בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים
24 במרץ 2023
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.
הפרוטוקול שלנו לבידוד מזנכימה במעי מביא לתשואה גבוהה של טלוציטים. שיטה זו מציעה פלטפורמה ראשונית לחקר אינטראקציה בין תאים המערבת טלוציטים בהומאוסטזיס ובמחלות. טלוציטים הם תאים ייחודיים הרגישים לפרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות זמינות.
לכן, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בידוד של mesenchyme, כולל telocytes קיימא מועשר. מזנכימה, כולל טלוציטים, יכולה לשמש כמקור למולקולות איתות וגורמי גדילה הדרושים לגדילה מאורגנת ex vivo. כדי להתחיל, לשטוף את המעי, מופרד עכבר המתת חסד, בצלחת פטרי המכילה PBS קר וסטרילי.
מניחים את המעי בצלחת פטרי. ובאמצעות מספריים בקצה הכדור, לפתוח את צינור המעי לאורך, ולשטוף את הצואה. מעבירים את המעי לצלחת חדשה המכילה PBS טרי וקר.
לאחר שטיפת המעי פעם נוספת, לחתוך את המעי הדק למקטעים באורך סנטימטר, ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא שמונה מיליליטר של PBS. נערו את הצינור ידנית במחזור אחד או שניים בשנייה למשך דקה. יוצקים את התמיסה לצלחת פטרי.
ובאמצעות מלקחיים, להעביר את הקטע לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מלא 20 מיליליטר של פתרון A.מניחים את הצינורות באינקובטור שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, נערו את הצינור במרץ ביד בארבעה או חמישה מחזורים בשנייה למשך דקה אחת כדי לנתק את האפיתל. חזור על שלב זה פעם נוספת.
לאחר חיתוך ושטיפת השברים כפי שהודגם קודם לכן, העבירו אותם לצינור חדש של 50 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי, והפכו את הצינור במחזור אחד או שניים לשנייה למשך דקה. יוצקים את התמיסה לצלחת פטרי. העבירו את המקטעים לצינור חדש של 15 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי, והטו מעלה ומטה בעדינות במחזור אחד או שניים לשנייה למשך שתי דקות.
מתחת לארון בטיחות ביולוגית, השתמשו במלקחיים כדי להניח את המקטעים על מגבון מעבדה סטרילי כדי לייבש אותם. לאחר הייבוש, לחתוך את הפלחים עוד לחתיכות. מעבירים את החתיכות החתוכות בעזרת מלקחיים לצלחת בת שש בארות מלאה בארבעה מיליליטר של תמיסת עיכול שחוממה מראש לכל באר.
דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך 50 דקות, ומנערים את הצלחת ידנית בעדינות כל 20 דקות. לאחר מכן, להעביר את חתיכות באמצעות פיפטה פסטר לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא ארבעה מיליליטר של DMEM. נערו את הצינור ידנית בארבעה או חמישה מחזורים בשנייה למשך דקה אחת כדי לקבל השעיה של תא יחיד.
מסננים את המתלה דרך מסננת של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התסנין ב 700 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט על ידי שאיפה, והשעו מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של 2% FBS/PBS.
לאחר צנטריפוגה של המתלה פעם נוספת ב 700 גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 12 מיליליטר של מדיום תרבית. לבסוף, זרעו את השעיית התא בצלחות שש בארות. בעקבות דיסוציאציה של מזנכימה, הטלוציטים מאבדים את המאפיינים התאיים שלהם, מראים מורפולוגיה תאית עגולה, ומחזירים פחות תאים חיוביים ל-GFP ביום הראשון בהשוואה לימים שלאחר מכן.
כמה ימים לאחר מכן, הטלוציטים מציגים מורפולוגיית תא קטנה ומתוחה עם תהליכים תאיים קצרים. לאחר שבעה עד 10 ימים של זריעה, הטלוציטים חוזרים למאפיינים התאיים שלהם, ומראים מורפולוגיה תאית גדולה ומתוחה עם תהליכים ציטופלזמיים ארוכים. ציטומטריית זרימה חושפת את הרכב התא.
בסך הכל, 69% מהתאים המבודדים היו בני קיימא בהתבסס על צביעת DAPI. ומתוכם, 60.9% ייצגו זיהום אפיתל ותאי מערכת החיסון והאנדותל. מקטע הטלוציטים התפזר מעל 100k ו-70k FSC ו-SSC, בהתאמה, וייצג כמעט 10% מהמזנכימה המגודרת.
ניתוח FACS גילה כי ניתן להגדיר את תת-הקבוצה של טלוציטים על ידי צביעה חיובית ל- CD201 ו- GP38. בדיקה חיסונית של מזנכימה בתרבית חד-יומית באמצעות סמנים אלה הראתה ביטוי של סמנים מולקולריים אלה, למרות שהתאים לא הציגו את המאפיינים התאיים שלהם. הליך זה מביא להשעיה בת קיימא של תא בודד של תאי סטרומה, אשר ניתן להשתמש בהם לא רק לתרבית דו-ממדית אלא לכל יישום אחר, כגון תרבית משותפת תלת-ממדית עם אורגנואידים או הדפסה ביולוגית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד מזנכימה של מעי עכברים, עם דגש על מיצוי של תאי טלוציטים (telocytes). מטרת השיטה היא לשפר מערכות של שיתוף-תרבית עם אורגנואידים, כדי לספק ייצוג מדויק יותר של סביבת הרקמה המקורית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- הנדסת רקמות
רקע
- טלוציטים (Telocytes) הם תאים מתמחים בתוך המזנכימה של המעי.
