Name: בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למד שיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית בעופות באמצעות עוברי תרנגולות. הטכניקות מספקות תובנות חשובות לגבי ניוון תאי שיער ואפשרויות טיפול בקהות שמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים על תמיכה מ-NCBS, TIFR, מענק מחקר מוביל של Infosys-TIFR, DST-SERB והמכון הלאומי המלכותי לחירשים. ברצוננו להודות לארגון פיתוח עופות מרכזי ומכון הכשרה, Hesaraghatta, בנגלור. אנו אסירי תודה לתמיכת המתקן והמעבדה של CIFF ו- EM ב- NCBS. אנו מודים ליושיקו טקהאשי וקויצ'י קוואקאמי על בניית Tol2-eGFP ו- T2TP, ולגיא ריצ'רדסון על נוגדן HCA ו- G19 Pcdh15. אנו מודים לחברי ארלאב על תמיכתם המתמדת והמשוב החשוב שלהם על הפרוטוקול.

<ol><li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+inner+ear+development%3A+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).</li>
<li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li>
<li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li>
<li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bundle+links%3A+genetics+as+the+gateway+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).</li>
<li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments%2C+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li>
<li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li>
<li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+Wnt+signaling%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1(2012).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833(2016).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li>
<li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li>
<li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li>
<li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+development+and+regeneration%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li>
<li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feathers+and+fins%3A+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li>
<li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li>
<li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li>
<li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments%2C+stereocilia%2C+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li>
<li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li>
<li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+labyrinth%3A+culture+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li>
<li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%3A+an+explant+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994(2020).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2021 (11), (2021).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li>
<li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li>
<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li>
<li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li>
<li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1%3A+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li>
<li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li>
<li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li>
<li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li>
<li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li>
<li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+and+web+resources+in+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312(2020).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

הגוזל הוא תוספת חסכונית ונוחה לאורגניזמי המודל שמעבדה עשויה להשתמש בהם כדי לחקור את האוזן הפנימית. השיטות המתוארות כאן משמשות באופן שגרתי במעבדה שלנו ומשלימות מחקר מתמשך באוזן הפנימית של היונקים. ב ovo אלקטרופורציה משמש כדי להציג מניפולציות גנטיות לתוך הגנום אפרוח. אלקטרופורציה יכולה לשמש גם כדי להציג מבנים המקודדים חלבונים פלואורסצנטיים המיועדים לאברונים מסוימים או למבנים תת-תאיים35,36. אמנם מדובר בהליך פשוט, אך מניפולציה של עוברים ב- ovo אכן מ...

