Name: תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למד תרביות רשתית אורגנוטיפיות מקופי מקוק לחקר ניוון רשתית באמצעות מודל אקס-ויבו. השיטה מאפשרת לחקור את מסלול האותות cGMP-PKG ומנגנוני מוות תאי פוטורצפטור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81960180), קרן מורשת זינקה וקרן שרלוט וטיסטו קרסטן, המרכז הרפואי הקליני למחלות עיניים יונאן (ZX2019-02-01). אנו מודים לפרופ' לונגבאו לב (המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, קונמינג, סין) על שיתוף גלגלי העיניים של הקופים ששימשו במחקר זה.

המחקר בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (IACUC-PE-2022-06-002), וסקירת אתיקה של בעלי חיים ופרוטוקול בעלי חיים של אוניברסיטת יונאן (YNU20220149).
1. הכנת חצילים ברשתית
<ol><li>השיגו גלגלי עיניים של פרימטים מקופי מקוק פראיים, בני שנה עד 3 שנים, אחסנו בתמיסת אחסון רקמות, והעבירו אותם על קרח תוך 3 שעות מרגע ההקרבה של הקופים או לאחר מוות טבעי.</li>
	<li>להכנת תמיסת פרוטאינאז K, ממיסים 25 מ"ג של פרוטאינאז K ב 250 מיקרוליטר של מים מזוקקים, ולאחר מכן מוסיפים 225 מיקרוליטר של התמיסה ל 18.5 מ"ל של מדיום בסיסי (R16).</li>
	<li>שטפו את גלגלי העיניים ב-10 מ"ל של 5% פובידון-יוד (פובידון-יוד: מים = 1:19) במשך 30 שניות וטבלו אותם במי מלח 5% פניצילין/סטרפטומיצין (PEN/STREP):p hosphate-buffered מלוחים = 1:19 למשך דקה אחת כדי למנוע זיהום חיידקי. לאחר מכן, לדגור את גלגלי העיניים ב 10 מ"ל של R16 בינוני במשך 5 דקות.</li>
	<li>מחממים מראש את תמיסת פרוטאינאז K באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לטבול את גלגלי העיניים ב 10 מ"ל של תמיסת proteinase K ולדגור במשך 2 דקות. לטבול את גלגלי העיניים בתמיסת 10 מ"ל של R16 + סרום בקר עוברי (1:1), לדגור במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את גלגלי העיניים ל 10 מ"ל של R16 טרי לשטיפה סופית.</li>
	<li>הפרידו את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית, וחתכו את הרשתית מ-4 צדדים בעזרת פינצטה ומספריים (איור 1A-L).</li>
	<li>חותכים חצילי רשתית עם להבי טרפין לחמישה חלקים - להב טרפין 4 מ"מ לצד האף/טמפורלי/עליון/נחות ולהב טרפין 6 מ"מ לצד המרכזי (המכיל דיסק אופטי ומקולה; איור 1M-O). חתכו במרחק הבא מראש עצב הראייה: 1.5 מ"מ עבור האף, 4 מ"מ עבור הרקתי, ו -2 מ"מ עבור הצד העליון והתחתון.</li>
	<li>העבירו את צמחי הרשתית (המכילים רשתית וכורואיד) עם מדכא עפעפיים והניחו אותם במרכז החדרה, בצד הפוטורצפטור כלפי מעלה (איור 1P). יש להניח כ-1 מ"ל של מדיום מלא (R16 בתוספת BSA, טרנספרין, פרוגסטרון, אינסולין, T3, קורטיקוסטרון, ויטמין B1, ויטמין B12, רטינול, רטיניל אצטט, DL-טוקופרול, טוקופריל אצטט, חומצה לינולאית, L-ציסטאין הידרוכלוריד, גלוטתיון, גלוטמין, ויטמין C) מתחת לקרום על הצלחת כדי לכסות את הרשתית במלואה.</li>
</ol>2. תרבית חציל רשתית פרימטים
<ol><li>חציל רשתית תרבית בתווך מלא ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס מאוורר עם לחות 5% CO2.</li>
	<li>יש למרוח טיפול תרופתי בריכוז מתאים על מדיום תרבית הרשתית (למשל, זפרינזט בריכוזים של 100 מיקרומטר, 200 מיקרומטר או 400 מיקרומטר). השתמש לפחות שלושה explants לכל תנאי טיפול ולהשתמש explants ללא תרופה כמו בקרה. לטפל עם התרופה במשך 4 ימים.</li>
</ol>3. תיקון וחתך הקפאה
<ol><li>לדגור על חצילים ברשתית עם 1 מ"ל של פאראפורמלדהיד (PFA) במשך 45 דקות, לשטוף אותם לזמן קצר עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן לדגור עם 10% סוכרוז במשך 10 דקות, 20% סוכרוז במשך 20 דקות, ו 30% סוכרוז במשך 30 דקות (1 מ"ל עבור כל חציל רשתית).</li>
