק כדי להפחית את העקה החמצונית ואת השינויים הניסיוניים. לאחרונה פיתחנו שיטת ביוטין הניתנת להפרדה המאפשרת לנו להעשיר חלבונים ביוטינילטים.

שיטה זו, בשילוב עם השיטה הנוכחית שלנו, תאפשר לנו להפחית את ההפרעות של סטרפטווידין וחלבונים ביוטיניליים אנדוגניים. אנו יכולים ליישם שיטה זו הן על נוירונים מסוג בר והן על נוירונים מוטנטיים עם גרסאות גנטיות הגורמות למחלות מוח. זה יכול לעזור לנו להבין כיצד ומדוע מוטציות גנטיות משפיעות על מיקרו-סביבה ליזוזומלית בתאי עצב אנושיים.