בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים

אסטרוציטים הם אוכלוסייה אוטוגנית מעניינת שיש לכוון אליה לתכנות עצבי ישיר. פרוטוקול זה מספק טכניקה אמינה לבידוד אסטרוציטים תרבותיים בעלי טוהר גבוה מאזור שונה או ממערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתוכנן וממוטב כדי לחקור את יכולתם של אסטרוציטים להיות מתוכנתים מחדש לנוירונים פונקציונליים ללא גורמים מבלבלים כגון הבדלים בטוהר האסטרוציטים של אוכלוסיות סטארט-אפ שונות.

הדגמת ההליך תיעשה על ידי בוב הרשבאך, פוסט-דוקטורנט במעבדה, וטטיאנה סיימון סיוע טכני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, מניחים את פלג גופו העליון של עכבר מורדם בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ ושומרים אותו על קרח. פתח את העור עם מספריים והסר את החוליה עם מספריים קטנים.

לאחר מכן לחלץ את חוט השדרה ומניחים אותו בחיץ דיסקציה על קרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאוטקטי עם הגדלה של פי שניים, הסר את קרומי המוח מחוט השדרה המבודד באמצעות מלקחיים והעביר רקמת חוט שדרה שנכרתה ונוקתה לצינור C. הוסף 50 מיקרוליטרים של אנזים P מתוך ערכת הדיסוציאציה של רקמות עצביות ו-30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים שהוכנה בעבר לכל צינור C.

הפוך את צינורות C והנח אותם על מחומם מנותק להבטיח כי כל הרקמה נאספת במכסה של הצינור. לחמוק מתאים על ידי הסרת העמודה מהמפריד הוספת 800 מיקרוליטרים של תרבית אסטרוציטים מדיום ודחיפת תאים אל מחוץ לעמודה עם הבוכנה הכלולה. תאי צלחת בבקבוקוני התרבית שהוכנו בעבר על ידי הוספת 4.2 מיליליטר של תרבית אסטרוציטים בינונית בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של EGF ו- bFGF.

אין צורך לצפות את צלוחיות התרבית עבור אסטרוציטים המבודדים מאזורי מוח אחרים, אך הוא מספק מצע טוב יותר לאסטרוציטים המבודדים מחוט השדרה. תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. בצע ישיבת אסטרוציטים מתחת לארון בטיחות ביולוגי עם רמת בטיחות אחת והכן 24 לוחות באר עם כיסויי זכוכית מצופים Poly-D-Lysine כמתואר בכתב היד של הטקסט.

עבור ציפוי, לבודד שישה חוטי עמוד שדרה מעכברי P2 מניב כמיליון תאים. שאפו מדיה מבקבוקי התרבית T-12.5 המכילים את האסטרוציטים המתורבתים ושטפו פעם אחת עם PBS אחד. נתקו את האסטרוציטים מבקבוק התרבית על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הקש בעדינות על צד הבקבוקון כדי לשחרר תאים ממשטח בקבוק התרבית ובדוק ניתוק תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות הגדלה של פי 10. להפסיק טריפסינאזציה עם 2.5 מיליליטר של תרבית אסטרוציטים בינוני ולאסוף השעיית תאים בצינורות 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב-300 RCF למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו תאים סופרנאטנטים ושלחו מחדש במיליליטר אחד של מדיום תרבית אסטרוציטים. חשב את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר או מערכת ספירת תאים אוטומטית. בהתבסס על מספר התאים, דילל את תרחיף התא עם מדיום אסטרוציטים טרי בתוספת EGF ו- bFGF ב 10 ננוגרם למיליליטר לכל גורם.

הוסף 500 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של 24 צלחות באר מוכנות מראש ותאי תרבית ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הכן מדיום התמיינות עצבית על ידי הוספת תוסף B27 מיליליטר אחד ל -49 מיליליטר של מדיום תרבות בסיסי. לאחר 24 עד 48 שעות, תלוי אם התאים התמרו או עברו טרנספקציה, החלף את מדיום האסטרוציטים במדיום התמיינות עצבית של מיליליטר אחד לכל באר.

תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% פחמן דו חמצני. כדי להגביר את יעילות התכנות מחדש, השלימו את מדיום ההתמיינות העצבית עם פורסקולין ודורסומורפין לריכוז סופי של 30 מיקרומולאר ומיקרומולר אחד בהתאמה בעת החלפת תווך האסטרוציטים במדיום ההתמיינות. כאשר בוחרים לטפל בתאים עם פורסקולין ודורסומורפין מספקים מנה שנייה של דורסומורפין יומיים לאחר הטיפול הראשוני.

הוסף את הטיפול השני ישירות למדיום התרבית. תרביות ראשוניות של אסטרוציטים הגיעו למפגש של 80% עד 90% בין שבעה לעשרה ימים לאחר מיון וציפוי תאים בסיוע מגנטי. יום לאחר הציפוי, התאים כיסו בדרך כלל 50% עד 60% ממשטח הכיסוי.

תרביות כללו בעיקר אסטרוציטים בשלב זה, בעוד שסוגי תאים אחרים כגון פיצוצים עצביים נעדרו כמעט לחלוטין. בשבעה ימים לאחר ההתמרה או הטרנספקציה, ניתן היה להבחין בבירור בין תאי עצב מושרים לבין אסטרוציטים. הסומא התאית העצבית הייתה קטנה יותר מאשר אסטרוציטים שלא תוכנתו היו בעלי תהליכים ארוכים והייתה חיובית עבור סמן עצבי, בטא שלוש טובולין, ושלילית עבור סמן אסטרוציטים GFAP.

ב-21 ימים לאחר ההתמרה או הטרנספקציה, תאי עצב מושרים רבים היו מסוגלים לירות פוטנציאל פעולה והיו חיוביים עבור הסמן העצבי הבוגר NeuN והחלבון הפאן-סינפטי Synaptophysin. זה חיוני כדי לנתח כראוי את האזור של עניין. הימנעות מזיהום מהרקמה הסובבת.

יש להקפיד על הסרת קרום המוח וגרעיני שורש דורסו מחוט השדרה המבודד. שיטה זו יכולה לשמש לבידוד אסטרוציטים מאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית, כולל קליפת המוח, המוח האמצעי הגבי והמוח הקטן. בעתיד, טכניקה זו תאפשר לנו להרחיב את הידע שלנו על אסטרוציטים אזוריים ועל הפוטנציאל שלהם להיות מתוכנתים מחדש לנוירונים פונקציונליים.