	<li>חתכו צמחי רשתית באמצעות להבי טרפין כדי להבטיח עקביות בגודל הצמחים המתקבלים מאתרים שונים בעלי המאפיינים הבאים: ארבעה רבעים בפריפריה, 6 מ"מ במרכז. לאחר מכן, מעבירים את החצילים ברשתית לתוך קופסת פח (בערך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ) עם מדיום הטבעה של O.C.T כדי לכסות את הרקמה. מיד, להקפיא את קטעי הרקמה בחנקן נוזלי ומניחים במקרר -20 מעלות צלזיוס לאחסון.</li>
	<li>השתמשו בלהב חד כדי לחתוך את האגר לגוש קטן המכיל את דגימת הרקמה, חתכו את גושי הדגימה למקטעים של 10 מיקרומטר, והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופ הידבקות באמצעות מברשת רכה. לאחר מכן, יבש במשך 45 דקות ב 40 ° C ואחסן ב -20 ° C עד לשימוש.</li>
</ol>4. אימונוהיסטוכימיה (איור 2)
<ol><li>צביעת cGMP (תנאי ייצור נאותים)<ol><li>יבשו את המגלשות וציירו טבעת הידרופובית סביב חלקי הרשתית בעזרת עט חוסם נוזלים לכיסוי הדגימות.</li>
		<li>יש לטבול שקופיות ב-200 מיקרוליטר של מי מלח במאגר פוספט 0.3% ו-Triton X-100 לכל מגלשה (PBST) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בתמיסת חסימה (5% סרום חמור רגיל, 0.3% PBST, 1% BSA, 200 μL לכל מגלשה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>יש לדגור על הדגימות למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני (1:250, כבשים נגד cGMP, 200 μL למגלשה) שהוכן בתמיסת החסימה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 10 דקות (200 μL לכל שקופית) 3x.</li>
		<li>יש לדגור על הדגימות עם נוגדן משני (1:300, חמור נגד כבשים Alxea Fluor 488, 200 μL לכל מגלשה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 10 דקות, 3x. כסו את הדגימות באמצעי הרכבה נגד דעיכה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.</li>
	</ol></li>
	<li>צביעת טונל<ol><li>יבשו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות וציירו טבעת מחסום דוחה מים סביב דגימות רקמת הרשתית בעזרת עט חוסם הנוזלים, ולאחר מכן דגרו עליהן ב-40 מ"ל PBS למשך 15 דקות.</li>
		<li>דגירה על שקופיות ב- 42 מ"ל (לכל חמש שקופיות) של TBS (0.05 M Tris-buffer) ב- 37 ° C. שאפו החוצה את ה-TBS, ודגרו על הדגימות עם 6 מיקרוליטר של פרוטאינאז K למשך 5 דקות. לאחר מכן, שטפו שקופיות 3x עם TBS במשך 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>חושפים את המגלשות ל-40 מ"ל של תמיסת אתנול-חומצה אצטית בשופלין, מכסים בסדין שקוף ודגרים בטמפרטורה של -20°C למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם TBS במשך 5 דקות בכל פעם.</li>
		<li>חשוף את המגלשות לתמיסת חסימה (1% BSA; 200-300 μL לשקופית לפי דרישה) ודגר בתא לחות למשך שעה אחת.</li>
		<li>הכינו את תמיסת ערכת TUNEL, TMR אדום, ביחס הבא: 62.50 μL של תמיסת חסימה (1% BSA), 56.25 μL של תמיסת תיוג (TMR-dUTP) ו-6.25 μL של האנזים (פרופורציה לכל שקופית). הוסף כ 130 μL של תמיסה זו לכל שקופית ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות עם PBS למשך 5 דקות (200 מיקרוליטר לכל שקופית), 2x.</li>
		<li>הניחו שקופיות כיסוי המכילות 1-2 טיפות של אמצעי הרכבה נגד דעיכה עם DAPI מעל הדגימות, ולאחר מכן דגרו על השקופיות בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.</li>
	</ol></li>