האוזן הפנימית של כל בעלי החוליות נגזרת מאפיתל פשוט המכונה placodeotic 1,2. זה יוליד את כל האלמנטים המבניים ואת סוגי התאים הדרושים כדי להמיר את המידע mechanosensory הקשורים שמיעה ותפיסת שיווי משקל. תאי השערה (HCs), החיישן הציליאטי של האוזן הפנימית, מוקפים בתאים תומכים (SCs). HCs מעבירים מידע למוח האחורי השמיעתי דרך הנוירונים של עצב הגולגולת השמיני. אלה נוצרים גם מן placode otic3. ההתמרה הראשונית של הצליל מושגת על פני השטח האפיקליים של HC השמיעתי, באמצעות צרור שיער רגיש מכנית4. זה מתווך באמצעות בליטות מבוססות אקטין מותאמות הנקראות סטריאוציליה, המסודרות בתבנית מדרגות מדורגת5. בנוסף, cilium ראשוני שונה, הנקרא kinocilium, מארגן היווצרות צרור שיער והוא צמוד לשורה הגבוהה ביותר של סטריאוציליה 6,7,8. הארכיטקטורה של סטריאוציליה היא קריטית לתפקיד זה בהמרת גירויים מכניים הנגזרים מאנרגיה אקוסטית לאותות עצביים חשמליים9. נזק ל-HC השמיעתי כתוצאה מהזדקנות, זיהום, טראומה אוטואקוסטית או הלם אוטוטוקסי עלול לגרום לליקוי שמיעה חלקי או מלא, שביונקים הוא בלתי הפיך10.
הוצעו טיפולים תחליפיים תאיים שעשויים לתקן נזק כזה11,12. הגישה של מחקר זה הייתה להבין את ההתפתחות התקינה של תאי השערה של יונקים ולשאול אם ניתן להתחיל מחדש תוכניות התפתחות בתאים דמויי אב שעשויים להתקיים בתוך האוזן הפנימית13. גישה שנייה הייתה להסתכל מחוץ ליונקים, אל בעלי חוליות שאינם יונקים שבהם מתרחשת התחדשות חזקה של תאי שערה שמיעתיים, כגון ציפורים14,15. אצל ציפורים, התחדשות תאי השערה מתרחשת בעיקר באמצעות דה-דיפרנציאציה של תא תומך למצב דמוי אב, ולאחר מכן חלוקה מיטוטית אסימטרית ליצירת תא שערה ותאתומך 16. בנוסף, הבחנה ישירה של תא תומך ליצירת תא שערה נצפתה גם17.
בעוד שהמנגנונים של התפתחות שמיעת העופות מראים דמיון משמעותי לזה של יונקים, ישנם הבדלים18. התמיינות HC ו-SC באפרוח BP ניכרת מיום עוברי (E) 7, והופכת מובחנת יותר עם הזמן. על ידי E12, ניתן לדמיין פפילה בזילרית (BP) מעוצבת ומקוטבת היטב, ועל ידי E17 ניתן לראות תאי שיער מפותחים היטב19. נקודות זמן אלה מספקות חלונות למנגנונים של התמיינות, דפוס וקוטביות, כמו גם התבגרות תאי שערה. ההבנה אם מנגנונים כאלה נשמרים או מסתעפים היא חשובה, שכן הם מספקים תובנות על ההומולוגיה העמוקה של מקורות תאי השערה המכנו-חושיים.
כאן אנו מדגימים מגוון טכניקות המבוצעות בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחרים כדי לחקור תהליכים תאיים כגון התפשטות, אפיון גורל, התמיינות בתבניות ותחזוקה לאורך התפתחות איבר האוזן הפנימית. זה משלים פרוטוקולים אחרים על הבנת התפתחות האוזן הפנימית בתרבית explant20,21,22. תחילה נדון בהחדרת דנ"א אקסוגני או רנ"א למבשרי BP בתוך האוטוציסט E3.5 באמצעות אלקטרופורציה של ovo. למרות שמניפולציות גנטיות יכולות לספק תובנות חשובות, הפנוטיפים שנוצרו כך יכולים להיות פליאוטרופיים וכתוצאה מכך מבלבלים. זה נכון במיוחד במהלך התפתחות מאוחרת יותר של האוזן הפנימית, שבה תהליכים בסיסיים כגון שיפוץ ציטוסקטלי ממלאים תפקידים רבים בחלוקת תאים, מורפוגנזה של רקמות והתמחות תאית. אנו מציגים פרוטוקולים לעיכוב פרמקולוגי במרגלים מתורבתים, המציעים יתרונות בשליטה על תזמון ומשך הטיפול והטיפול, ומציעים מניפולציה מרחבית-טמפורלית מדויקת של מנגנוני התפתחות.
ניתן להשתמש בשיטות שונות של תרבית איברים בהתאם למשך הטיפול במעכבים קטנים. כאן אנו מדגימים שתי שיטות של תרבית איברים המאפשרות תובנות על מורפוגנזה אפיתליאלית והתמחות תאית. שיטה לתרבית תלת-ממדית המשתמשת בקולגן כמטריצה לתרבית צינור השבלול מאפשרת התרבות החזקה והדמיה חיה של ה-BP המתפתח. להבנת היווצרות הסטריאוציליה, אנו מציגים שיטת תרבית ממברנה כך שרקמת האפיתל עוברת בתרבית על מטריצה נוקשה המאפשרת לבליטות אקטין לגדול בחופשיות. שתי השיטות מאפשרות עיבוד במורד הזרם כגון הדמיית תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM), הקלטת תאים וכו '. טכניקות אלה מספקות מפת דרכים לשימוש יעיל בגוזל כמערכת מודל להבנה ולמניפולציה של ההתפתחות, ההבשלה וההתחדשות של אפיתל השמיעה של העופות.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>1081061</td><td>חלבון Cas9 נאמנות גבוהה</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>ארנב פוליקלונלי</td></tr><tr><td>לסרום בקר GFP אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>קולגן I, זנב עכברוש</td><td>תרמו פישר A1048301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיינטיפיק מייבש נקודה קריטית Leica EM CPD300</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 אלקטרופורטור</td><td>נפאגן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B מיקרוסקופ שדה רחב</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובט</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>FCF</td> <td>ירוק מהירSigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>FLUOVIEW 3000 מיקרוסקופ סריקת לייזר</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד (25%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני IgG נגד עכברים, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG משני נוגדן, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני IgG נגד ארנב, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים סטרילי מסונן</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td><td>תמיסת מלח מאוזנת בחום</td></tr><tr><td>(HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell תרבית תאים, 30 מ"מ, PTFE הידרופילי, 0.4 ומיקרו; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 מיקרוסקופ סטריאו</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A נוגדן</td><td>DSHB</td><td>138-1</td><td>עכבר חד שבטי למיוזין לא קונבנציונלי-VIIa</td></tr><tr><td>MZ16 מיקרוסקופ ניתוח</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 תוסף (100X)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>מספריים נויס, 14 ס"מ (5.5 אינץ' ')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד (4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10</td><td>Puller Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>מיני וקטור עם מקדם U6 עוף שונה</td></tr><tr><td>פניצילין G מלח</td> <td>נתרןSigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 מיקרוסקופ ניתוח</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן קקודילאט מאגר, 0.2M</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>Sputtre Coater K550X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית סטנדרטיים 3 אינץ', OD 1.0 מ"מ, ללא נימה</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>ה-MERLIN Compact VP</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>אלפא Aesar</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

