תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה מציע את חקירת המנגנון המקיף ואת הפיתוח הטיפולי של הידרדרות רשתית תלוית cGMP-PKG. מודל פרימאטים לא-אנושי אינדיבידואלי זה שומר על אישור רקמת הרשתית ואינטראקציות בין-תאיות המאפשרות סימולציה טובה יותר של תנאי in vivo. זה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים וזה מקצר את משך הניסוי.

מתן גישה ניסיונית מבוקרת לחקר התפתחות רשתית או ניוון. התחל את הכנת החצילים ברשתית על ידי שטיפת גלגלי העיניים שבודדו מקופי מקוק מסוג בר עם 10 מיליליטר של יוד פובידון 5% למשך 30 שניות. כדי למנוע זיהום חיידקי, טבלו את גלגלי העיניים בתמיסת PBS סטרפטומיצין 5% פניצילין למשך דקה אחת לפני הדגירה ב-10 מיליליטר של מדיום R16 למשך חמש דקות.

לאחר מכן לטבול את גלגלי העיניים ב 10 מיליליטר של חלבון Ace-K פתרון שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס מודגר במשך שתי דקות. בצע את הדגירה הבאה ב 10 מיליליטר של אחד עד אחד R16 בתוספת תמיסת סרום בקר עוברית במשך חמש דקות. תן שטיפה סופית ב 10 מיליליטר של R16 טרי.

לאחר שתסיים, להפריד את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית. ואז לחתוך את הרשתית מארבעה צדדים עם פינצטה ומספריים. לאחר מכן, השתמש בלהב עץ דק של ארבעה מיליליטר כדי לחתוך את הצמח ברשתית ב -1.5 מילימטר מצד האף, ארבעה מילימטר מהצד הרקתי ושני מילימטר מהצדדים העליונים והנחותים של ראש עצב הראייה.

לאחר מכן באמצעות להב דק עץ שישה מ"מ לחתוך את הצד המרכזי של explant הרשתית המכיל את הדיסק האופטי ואת מקולה. בעזרת צינור רחב, מושכים את צמח הרשתית המכיל את הרשתית והכורואיד ומניחים אותו במרכז האינסרט כשצד הפוטורצפטור כלפי מעלה. השקיעו לחלוטין את הרשתית במיליליטר אחד של המדיום המלא על הצלחת מתחת לקרום.

תרכבו את החצילים ברשתית והניחו אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לח. תן את הטיפול המתאים בריכוז התרופה לצמחים במשך ארבעה ימים. השתמש לפחות שלושה explants לכל תנאי טיפול ולהשתמש explants ללא התרופה כמו שליטה חיובית.

לתיקון וחתך קריו, יש לטפל בחצילים ברשתית עם מיליליטר אחד של אלדהיד פרפורם למשך 45 דקות. לאחר שטיפה קצרה עם מיליליטר אחד של PBS דוגרים סדרתית על הצמחים ב-10% סוכרוז למשך 10 דקות, 20% סוכרוז במשך 20 דקות ו-30% סוכרוז למשך 30 דקות. חותכים את הרשתית באופן אחיד עם ארבעה רבעים בפריפריה ושישה מילימטרים במרכז.

לאחר מכן מעבירים את החצילים ברשתית לקופסת פח בגודל של כ-1.5 על 1.5 על 1.5 ס"מ עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית המטמיעה מדיום המכסה את החציל. מיד מקפיאים את חלקי הרקמה בחנקן נוזלי ומכניסים אותם למקרר של 20 מעלות לאחסון. לאחר מכן, חותכים את האגר לגוש קטן המכיל את דגימת הרקמה.

מחלקים את הבלוקים לבלוקים של 10 מיקרומטר ומניחים את המקטעים על שקופיות מיקרוסקופ הדבקה באמצעות מברשת רכה. לאחר מכן יבשו את החלקים במשך 45 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס ואחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לצביעת גואנוזין מונופוספט מחזורי או cGMP, ציירו טבעת הידרופובית סביב חלקי הרשתית המיובשים בעזרת עט חוסם נוזלים וכסו את הדגימות.