	<li>צביעת cGMP (תנאי ייצור נאותים) בשילוב צביעת טונל<ol><li>צביעת cGMP לוותה בצביעת טונל. בצע את השלבים של צביעת TUNEL משלב 4.2.1 לשלב 4.2.5, ולאחר מכן המשך את השלבים של צביעת cGMP משלב 4.1.2 לשלב 4.1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע מיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי עם פרמטרים של המצלמה באופן הבא: זמן חשיפה = 125 אלפיות השנייה, גודל החזר השקעה = 2752 x 2208, צבע = שחור-לבן. צלם תמונות באמצעות התוכנה. צייר ארבעה שדות שונים עם מצלמה דיגיטלית בהגדלה של 20x מכל קטע וקבל תמונות מייצגות מהאזורים המרכזיים של הרשתית באמצעות DAPI (465 ננומטר), EGFP (509 ננומטר), TMP (578 ננומטר), כאשר סריקת Z-Stack כוללת מרווח = 1 מיקרומטר ואופציונלי = 1.251 מיקרומטר.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neal%2C+TB+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).</li>
<li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).</li>
<li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li>
<li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration%3A+Targets%2C+compounds%2C+and+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453(2019).</li>
<li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142(2014).</li>
<li>Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+%28experimental+study%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li>
<li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li>
<li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death & Disease. 1 (2), 24(2010).</li>
<li>Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li>
<li>Trifunović, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li>
<li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li>
<li>Schön, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+%28RP43%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li>
<li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li>
<li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464(2021).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death%3A+perspectives+for+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li>
<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+retina%3A+Development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li>
<li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+in+a+dish%3A+Cell+cultures%2C+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880(2021).</li>
<li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+%28PDE6%29%3A+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li>
<li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440(2021).</li>
<li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas%3A+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752(2021).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פוטוטרנסדוקציה חזותית מתייחסת לתהליך הביולוגי שבו אותות אור מומרים לאותות חשמליים על ידי תאים קולטי אור בתוך רשתית העין. תאים קולטי אור הם תאי עצב מקוטבים המסוגלים לבצע פוטוטרנסדוקציה, וישנם שני סוגים שונים של פוטורצפטורים המכונים מוטות ומדוכים על שם צורות המקטעים החיצוניים שלהם. מוטות אחראים על הראייה הסקוטופית ומדוכים אחראים על ראייה פוטופיקית וחדות גבוהה. RD תורשתי מתייחס למחלות נוירודגנרטיביות המאופיינות במוות מתקדם של תאי קולטני רשתית15.
המחקר הנוכחי על RD התבסס בע...

ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור ונגרם על ידי מוטציות במגוון רחב של גנים פתוגניים1. התוצאה הסופית של RD היא אובדן ראייה וברוב המכריע של המקרים המחלה נותרה בלתי ניתנת לטיפול עד עצם היום הזה. לכן, חשוב לחקור את המנגנונים התאיים המובילים למוות של קולטני אור באמצעות מודלים המייצגים נאמנה את מצב המחלה האנושי. כאן, מודלים מבוססי פרימטים מעניינים במיוחד בשל קרבתם לבני אדם. יש לציין כי מודלים כאלה עשויים לקדם את הפיתוח של התערבויות טיפוליות מתאימות שיכולות לעצור או לעכב מוות של תאים קולטי אור.
מחקרים קודמים על מנגנוני מוות תאי ב- RD הוכיחו כי ירידה או אובדן של פעילות פוספודיאסטראז 6 (PDE6) הנגרמת על ידי מוטציות בגן מפעיל RD מובילה להידרוליזה מופחתת של מונופוספט גואנוזין מחזורי (cGMP)2,3. cGMP הוא אגוניסט ספציפי של תעלות היונים המגודרות בנוקלאוטידים מחזוריים (CNGCs) במקטעים החיצוניים של המוט (ROSs) והוא גם מולקולת מפתח האחראית להמרת אותות אור לאותות חשמליים בתאי קולטני אור בעלי חוליות4. הידרוליזה מופחתת של cGMP גורמת להצטברות של cGMP ב-ROSs, מה שמוביל לפתיחת CNGCs 5. כתוצאה מכך, מסלולי פוטוטרנסדוקציה מופעלים, וכתוצאה מכך עלייה בריכוזי קטיון בתאים קולטי אור. תהליך זה מטיל עומס מטבולי על פוטורצפפטורים, אשר כאשר מופעלים יתר על המידה, למשל, על ידי מוטציות ב- PDE6, עלולים לגרום למוות תאי.
מחקרים רבים הראו כי הצטברות יתר משמעותית של cGMP בפוטורצפטורים של מודלים עכבריים עם מוטציות שונות בגן RD עלולה לגרום להפעלה של חלבון קינאז תלוי cGMP (PKG)3,6. זה מוביל לעלייה משמעותית בתאים גוססים, חיוביים TUNEL ודילול הדרגתי של שכבת התא photoreceptor. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהפעלת יתר של PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות היא תנאי הכרחי ומספיק להשראת מוות תאי קולטני אור 2,5. מחקרים על מודלים שונים של RD בעכברים הראו גם כי הפעלת PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות בפוטורצפטורים, מובילה להפעלת יתר של גורמים משפיעים במורד הזרם, כגון פולי-ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP1), היסטון דאצטילאז (HDAC) וקלפין 2,7,8,9. זה מרמז על קשרים סיבתיים בין חלבוני מטרה שונים אלה לבין מוות של תאים קולטי אור.
עם זאת, מחקרים קודמים על פתולוגיה, טוקסיקופרקולוגיה וטיפול ב- RD התבססו בעיקר על מודלים של עכברים עבור RD10,11,12. עם זאת, נותרו קשיים עצומים בתרגום הקליני של תוצאות אלה. זאת בשל ההבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים הניכרים בין עכברים לבני אדם, במיוחד בכל הנוגע למבנה הרשתית. לעומת זאת, פרימטים לא אנושיים (NHPs) חולקים גם רמה גבוהה של דמיון עם בני אדם ביחס למאפיינים גנטיים, דפוסים פיזיולוגיים וויסות גורמים סביבתיים. לדוגמה, טיפול אופטוגנטי נחקר כאמצעי לשחזור פעילות הרשתית במודלNHP 13. לינגאם ועמיתיו הדגימו כי ייצור טוב של תאים מקדימים של קולטני אור ברשתית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עשוי להציל נזק לקולטני אור חרוט ב- NHP14. לכן, מודלים NHP חשובים לחקר פתוגנזה RD ופיתוח שיטות טיפול יעילות. בפרט, מודלים NHP של RD, המציגים מנגנונים פתוגניים דומים לאלה בבני אדם, יכולים לשחק תפקיד קריטי במחקרים על פיתוח וניתוח טוקסיקו-פרמקולוגיה in vivo של תרופות חדשות.
