למידה אסוציאטיבית מרתיעה ויצירת זיכרון על ידי זיווג שני כימיקלים ב- Caenorhabditis elegans

למידה וזיכרון חיוניים לבעלי חיים כדי לשרוד ולהתרבות על ידי ניווט יעיל בסביבות המשתנות ללא הרף. זהו גם אחד הנושאים המרכזיים הנלמדים במדעי המוח. Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם אטרקטיבי לחקר הלמידה והזיכרון בגלל הפשטות של מערכת העצבים שלה.

דיאגרמות החיווט הכימי והחשמלי שלה משוחזרות גם הן לחלוטין. הניתוח ההתנהגותי של Caenorhabditis elegans הוא מסובך ביותר ומושפע ממספר פרמטרים כגון לחצים כימיים, מכניים וטמפרטורה. כדי להתחיל, הכינו מדיום גידול נמטודות של שישה סנטימטרים, או צלחות NGM, על ידי פיזור 0.2 מיליליטר של תרבית נוזלית E.coli OP50 במדיום לוריא-ברטאני ודגירה שלהם בטמפרטורת החדר למשך לא יותר מ-24 שעות.

ביום הראשון, בחרו והניחו חמש חיות גרבידיות שניזונו היטב על כל צלחת NGM של שישה סנטימטרים עם קוטף תולעי פלטינה ותנו להן להטיל כ-50 ביצים במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי לקבל אוכלוסייה מסונכרנת של בעלי חיים בוגרים. כדי להפסיק את הטלת הביצים, הוציאו את חיות האב מהצלחות בעזרת קוטף תולעי פלטינה. מטפחים את בעלי החיים בטמפרטורת החדר במשך כחמישה ימים כדי להגיע לשלב הבוגר הבוגר, ולא לשלב הבוגר הצעיר.

לאחר חמישה ימים, אספו כ-200 בעלי חיים בוגרים באספן בעלי חיים על ידי שטיפת כל צלחת במיליליטר אחד של 0.25% ג'לטין מימי אשר ימנע את הידבקות בעלי החיים לפני השטח של פלסטיק, כגון קצות פיפטה. לאחר מכן, לשטוף את החיות על ידי הזזה עדינה של אספן למעלה ולמטה פעמיים ב 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים. חזור על התהליך פעמיים.

טבלו בעדינות את אספן החיות המכיל כ-200 בעלי חיים ב-40 מיליליטר של תערובת של 1%1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית ב-pH 4 בצלחת מתגבשת למשך שנייה אחת. שטפו את בעלי החיים באספן על ידי טבילה עדינה מאוד של האספן פעם אחת בבאר של צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המכילה 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן הניחו את האספן על מדשאה של E.coli OP50 על צלחת NGM באורך שישה סנטימטרים למשך 10 דקות כדי שהחיות יוכלו לנוח.

לאחר מכן, לשטוף את החיות באספן עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים על ידי הזזה עדינה של האספן למעלה ולמטה. חזרו על הכביסה שלוש פעמים והמשיכו לבדיקת כימוטקסיס. לשטוף ברצף את החיות באספן עם תערובת פרופנול ומים מזוקקים כפולים, פעם אחת כל אחד כפי שהוכח קודם לכן.

לאחר מכן הניחו את האספן על מדשאה של E.coli OP50 על אגר NGM בצלחת פטרי באורך שישה סנטימטרים למשך 10 דקות כדי שהחיות יוכלו לנוח. לאחר מכן, שטפו את בעלי החיים שלוש פעמים על ידי הזזה עדינה של האספן מעלה ומטה פעמיים ב-10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים כדי למנוע זיהום חיידקי והמשיכו לבדיקת כימוטקסיס. הכינו צלחות אוגר לבדיקת הכימוטקסיס בכלי פטרי מפלסטיק באורך שישה סנטימטרים.

לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה מנוסר בעל פתח של יותר ממילימטר אחד כדי להעביר את החיות מהאספן לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 0.25% ג'לטין מימי. לאחר שהחיות מתיישבות בתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה, הסר את הסופרנטנט מהצינור. החזירו את החיות למיליליטר אחד של מחסום כימוטקסיס, ותנו להן להתיישב בכוח הכבידה לתחתית הצינור למשך כדקה.

לאחר מכן, הסר כמה שיותר סופרנטנט על ידי פיפטציה. לאחר מכן, יש לזהות באלכסון ארבעה מיקרוליטרים של 1-פרופנול מימי ב-5% בשני מקומות, ואז לזהות ארבעה מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים בשני מקומות אחרים בצלחת פטרי. לאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה מנוסר עם פתח של מילימטר אחד כדי לזהות שישה מיקרוליטרים של תרחיף החיה בחיץ בדיקת כימוטקסיס המכיל כ-60 בעלי חיים במרכזן של שלוש צלחות.

הסר את הנוזל ככל האפשר עם פתיל רקמת מעבדה מבלי לגעת בבעלי החיים. מניחים מכסה על הצלחת ומאפשרים לבעלי החיים לנוע בחופשיות על הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את chemotaxis, להעביר את הצלחת לתוך צלחת פטרי זכוכית על הקרח במשך שלוש דקות.

לאחר מכן, מניחים את הצלחת במקרר עד לספירת מספר בעלי החיים על הצלחת. לספור את מספר בעלי החיים בארבעה חלקים למעט אלה שבמעגל המרכזי תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולחשב את מדד הכימוטקסיס באמצעות המשוואה. מתוך ערכי מדד הכימוטקסיס, יש לחשב את ערכי מדד הלמידה כהפרש בין ערך מדד הכימוטקסיס של חיות הייחוס לבין ערך מדד הכימוטקסיס של בעלי החיים המותנים.

בבדיקת הכימוטקסיס, בעלי חיים המותנים בתערובת של 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית איננו נמשכים ל-5%1-פרופנול מנוקד בצלחות אגר, בעוד שבעלי חיים נאיביים וייחוס נמשכו ל-5%1-פרופנול. בעלי חיים שהותנו על ידי האימון המרווח עם תערובת של 1-פרופנול מימי וחומצה הידרוכלורית כבר לא נמשכו ל-5%1-פרופנול בהשוואה לבעלי חיים שטופלו ב-1%1-פרופנול או חומצה הידרוכלורית, או במים מזוקקים כפולים בלבד. חקר ההשפעה של מוטציות על הזיכרון גילה כי היווצרות זיכרון לטווח קצר ולטווח ארוך תלויה בגנים הממלאים תפקידים חיוניים בהתניה הקלאסית של בעלי החיים.

לאחר כל מיזוג, יש לשטוף בעדינות בעלי חיים רק פעם אחת עם מים מזוקקים כפולים. לאחר שזיכרון לטווח ארוך נוצר באמצעות ההליך, הדמיית סידן ואלקטרופיזיולוגיה יכולות לזהות מעגלים עצביים האחראים על הזיכרון. באמצעות ניתוחים גנטיים ונוירונים בודדים, ניתן לטפל בתהליכי האחסון והאחזור של הזיכרון ברמה המולקולרית וברמת התא הבודד.