הכנה והערכה מבנית של חד-שכבות תאי אפיתל במכשיר תרבית מיקרופלואידית בגודל פיזיולוגי

פרוטוקול זה משמש להורדת מחסום הכניסה לניסויים בתרביות תאים ומאפשר לחוקרים להעריך ולאפיין חד-שכבות תאים דבקות בתרבית בסביבות מיקרופלואידיות דינמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה איכותית וכמותית של מאפייני חד-שכבות התא לשמש בסיס לניסויים נוספים תלויי חד-שכבתיים. שיטה זו מאפשרת שחזור אפיתל מכתשית במבחנה, ומאפשרת לחקור את התגובות הדינמיות במהלך תסמונת מצוקה נשימתית חריפה, ARDS, כמו גם פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי מכונת הנשמה, VILI.

כדי להתחיל, השג מערך זרימה של ערוץ יחיד. נקו את משטח הזכוכית באמבטיה אולטראסונית. טבלו את הכיסוי בפולי-די-ליזין בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן יבש אותו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, הדביקו דבקים דו צדדיים בספייסרים מיילריים. חיתוך בלייזר כמתואר בכתב היד לזכוכית הכריכה ולוודא שמגזרות התעלה מיושרות במדויק.

הצמידו זכוכית כיסוי מלבנית לרצועת הדבק התחתונה ביותר. השתמשו בניירות הדבק המקולפים כדי לכסות את חלקי הדבק שעדיין חשופים. לאחר השלמת ההרכבה, להפעיל לחץ חזק שווה על הבנייה.

בעזרת מזרק מלא במים נטולי יונים, שוטפים את התעלה. לעקר את מארז התעלה במעקר אולטרה סגול למשך 30 דקות. בטכניקה סטרילית, יש לטפל בתעלה בתמיסת פיברונקטין אנושית שהוכנה ב-PBS ולדגור במשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

במכסה המנוע הסטרילי של זרימה למינרית, הכן את מתלה התא NCI H441 באמצעות מדיום RPMI 1640 עם 10% FBS. השתמש 0.25 מיליליטר של תרחיף תא זה כדי למלא את התעלה וחלק מהיציאות. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, ודא שהתאים התפזרו באופן שווה בתוך הערוצים.

הוסף את מאגר המדיה ואת סטופרקוק לערוץ. התחילו לגדל את התעלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. השתמש במשאבת מזרק ניתנת לתכנות כדי למשוך מדיה משומשת מהערוץ ומדיה טרייה לתוך התעלה ממאגר מדיה סטרילי המחובר לכניסת התעלה.

במכסה אדים כימי, יש לדלל תמיסת פורמלדהיד 4% לתוך DPBS כדי ליצור תמיסה של 1% ולאחסן בצינור המסומן כראוי. הכינו את תמיסת הפורמלדהיד 2% באופן דומה. העבירו את תמיסות הפורמלדהיד למזרקי חמישה מיליליטר המסומנים כראוי.

צייר 20 מיליליטר של DPBS לתוך מזרק נפרד 20 מיליליטר אשר ישמש עבור שלבי הכביסה. לאחר מכן, הסר את התעלה המיקרופלואידית ממנגנון התרבית ואבטח אותה במכסה האדים הכימי. כדי להרכיב את מנגנון הקיבוע והצביעה, חבר קטע של צינורות העברה ליציאה הצדדית של סטופקוק תלת-כיווני באמצעות מנעול Luer זכר למתאם מוט צינור.

לאחר מכן חבר את הסטופקוק ליציאת הכניסה של מערך הזרימה. חבר קטע נוסף של צינורות העברה ליציאת היציאה של הסטופקוק הקיים באמצעות אותו סוג של מתאם צינור. לבסוף, אבטחו את הקצוות החופשיים של שני צינורות ההעברה המוגדרים כעת כקווי פסולת למיכל פסולת מתאים לכימיקלים ולסיכונים ביולוגיים.

ודא שהסטופק חוסם את יציאת הכניסה של מערך הזרימה ושטוף את קו הפסולת באמצעות DPBS. לאחר מכן סובב את הסטופרקוק כדי לחסום את קו הפסולת ולשטוף לאט את התאים עם שני מיליליטר של DPBS. לדחוף באיטיות שני מיליליטר של 1% קיבוע דרך הערוץ.

תן לזה לשבת במשך חמש דקות וחזור על הפעולה עם 2% קיבוע. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם DPBS טרי כפי שהודגם קודם לכן. הכינו את תמיסת ה-0.1% saponin כמתואר בכתב היד.

ציירו DPBS נוספים לתוך מזרק 20 מיליליטר לשימוש בשלבי הכביסה. מכסים את הצינור ברדיד אלומיניום. הוסף את מגיב הפלואידין מכתים אקטין נימה ואת מגיב Hoechst מכתים גרעין לתמיסת 0.1% saponin.

לאחר מכן להעביר את הפתרון מזרק מכוסה נייר כסף. יש לשטוף את קו הפסולת בכמות קטנה של תמיסת חדירה וצביעה. לאחר מכן להציג שני מיליליטר של הפתרון לערוץ microfluidic.

כסו את התעלה ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור. לאחר 30 דקות, שטפו את התמיסה החדירה בשני מיליליטר DPBS פעמיים למשך חמש דקות כל אחד לפני ייבוש עדין של התעלה. באמצעות מיקרופיפטה, הכניסו כמות מינימלית של מתקן רך נגד דהייה לתעלה המיקרופלואידית המבטיח לכסות את המשטח התחתון לחלוטין.

לאחר מכן חותמים את הקצה לערוץ. באמצעות מיקרוסקופ brightfield, ודא במהירות את שלמות שכבת התא לפני אחסון התעלה במיכל כדי להגן עליה מפני אור. בדוק מיקומי הדמיה על-ידי ביצוע סריקות ייחוס וערימות z עד לעמידה בפרמטרים ובתנאים הרצויים של התמונה.

בעזרת לוח הבסיס של מערך הזרימה כהפניה, בנו ערימות z במקומות שונים לאורך הערוץ. לבסוף, נתח נתוני חתך, נתוני מפת עומק וכל מאפיין רלוונטי אחר כדי להעריך את מאפייני שכבת התא. השימוש המוצלח בטכניקה מודגם בסביבת התרבית הדינמית המיקרופלואידית באמצעות רכישת תמונה במרחק של סנטימטר אחד לפחות מהכניסה והיציאה.

בניסוי משך תרבית מייצג, נצפה ייצור חד-שכבתי מוצלח כאשר התאים גודלו בתרבית במשך 24 שעות. עם זאת, כאשר תרבית במשך 48 שעות, היווצרות רב שכבתית לא רצויה נראתה. הנתונים שנאספו מכל אחד מחמשת מיקומי ההדמיה של התעלות המיקרופלואידיות חושפים גם את הקשר בין משך תרבית מוגבר לבין שטח חתך מוגבר, מה שמרמז על היווצרות שכבה לא אחידה או צמיחת יתר המתרחשת תוך 48 שעות מהתרבית.

מפת עומק של מיקום מרכזי בתוך התעלה המיקרופלואידית בתרבית במשך 24 שעות התקבלה, אשר שימושית להערכה איכותית של מאפייני השכבה. שלושת ההיבטים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הם בניית ערוצים נכונה, תרבות מדויקת ותנאי זרימת מדיה, ושימוש זהיר במנגנון הקיבוע והצביעה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש במקביל בשיטות אחרות כדי לאמת את הכדאיות הניסויית של חד-שכבות התא המיוצרות כגון חישת עכבת מצע תא חשמלי, ECIS או התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית, TEER.