לאור מחזור החיים הארוך, הקשיים הטכניים הגבוהים והעלות הגבוהה הכרוכה בביסוס מודלים של פרימטים in vivo , הקמנו מודל של פרימטים לא אנושיים במבחנה (NHP) תוך שימוש בתרביות של רשתית מקוק מושתלת. ראשית, קופי מקוק מסוג בר בגילאי 1-3 שנים נבחרו לתרבית חוץ גופית של צמחי רשתית, שכללה את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואידים. לאחר מכן טופלו צמחים בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM) כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG. מוות תאי קולטני אור כומת ונותח באמצעות בדיקת TUNEL, והצטברות cGMP בצמחים אומתה באמצעות immunofluorescence. בהתחשב ברמת הדמיון הגבוהה ביחס לפיזור התאים ולמורפולוגיה, עובי שכבת הרשתית ומאפיינים פיזיולוגיים אחרים של הרשתית בין קופים לבני אדם, הקמת מסלול איתות cGMP-PKG במודל הרשתית במבחנה עשויה להקל על מחקר עתידי על הפתוגנזה של RD, כמו גם מחקרים על פיתוח וטוקסיקו-פרמקולוגיה של תרופות חדשות לטיפול ב- RD.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td>תמיסת חסימת</td></tr><tr><td>קורטיקוסטרון</td><td>סיגמא</td><td>C2505</td><td>תוספי תוספי</td></tr><tr><td>DL-טוקופרול</td><td>סיגמא</td><td>T1539</td> בינוני <td>שלם תוספי</td></tr><tr><td>חמור בינוני שלם נגד כבשים, Alxea Fluor 488</td><td>Life technologies Corporation</td><td>A11015</td><td>נוגדן משני של cGMP (תנאי ייצור נאותים)</td></tr><tr><td>תמיסת אתנול-חומצה אצטית</td><td>Shyuanye</td><td>R20492</td><td>תיקון נוזלי</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>מזל תאומים</td><td>900-108</td><td>תמיסת חסימה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Imager.M2</td><td>הדמיה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>סיגמא</td><td>G8540</td><td>תוספי</td></tr><tr><td>גלוטתיון</td> בינוני <td>שלם סיגמא</td><td>G6013</td><td>תוספים של</td></tr><tr><td>ערכת גילוי מוות תאים בינונית שלמה, בדיקת TMR אדומה</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td>TUNEL</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>תוספי</td></tr><tr><td>L-ציסטאין HCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td> בינוני שלם <td>תוספי</td></tr><tr><td>חומצה לינולאית</td> בינונית <td>מלאה Sigma</td><td>L1012</td> תוספי אחסון רקמות <td>MACS בינוני שלם</td></tr><tr><td> פתרון</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-008</td><td>אחסון אופטימלי של דגימות איברים ורקמות טריות</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>תמיסת חסימה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td>חומר קיבוע</td></tr><tr><td>PEN. / STREP. 100&amp; פעמים;</td><td>Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>פניצילין / סטרפטומיצין אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח (PBS)</td> <td>Solarbio</td><td>P1010</td><td>תמיסת חיץ</td></tr><tr><td>פובידון-יוד</td><td>שנגחאי 310411</td><td></td><td>חומר חיטוי</td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P8783</td><td>תוספי</td></tr><tr><td>חלבון</td> בינוני שלם <td>K Millpore</td><td>539480</td><td>פירוק חלבון</td></tr><tr><td>R16 בינוני</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>074-90743A</td><td>רטינול בינוני בסיסי</td></tr><tr><td>סיגמא</td><td>R7632</td> תוספי<td></td> רטיניל <td>אצטט בינוני שלם</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>R7882</td><td>תוספי</td></tr><tr><td>כבשים בינוניות מלאות נגד cGMP</td><td>יאן דה ונטה, אוניברסיטת