האוזן הפנימית קולטת צלילים ושומרת על איזון באמצעות השבלול והפרוזדור. הוא עושה זאת על ידי שימוש בסוג תא מכניו-חושי ייעודי המכונה תא השערה. מחקר בסיסי באוזן הפנימית הוביל להבנה עמוקה של האופן שבו תאי השערה מתפקדים, וכיצד חוסר ויסות יכול להוביל לליקוי שמיעה ולסחרחורת. לצורך מחקר זה, העכבר היה מערכת המודל הבולטת ביותר. עם זאת, עכברים, כמו כל היונקים, איבדו את היכולת להחליף תאי שערה. לכן, כאשר מנסים להבין טיפולים תאיים לשיקום תפקוד האוזן הפנימית, מחקרים משלימים במינים אחרים של בעלי חוליות יכולים לספק תובנות נוספות. האפיתל השמיעתי של ציפורים, הפפילה הבזילרית (BP), הוא יריעה של אפיתל המורכבת מתאי שערה מכנו-חושיים (HCs) המשולבים על ידי תאים תומכים (SCs). למרות שהארכיטקטורה האנטומית של הפפילה הבזילרית והשבלול של היונקים שונה, המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית והשמיעה דומים. זה הופך את הפפילה הבזילרית למערכת שימושית לא רק למחקרים השוואתיים אלא גם להבנת התחדשות. כאן נתאר טכניקות דיסקציה ומניפולציה לאוזן הפנימית של התרנגולת. הטכניקה מציגה שיטות עיכוב גנטיות ומולקולות קטנות, המציעות כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית. במאמר זה, אנו דנים בטכניקות אלקטרופורציה של ovo כדי להפריע גנטית לפפילה הבזילרית באמצעות מחיקות CRIPSR-Cas9, ולאחר מכן דיסקציה של הפפילה הבזילית. אנו גם מדגימים את תרבית איברי BP ושימוש אופטימלי במטריצות תרבית, כדי לבחון את התפתחות האפיתל ותאי השערה.

במערך האלקטרופורציה, מיקום אלקטרודות יכול למלא תפקיד בתחום הטרנספקציה. האלקטרודה החיובית ממוקמת מתחת לחלמון, והשלילית מעל העובר (איור 1A). התוצאה היא ביטוי GFP גבוה יותר בחלק גדול מהאוזן הפנימית ובשני איברי שיווי המשקל (איור 1B), ופפילה בזילרית שמיעתית (איור 1C,D), המאשרת את הטרנספקציה.
כדי להעריך את הפנוטיפ של קריספר-נוק-דאונים, עיצבנו רנ"א מנחים לגורם השעתוק של תאי השערה Atonal homolog ...