טבלו את המגלשות ב-200 מיקרוליטר של 0.3% PBS ו-Triton-X100 או PBST למשך 10 דקות ולאחר מכן טיפול של שעה ב-200 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו על שקופית הדגימה למשך הלילה עם 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני שהוכנו בתמיסת החסימה בארבע מעלות צלזיוס ושטפו אותה שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות. לדגור את המגלשה ב 200 מיקרוליטר של נוגדן משני במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר שלוש שטיפות של PBS במשך 10 דקות, כסו את הדגימות באמצעי הרכבה נגד דעיכה המכיל DAPI ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. יבשו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות וציירו טבעת מחסום דוחה מים סביב דגימת רקמת הרשתית בעזרת עט חוסם נוזלים. לאחר הדגירה עם 40 מיליליטר של PBS במשך 15 דקות, לטפל בחלקים עם 42 מיליליטר של 0.05 טריס-באפר מולארי או TBS ב 37 מעלות צלזיוס.

שאפו את ה-TBS, דגרו על הדגימות עם שישה מיקרוליטרים של פרוטאינאז K במשך חמש דקות ושטפו שקופיות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת. חשוף את המגלשות ל 40 מיליליטר של תמיסת אתנול חומצה אצטית בצ'פלין. מכסים אותו בסדין שקוף ודגרים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBS במשך חמש דקות בכל פעם. חשוף את המגלשות ל-200 עד 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה או 1% BSA ודגר עליהן בתא לחות למשך שעה. בכ-130 מיקרוליטר של תמיסה אדומה TMR לכל שקופית ולאחר שעה, יש לתת שתי שטיפות של 200 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות כל אחת.

הניחו שקופיות כיסוי המכילות טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה נגד דעיכה עם DAPI מעל הדגימות ודגרו על השקופיות בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. לאחר צביעה רציפה עם מנהרה ו- cGMP המשיכו במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטיות על ידי התאמת הפרמטרים של המצלמה. צלם את התמונות של ארבעה שדות מכל מקטע באמצעות התוכנה עם מצלמה דיגיטלית בהגדלה של פי 20.

קבל תמונות מייצגות מהאזורים המרכזיים של הרשתית באמצעות DAPI, EGFP ו- TMR עם סריקת z-stack ומרווח של מיקרומטר אחד ואופציונלי של 1.251 מיקרומטר. בצמחי הרשתית שטופלו בריכוזים שונים של מעכבי PDE6 Zaprinast, מספר התאים החיוביים למנהרה ול-cGMP עלה מאוד בשכבה הגרעינית החיצונית בהשוואה לקבוצת הביקורת. השיעור הגבוה של תאים חיוביים למנהרה הציע כי העלייה בפעילות cGMP עשויה להגביר את ניוון תאי הרשתית המושרה לפני הקן והצטברות cGMP ממלאת תפקיד בניוון קולטני אור.

הכנת Explant חייבת להתבצע בהקדם האפשרי. חיות אופ מפזרות חמישיות וכל הצטברות מכיוון שהיא משפרת את הישרדות התאים ומשפרת את מצב הסיבים של סדרות ערימה בתפזורת. במידה רבה ביותר גלוי את הזגוגית יש לנקות עם סטרואידים.

הימנע ממגע עם שכבות סיבי עצב הרשתית בעת העברת חצילים ברשתית כדי למנוע פגיעה בתאים מכניים. שימו לב, כדי לבצע העברה חלקה של חצילים ברשתית לתוספות תרבית ניתן להשרות את חיית המחמד מראש במשהו כדי לשמור עליה לחה לפני העברת רקמות הרשתית. בנוסף, התהליך כולו חייב להתבצע באטמוספירה סטרואידית כדי למנוע זיהום במהלך התהליך.