מאסטריכט, הולנד</td><td></td><td>נוגדן ראשוני של</td></tr><tr><td>סוכרוז</td> <td>cGMPGHTECH</td><td>57-50-1</td><td>חומר ייבוש</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>תוספי תזונה של</td></tr><tr><td>מדיום רקמה-טק שלם (תרכובת O.C.T)</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>הטמעת מדיום</td></tr><tr><td>טוקופריל אצטט</td><td>סיגמא</td><td>T1157</td><td>תוספי</td></tr><tr><td>טרנספרין</td><td>סיגמא</td><td>T1283</td><td>מדיום מלא תוספי מדיום</td></tr> <tr><td>מלאTranswell</td><td>Corning Incorporated</td><td>3412</td><td>תרבית תאים / רקמות</td></tr><tr><td>Tris-buffer (TBS)</td> <td>Solarbio</td><td>T1080</td><td>מאגר חוסם</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td><td>חומר פעיל פני השטח</td></tr><tr><td>VECTASHIELD מדיום עם DAPI</td><td>וקטור</td><td>H-1200</td><td>מדיום הרכבה</td></tr><tr><td>ויטמין B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td>תוספי תזונה של מדיום שלם</td></tr><tr><td>ויטמין B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td>תוספי ויטמין C בינוני מלא</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>A4034</td><td>תוספי תזונה של</td></tr><tr>מעכב<td>Zaprinast</td><td>Sigma</td><td>Z0878</td><td>PDE6</td></tr> בינוני <tr><td>מלא Zeiss Imager M2 מיקרוסקופ</td><td>  Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td>מיקרוסקופ זקוף</td></tr><tr><td>LSM 900 Airyscan</td><td></td><td></td><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>Zeiss Axiocam</td><td>  Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td>מצלמה דיגיטלית</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovision4.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, סן חוזה, קליפורניה)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלגלי עיניים של פרימטים מקוק מסוג בר</td><td>מכון קונמינג לזואולוגיה</td><td>SYXK (<img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margin: auto; ">) K2017 -0008</td><td></td></tr><tr><td>עט עט סופר פאפ (חוסם נוזלים, דיאדו, 0010, יפן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פתרון ערכת TUNEL (REF12156792910, רוש, גרמניה),</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור. הפעלת יתר של מסלול החלבון המחזורי גואנוזין מונופוספט (cGMP) התלוי בקינאז (PKG) בתאי פוטורצפטור גורמת למוות של תאים קולטי אור, במיוחד במודלים המכילים מוטציות פוספודיאסטראז 6b (PDE6b). מחקרים קודמים על RD השתמשו בעיקר במודלים מורינים כגון עכברי rd1 או rd10 . בהתחשב בהבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים בין עכברים לבני אדם, חשוב להבין באיזו מידה ניתן להשוות את הרשתיות של פרימטים ומכרסמים. קופי מקוק חולקים רמה גבוהה של דמיון גנטי עם בני אדם. לכן, קופי מקוק מסוג בר (בגילאי 1-3 שנים) נבחרו לתרבית במבחנה של צמחי רשתית שכללה את קומפלקס אפיתל פיגמנט רשתית (RPE)-כורואידים. צמחים אלה טופלו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG ולדמות פתוגנזה של RD. הצטברות cGMP ומוות תאים בצמחי רשתית של פרימטים אומתו לאחר מכן באמצעות immunofluorescence ובדיקת TUNEL. מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה עשוי לשמש למחקרים רלוונטיים ויעילים על המנגנונים של RD תלוי cGMP-PKG, כמו גם לפיתוח גישות טיפול עתידיות.