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

גיל, זיהום ותרופות אוטוטוקסיות עלולים לגרום לניוון תאי השערה של האוזן הפנימית, מה שמוביל אצלנו לירידה בשמיעה. אצל בעלי חוליות שאינם יונקים, כגון אפרוח, תאי השערה יכולים להתחדש. הטכניקות המתוארות כאן עושות שימוש בעלות התועלת של עבודה על עוברי אפרוחים, בקלות השגת העוברים ובפיתוח אקסו טוב של צמחי רקמות.הבנת ההתפתחות וההתחדשות של שערות האוזן הפנימית של העופות יכולה לספק תובנות חשובות לגבי ליקוי שמיעה וטיפולים פוטנציאליים, ותרבית צמחים יכולה להיות חשובה להערכת ההשפעות האוטוטוקסיות של תרופות שונות. לפני תחילת הניסוי, רכשו ביצים טריות, ונקו אותן עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום. לדגור על הביצים במשך 3.5 עד 4 ימים, ב 37 עד 38 מעלות צלזיוס עם 45% לחות.לאחר הדגירה, מקם מחדש את העובר לחלק העליון של החלמון, על ידי הנחת ביצית על צדו במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי ליצור חור קטן בחלק העליון והקצה הקהה של הביצה כדי שמחט של 21 מדים תעבור דרכה. בעזרת מזרק של חמישה מיליליטר ומחט של 21 מיליליטר, מוציאים שני מיליליטר של האלבומין מחור בקצה הבוטה של הביצה.מכסים את החור בקצה הקהה באמצעות סרט שקוף. כדי לגרום לחלון הביצה להדביק את הסרט השקוף לחלק העליון של קליפת הביצה. החזיקו את המחטים ממיקרו-הזרקה מנימי זכוכית סטנדרטיים באמצעות מושך פיפטה אנכי.לאחר המשיכה, נתקו את קצה הנימים באמצעות מלקחיים עדינים כדי לקבל קוטר קצה של כ-50 מיקרומטר עם קצה מחודד. עבור ניסוי נוקאאוט הגנים, ערבבו את שלושת המבנים, כלומר פלסמיד המנחה, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP ביחס של אחד לאחד עם מיקרוגרם אחד של חלבון SP Cas9, 30% סוכרוז וצבע ירוק מהיר ב-0.1%, ונפח סופי של 10 מיקרוליטרים. בעת אלקטרופולציה של פלסמידים מרובים, ודא שהריכוז הסופי של הדנ"א הוא לפחות ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.בעזרת מספריים קפיציים לחתוך פתוח סביב חלון באורך שני סנטימטרים ו 1.5 ס"מ רוחב, ולחשוף את העובר. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הקרומים הכוריוניים מעל העובר, ולאפשר גישה לעובר. להזריק כ-200 ננוליטר נפח של תערובת תמיסות DNA כדי למלא את שלפוחית השקית.כדי לקבוע את יעילות ה- RNA המנחה בצע בדיקת אנדונוקלאז T7. יש להוסיף לעובר טיפות מלח של 0.719% כדי להוריד את ההתנגדות החשמלית ולמנוע התחממות יתר. לאחר מכן, מניחים את האלקטרודה החיובית דרך החור שנעשה בצד הבוטה של הביצה, ומתמרנים את האלקטרודה כך שהיא תהיה מתחת לחלמון.מניחים את האלקטרודה השלילית מעל האוטוציסטה המלאה. כדי להעביר את הפלסמיד לתוך שלפוחית otic עם electroporation, להשתמש מחולל פולסים מרובע, ולהחיל חמש פולסים של 25 וולט במשך 100 אלפיות השנייה כל אחד, 50 אלפיות השנייה זה מזה. קבע את התנאים באופן אמפירי בהתבסס על מערך אלקטרופורציה בודד.לאחר אלקטרופורציה, לחות את העובר על ידי הוספת כמה טיפות של 0.719% מלוחים. אטמו מחדש את הביצה בנייר דבק שקוף, וחזרו לאינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 עד 38 מעלות צלזיוס להמשך הדגירה. יש לחטא את שולחן הניתוחים, שלב המיקרוסקופ והסביבה באמצעות 70% אתנול וחום, או לעקר באלכוהול את ציוד המיקרו-דיסקציה, כולל מספריים קפיציים מינימליים, מיקרו קורט ושני זוגות מלקחיים עדינים.הכינו את צלחות הדיסקציה הכוללות צלחת פטרי זכוכית עם בסיס סיליקון שחור, צלחת פטרי מפלסטיק 90 מילימטר וצלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר. שמור על PBS מקורר או תמיסת מלח מאוזנת של Hanks הידוע גם בשם HBSS מוכן לנתיחות. מפצחים בעדינות את הביצה לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מילימטר.לאחר מכן לזהות את האוזן החיצונית של הגוזל, ולהעביר את הראש לצלחת פטרי 60 מ"מ מלא PBS קר כקרח. לאחר מכן, כוון את העובר כאשר החלק העליון של המקור פונה פנימה, והחזק את המקור באמצעות אחד ממלקחיים מספר חמש. הוציאו את העיניים בעזרת המלקחיים השניים מספר חמש.