- הם ממלאים תפקיד באינטראקציות בין תאים ובהומאוסטזיס של הרקמה.
- בידוד של טלוציטים חיוניים הוא קריטי לחקר תפקודיהם.
- ייתכן שפרוטוקולים קיימים לא יניבו כמויות מספיקות של תאים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד מזנכימה של המעי ותלוקיטים (telocytes).
- הקלה על חקר האינטראקציות של תלוקיטים במצב בריאות ובמחלה.
- אספקת מקור של מולקולות איתות לצמיחה ex vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מקטעים של המעי נשטפו ונחתכו לחלקים קטנים.
- תאים הופרדו באמצעות עיכול אנזימטי וניעור מכני.
- נעשה שימוש בציטומטריה של זרימה (Flow cytometry) כדי לנתח את חיוניות התאים והרכבם.
- נעשה שימוש בצביעה אימונוהיסטוכימית כדי לזהות תלוציטים (telocytes) ולהעריך את מאפייניהם.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול הניב אחוז גבוה של תלוציטים (telocytes) חיים.
- ציטומטריה של זרימה העידה כי 10% מהתאים המבודדים היו תלוציטים.
- התלוציטים החזירו לעצמם את המורפולוגיה שלהם לאחר מספר ימים בתרבית.
- צביעה אימונוהיסטוכימית אישרה את הביטוי של סמנים ספציפיים בתלוציטים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת מקור בר-קיימא של תאים מסוג telocytes לצורכי מחקר.
- ניתן להשתמש ב-telocytes מבודדים ביישומים שונים, כולל תרבית משותפת של אורגנואידים.
- הממצאים מחזקים את ההבנה לגבי תפקידי ה-telocytes בביולוגיה של המעי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד יעיל של תלוקיטים (telocytes) חיוניים ממזנכימה של מעי עכברי מאפשר מידול מתקדם של נישת תאי הגזע במעי ושל אינטראקציות בין-תאיות הקריטיות להומיאוסטזיס של הרקמה. פרוטוקול זה תומך במערכות ex vivo בעלות נאמנות גבוהה, ומקל על מחקרים חיזויים של סיגנלינג סטרומלי-אפיתלי ודינמיקה של גורמי גדילה. השיטה משפרת את הרצף התרגומי מהביולוגיה של הגילוי ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים בתיקי מחקר של מערכת העיכול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי העברה של איתות המתווכים על ידי תאי טלוציט הרלוונטיים לוויסות תאי גזע במעי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקה של מקור מוגדר של תאי מזנכימה התומכים בנישה.
- מקל על תיקוף תפקודי של יעדים עבור גורמים סטרומליים המשפיעים על התרבות אפיתלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת תרחיפי תאים בודדים מאומתים המתאימים לצביעה אימונוכימית כמותית ולציטומטריה של זרימה.
- מאפשרת הכנה הדירה של אוכלוסיות תאים מזנכימליים לפיתוח מערכי תרבית משותפת (co-culture).
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי שימור תכונות אנטיגניות ופונקציונליות של תאי טלוציט (telocytes).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר שילוב של מזנכימה עשירה בתלוציטים (telocytes) במערכות של שיתוף-תרבית של אורגנואידים, לצורך הדמיה של סביבות רקמה טבעיות.
- משפר את הרלוונטיות התרגומית על ידי אפשור תמיכה באורגנואידים ללא תלות בגורמי גדילה, המשקפת תנאי in vivo.
- מקל על קידום מותאם-סיכונים של מודלים פרה-קליניים למחקר של מחלות במערכת העיכול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה מציג את בידוד התלוציטים כשלב בסיסי המגשר בין גילויים ראשוניים, פיתוח בדיקות ואופטימיזציה של מודלים תרגומיים במסגרת תהליכי עבודה במחקר של מערכת העיכול.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של אינטראקציות סטרומליות-אפיתליאליות ואיתות המתווך על ידי Wnt.
- סריקה: מספק תרחיפי תאים כמותיים הניתנים לשחזור עבור אימונופנוטיפיקה ומיון בשלבים הבאים.
- אנליטיקה: מאפשר כימות של אוכלוסיות תלוקיטים (telocytes) וחיוניות באמצעות ציטומטריית זרימה וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- מחקר תרגומי: מתאים מערכות של תרביות משולבות (co-culture) in vitro למבנה רקמתי in vivo לצורך מחקרי ביומרקרים ומנגנונים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול הניתן לשימוש חוזר ליצירת מקורות תאים מזנכימליים במספר תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במידול של ביולוגיית הנישה המעית וסיגנלינג סטרומלי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד תאים מסוג telocytes חיוניים ורלוונטיים תפקודית לשימוש מחקרי בר-הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרים של אינטראקציות סטרומליות-אפיתליות, ובכך תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי המשכת המחקר (go/no-go).
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים בתחום מערכת העיכול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפירוק רקמות ובטיפול בתאים בודדים כדי לשמר את חיוניות התלוציטים (telocytes).
- נדרשת גישה לתשתית של ציטומטריה זרימתית וצביעה אימונוהיסטוכימית לצורך זיהוי וכימות של התאים.
- נדרש סטנדרטיזציה של שלבי הפרוטוקול בין צוותים שונים כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין ניסויים.
- עשוי לדרוש התאמה לשימוש עם מקורות רקמה או מינים שונים, כפי שנתמך על ידי הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות זיהום של תאי אפיתל ותאי מערכת החיסון, דבר הדורש בחירת סממנים וביצוע gating קפדניים.