במחקר זה, תרבית חציל רשתית של קופי מקוק בוצעה באמצעות צמחים המכילים את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואיד (איור 1, איור משלים S1). בהשוואה לתרבית במבחנה של תאי רשתית המשתמשים ברשתית ללא RPE וכורואיד מחוברים, תרבית הצמחים שלנו מאפשרת הישרדות תאים טובה יותר ובהתאם לכך, מאריכה את הישרדותם של תאים קולטי אור.
השתמשנו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM; איור משלים S2) כדי לגרום להצטברות של cGMP בפוטורצפטורים...

צמחי רשתית שהתקבלו מקופי מקוק מסוג בר תורבתו במבחנה. ניוון הרשתית ומסלול האיתות cGMP-PKG הושרו באמצעות מעכב PDE6 zaprinast. הצטברות cGMP בצמחים בריכוזי זפרינזט שונים אומתה באמצעות אימונופלואורסנציה.

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה מציע את חקירת המנגנון המקיף ואת הפיתוח הטיפולי של הידרדרות רשתית תלוית cGMP-PKG. מודל פרימאטים לא-אנושי אינדיבידואלי זה שומר על אישור רקמת הרשתית ואינטראקציות בין-תאיות המאפשרות סימולציה טובה יותר של תנאי in vivo. זה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים וזה מקצר את משך הניסוי.מתן גישה ניסיונית מבוקרת לחקר התפתחות רשתית או ניוון. התחל את הכנת החצילים ברשתית על ידי שטיפת גלגלי העיניים שבודדו מקופי מקוק מסוג בר עם 10 מיליליטר של יוד פובידון 5% למשך 30 שניות. כדי למנוע זיהום חיידקי, טבלו את גלגלי העיניים בתמיסת PBS סטרפטומיצין 5% פניצילין למשך דקה אחת לפני הדגירה ב-10 מיליליטר של מדיום R16 למשך חמש דקות.לאחר מכן לטבול את גלגלי העיניים ב 10 מיליליטר של חלבון Ace-K פתרון שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס מודגר במשך שתי דקות. בצע את הדגירה הבאה ב 10 מיליליטר של אחד עד אחד R16 בתוספת תמיסת סרום בקר עוברית במשך חמש דקות. תן שטיפה סופית ב 10 מיליליטר של R16 טרי.לאחר שתסיים, להפריד את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית. ואז לחתוך את הרשתית מארבעה צדדים עם פינצטה ומספריים. לאחר מכן, השתמש בלהב עץ דק של ארבעה מיליליטר כדי לחתוך את הצמח ברשתית ב -1.5 מילימטר מצד האף, ארבעה מילימטר מהצד הרקתי ושני מילימטר מהצדדים העליונים והנחותים של ראש עצב הראייה.לאחר מכן באמצעות להב דק עץ שישה מ"מ לחתוך את הצד המרכזי של explant הרשתית המכיל את הדיסק האופטי ואת מקולה. בעזרת צינור רחב, מושכים את צמח הרשתית המכיל את הרשתית והכורואיד ומניחים אותו במרכז האינסרט כשצד הפוטורצפטור כלפי מעלה. השקיעו לחלוטין את הרשתית במיליליטר אחד של המדיום המלא על הצלחת מתחת לקרום.תרכבו את החצילים ברשתית והניחו אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לח. תן את הטיפול המתאים בריכוז התרופה לצמחים במשך ארבעה ימים. השתמש לפחות שלושה explants לכל תנאי טיפול ולהשתמש explants ללא התרופה כמו שליטה חיובית.לתיקון וחתך קריו, יש לטפל בחצילים ברשתית עם מיליליטר אחד של אלדהיד פרפורם למשך 45 דקות. לאחר שטיפה קצרה עם מיליליטר אחד של PBS דוגרים סדרתית על הצמחים ב-10% סוכרוז למשך 10 דקות, 20% סוכרוז במשך 20 דקות ו-30% סוכרוז למשך 30 דקות. חותכים את הרשתית באופן אחיד עם ארבעה רבעים בפריפריה ושישה מילימטרים במרכז.לאחר מכן מעבירים את החצילים ברשתית לקופסת פח בגודל של כ-1.5 על 1.5 על 1.5 ס"מ עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית המטמיעה מדיום המכסה את החציל. מיד מקפיאים את חלקי הרקמה בחנקן נוזלי ומכניסים אותם למקרר של 20 מעלות לאחסון. לאחר מכן, חותכים את האגר לגוש קטן המכיל את דגימת הרקמה.מחלקים את הבלוקים לבלוקים של 10 מיקרומטר ומניחים את המקטעים על שקופיות מיקרוסקופ הדבקה באמצעות מברשת רכה. לאחר מכן יבשו את החלקים במשך 45 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס ואחסנו אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לצביעת גואנוזין מונופוספט מחזורי או cGMP, ציירו טבעת הידרופובית סביב חלקי הרשתית המיובשים בעזרת עט חוסם נוזלים וכסו את הדגימות.