לאחר מכן, מרוסטרל לקאודל, חותכים לאורך הגולגולת לאורך קו האמצע שלה, ומוציאים את המוח החוצה. הוסיפו עוד PBS קר כקרח, או HBSS, ואתרו את שני האוטוליטים של הלגנה כמבנים מבריקים בקצה צינור השבלול, וקרוב לקו האמצע. כדי לבודד שתי אוזניים פנימיות, חותכים בין שתי הלגנות, והרבה מעל ומתחת לאזור.ואז תחת תאורה אלכסונית לדמיין את קווי המתאר של האוזן הפנימית, ולהסיר רקמות חיצוניות ואת הפרוזדור. העבירו את השבלול המבודד לצלחת בסיס מסיליקון שחור עם PBS קר כקרח. יש לקלף את כמוסת השבלול הסחוסית באמצעות מספר חמש מלקחיים כדי להשיג את צינור השבלול.לאחר מכן אתרו את השכבה הגלית או הטגמנטום של צינור השבלול, והסירו אותה באמצעות מלקחיים מספר 55 כדי לחשוף את הפפילה הבזיליארית או BP. לאחר מכן, הסר את הממברנה הטקטוריאלית כדי לחשוף תאי שערה ותאים תומכים באמצעות מלקחיים מספר 55. עבור תרבית ממברנה של הפפילה הבזילרית, קח צלחת תרבית רקמה של שש בארות, וסדר ממברנת תרבית אחת לכל באר. ציירו כמה מדיות בפיפטה של 200 מיקרוליטר, ואז שאפו את צמח הפפילה הבזילרי המנותח עם חיץ HBSS X אחד.מעבירים את הצמח על קרום, ומכוונים אותו כך שהפאפילה הבזילרית פונה כלפי מעלה, והשיער ותאי התמיכה נראים מלמעלה. ברגע שהדגל ממוקם לשאוף את חיץ HBSS לאט מפני השטח של קרום התרבית. בתהליך זה יתחבר האקסצ'ר לקרום התרבית.מלא את הבאר של צלחת שש הבאר על ידי הוספת 1.2 מיליליטר של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו, או מדיה תרבותית DMEM, בין תוסף הממברנה לדופן הבאר. כדי להכין את תרבית הקולגן של צינור השבלול, הוסיפו שלוש טיפות של תערובת קולגן טרייה לכל באר של צלחת ארבע בארות, והעבירו את צינור השבלול המנותק לכל טיפת קולגן. דגרו את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו-חמצני כדי לרפא את מטריצת הקולגן.לטיפול במולקולה קטנה של התרביות, החליפו את מדיית התרבית ב-700 מיקרוליטרים של מדיה בתוספת המודולטור הפרמקולוגי, כגון פניצילין, ודגרו על הצלחות כפי שהוכח קודם לכן. החלף 50% מהתקשורת התרבותית מדי יום. לאחר זמן הדגירה המתאים, הסר את מדיית התרבית, והשתמש בצמחים לבדיקות במורד הזרם.במערך האלקטרופורציה, מיקום האלקטרודה הנכון הביא לביטוי GFP גבוה יותר באוזן הפנימית בשני איברי שיווי המשקל, ופפילה בזילרית שמיעתית המאשרת טרנספקציה. קריספר Cas9 תיווך נוקאאוט גן Atoh1 באוזן הפנימית, הביא לאובדן תאי שיער. נוקאאוט של הגן Atoh1 באמצעות אובו-אלקטרופורציה ואחריו דגירה עד ש-E10 הראה התפתחות מופחתת של תאי שיער בהשוואה לבקרת פלסמידים ריקים.אף על פי שאלקטרופורציה היא פסיפס, תאי בקרה אלקטרופואטיים הצליחו ליצור תאי שערה. בדגימות אלקטרופורציה של Atoh1 gRNA, תאים חיוביים של חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים מעולם לא הראו את הסמנים של התפתחות תאי שיער. תרבית האיברים של הפפילה הבזילרית במטריצה תלת-ממדית, כגון, קולגן וכתם עם נוגדנים כנגד אנטיגן תאי שיער סיפקו שימור מצוין של מורפולוגיה של רקמות למשך עד חמישה ימים.ארגון תאי השערה והתאים התומכים נשמרו בתנאי תרבית אלה. ניתן לשמור על תרביות האיברים על הממברנה עד חמישה ימים תוך שמירה על שלמות צרור השיער. ניתן לראות זאת בתמונה הייצוגית על ידי לוקליזציה של חלבון קישור הקצה, פרוטוקדהרין 15.כדי לחקור את התפתחות חבילת השיער, הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, כגון, מיקרוסקופיית סופר-רזולוציה או מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת יכולה לספק מידע נוסף. תנאים סטריליים צריכים להישמר לאורך כל ההליך. בזמן האלקטרופורציה, יש לוודא שהעוברים אינם מתייבשים.כאשר מעכבים פרמקולוגיים, ניתן להפחית את הריכוז כדי להתגבר על כל קטלניות. ניתן לקחת גם עוברים וגם צמחים לניסויים בהדמיה. או על ידי ביצוע מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת, או מיקרוסקופ אלקטרונים קונפוקלי אור סטטי, כפי שמוצג בפרוטוקול.בהתחשב בקלות ובנגישות של שימוש בצמחים באוזן הפנימית של אפרוחים, אנו יכולים להשתמש במדיום באמצעות סינון הוכחות כדי לזהות מולקולות חדשות החיוניות להתחדשות תאי השיער.

in-ovo-and-ex-ovo-methods-to-study-avian-inner-ear-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח...

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

כאן אנו מתארים טכניקת microdissection אחרי הזרקת הצבע פלואורסצנטי לגנגליון אקוסטית של עוברי חומוס מוקדמים לאיתור סלקטיבי של סיבים שמיעתיים האקסון בעצבים והמוח האחורי.

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).

מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת פרוסות גזע מוח שמיעתיות שאינן קורונליות של עובר העוף לחקר תכונות טונוטופיות ומסלולים התפתחותיים בתוך פרוסת גזע מוח אחת. פרוסות אלה כוללות מקטעים סגיטליים, אופקיים ואופקיים/רוחביים המקיפים אזורים טונוטופיים גדולים יותר בתוך מישור פרוסה בודד שהמקטעים הקורונליים המסורתיים.

חיתוך גזע המוח השמיעתי של העוף העוברי להערכת שיפועים טונוטופיים ומיקרו-מעגלים

השתמשנו בטכניקות סטנדרטיות של תגובה לגזע מוחי שמיעתי (ABR) ויישמנו אותן על תרנגולות בוקעות, מודל עופות מקדים לתפקוד שמיעתי. הפרוטוקול מתווה בפירוט את הכנת בעלי החיים ואת טכניקות רכישת ABR, עם שלבים שיכולים להיות מתורגמים למודלים אחרים של עופות או מכרסמים.

הערכה של תגובת גזע המוח השמיעתי באבקועים עופות

פרוטוקול זה, המיועד למשתמשים מתחילים ברקמת האוזן הפנימית של העכבר, מפרט באופן מקיף שלבים לעיבוד אוזניים פנימיות של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצביעה חיסונית של חתך.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

למד שיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית בעופות באמצעות עוברי תרנגולות. הטכניקות מספקות תובנות חשובות לגבי ניוון תאי שיער ואפשרויות טיפול בקהות שמיעה.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

גלה סרטונים נוספים