טבלו את המגלשות ב-200 מיקרוליטר של 0.3% PBS ו-Triton-X100 או PBST למשך 10 דקות ולאחר מכן טיפול של שעה ב-200 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו על שקופית הדגימה למשך הלילה עם 200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני שהוכנו בתמיסת החסימה בארבע מעלות צלזיוס ושטפו אותה שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות. לדגור את המגלשה ב 200 מיקרוליטר של נוגדן משני במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר שלוש שטיפות של PBS במשך 10 דקות, כסו את הדגימות באמצעי הרכבה נגד דעיכה המכיל DAPI ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. יבשו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות וציירו טבעת מחסום דוחה מים סביב דגימת רקמת הרשתית בעזרת עט חוסם נוזלים. לאחר הדגירה עם 40 מיליליטר של PBS במשך 15 דקות, לטפל בחלקים עם 42 מיליליטר של 0.05 טריס-באפר מולארי או TBS ב 37 מעלות צלזיוס.שאפו את ה-TBS, דגרו על הדגימות עם שישה מיקרוליטרים של פרוטאינאז K במשך חמש דקות ושטפו שקופיות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחת. חשוף את המגלשות ל 40 מיליליטר של תמיסת אתנול חומצה אצטית בצ'פלין. מכסים אותו בסדין שקוף ודגרים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם TBS במשך חמש דקות בכל פעם. חשוף את המגלשות ל-200 עד 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה או 1% BSA ודגר עליהן בתא לחות למשך שעה. בכ-130 מיקרוליטר של תמיסה אדומה TMR לכל שקופית ולאחר שעה, יש לתת שתי שטיפות של 200 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות כל אחת.הניחו שקופיות כיסוי המכילות טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה נגד דעיכה עם DAPI מעל הדגימות ודגרו על השקופיות בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה. לאחר צביעה רציפה עם מנהרה ו- cGMP המשיכו במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטיות על ידי התאמת הפרמטרים של המצלמה. צלם את התמונות של ארבעה שדות מכל מקטע באמצעות התוכנה עם מצלמה דיגיטלית בהגדלה של פי 20.קבל תמונות מייצגות מהאזורים המרכזיים של הרשתית באמצעות DAPI, EGFP ו- TMR עם סריקת z-stack ומרווח של מיקרומטר אחד ואופציונלי של 1.251 מיקרומטר. בצמחי הרשתית שטופלו בריכוזים שונים של מעכבי PDE6 Zaprinast, מספר התאים החיוביים למנהרה ול-cGMP עלה מאוד בשכבה הגרעינית החיצונית בהשוואה לקבוצת הביקורת. השיעור הגבוה של תאים חיוביים למנהרה הציע כי העלייה בפעילות cGMP עשויה להגביר את ניוון תאי הרשתית המושרה לפני הקן והצטברות cGMP ממלאת תפקיד בניוון קולטני אור.הכנת Explant חייבת להתבצע בהקדם האפשרי. חיות אופ מפזרות חמישיות וכל הצטברות מכיוון שהיא משפרת את הישרדות התאים ומשפרת את מצב הסיבים של סדרות ערימה בתפזורת. במידה רבה ביותר גלוי את הזגוגית יש לנקות עם סטרואידים.הימנע ממגע עם שכבות סיבי עצב הרשתית בעת העברת חצילים ברשתית כדי למנוע פגיעה בתאים מכניים. שימו לב, כדי לבצע העברה חלקה של חצילים ברשתית לתוספות תרבית ניתן להשרות את חיית המחמד מראש במשהו כדי לשמור עליה לחה לפני העברת רקמות הרשתית. בנוסף, התהליך כולו חייב להתבצע באטמוספירה סטרואידית כדי למנוע זיהום במהלך התהליך.

organotypic-retinal-explant-cultures-from-macaque-monkey

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מדגים את לנתיחה ו הדגירה של הרשתית ארנב החלקיקים בתיווך העברת גנים של פלסמידים או קידוד ה-GFP מגוון רחב של סמנים subcellular לתאי הגנגליון ברשתית.

תרבות Organotypic של הרשתית הארנב למבוגרים

מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות...

בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית

כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי הבוגרת במשך שבעה ימים. בקצרה, נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן הרשתית ואת photoreceptor מקום על הצד להוסיף שהעלו לעמוד מחוייט.

תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ליישומים ניסיוניים רבים.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

למד תרביות רשתית אורגנוטיפיות מקופי מקוק לחקר ניוון רשתית באמצעות מודל אקס-ויבו. השיטה מאפשרת לחקור את מסלול האותות cGMP-PKG ומנגנוני מוות תאי פוטורצפטור.

תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

גלה סרטונים נוספים