Name: זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: חקור את תפקיד הקספאזות בביקוע חלבוני מארח במהלך הידבקות בנגיף שפעת A. השיטה מזהה אתרי ביקוע ספציפיים בקורטקטין והיסטון דיאצטילאזים בתאי יונקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מכיר את ג'ניפר טיפר, בילאן לי, ג'סי ואן ווסטרינן, קווין הרוד, דה-יואן צ'ן, פרג'אנה אחמד, סוניה מרוס, קנת ימאדה, ריצ'רד וובי, משאבי BEI (NIAID), המועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד, קרן מוריס ופיליס פייקל (ניו זילנד), קרן H.S. ו- J.C. Anderson (דנידין), והמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ובית הספר למדעים ביו-רפואיים (אוניברסיטת אוטגו).

אישורים רגולטוריים התקבלו מוועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת אוטגו לעבודה עם IAV ותאי יונקים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בכליות כלבים של Madin-Darby (MDCK) או בתאי אפיתל A549 של ריאה אנושית ובתת-סוגים של IAV H1N1. IAV גודל בביצי עוף, כפי שתואר במקום אחר17. תנאים סטריליים ואספטיים שימשו לעבודה עם תאי יונקים, ומתקן Biosafety רמה 2 (או בלימה פיזית 2) וארון בטיחות ביולוגית מדרגה II שימשו לעבודה עם תת-סוגים של IAV.
1. הערכת ביקוע או פירוק של חלבונים בתאים נגועים ב-IAV על ידי קספאזות
<ol><li>זרע 3 x 105 תאי MDCK או A549 לכל באר בצלחת תרבית תאים של 12 בארות. הערה: אם אתם משתמשים בתאי MDCK, ודאו שהנוגדן כנגד החלבון המעניין מזהה את המין הכלבי שלו.</li>
	<li>זרעו את הבארות בזוגות, כלומר, זוג בקרה - אחת טובה עבור הדגימה הלא נגועה ואחת עבור הדגימה הנגועה-מדומה - וזוג בדיקה - אחת טובה עבור מעכב לא נגוע דגימה ואחת עבור מעכב נגוע דגימה A. הגדל את מספר הזוגות עם כל מעכב נוסף (ראה הפניות 7,8).</li>
	<li>דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 במהלך הלילה.</li>
	<li>למחרת, להדביק את התאים עם IAV (תת-סוג H1N1 או תת-סוג אחר).<ol><li>לשם כך, הכינו את החיסון של הנגיף על ידי דילול מלאי הנגיף ב-400 μL של מדיום חיוני מינימלי ללא סרום (MEM) (ראו טבלת חומרים) בריבוי של זיהום (MOI) של 0.5-3.0 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/תא 7,11 (גורם להכפלת מספר התא בעת חישוב ה-MOI). הערה: להדבקת תאי MDCK, השלימו את הנגיף אינוקולום בטוסיל פנילאניל כלורומתיל קטון (TPCK)-טריפסין בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים (שלב 1.3) ושטוף את התאים עם 1 מ"ל/באר של MEM 2x ללא סרום.</li>
	<li>הוסיפו 400 μL של נגיף אינוקולום (שלב 1.4.1) לתאים ודגרו אותם במשך שעה אחת ב-35 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 .</li>
	<li>בינתיים, יש לדלל מעכב קספאז (לדוגמה, Z-DEVD-FMK), מעכב ליזוזום (לדוגמה, NH4Cl), או מעכב פרוטאזום (לדוגמה, MG132) (ראו טבלת חומרים) בריכוז סופי של 40 מיקרומטר, 20 mM או 10 μM, בהתאמה, ב-MEM7 נטול סרום (ראו טבלת חומרים). שני המעכבים האחרונים משמשים כבקרה. לדלל נפח שווה של הממס (אם אינו מים) המשמש לשחזור אחד המעכבים בתווך נטול סרום כדמה.</li>
	<li>הסר את הנגיף inoculum ולשטוף את התאים כמו בשלב 1.5 (1x).</li>
	<li>הוסיפו לתאים את ה-MEM נטול הסרום, 1 מ"ל/טוב, לעג או תוסף עם מעכב, והדגירו את התאים כמו בשלב 1.6. נקודת זמן זו נחשבת כהדבקה של 0 שעות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם בוכנה מזרק 1 מ"ל (צד גומי) ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור ב 12,000 x גרם במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה. הערה: ניתן להשליך את ה-supernatant הזה או להשתמש בולבדיקת רובד 8 כדי למדוד את הטיטר של צאצאי הנגיף ששוחררו.</li>
	<li>שטפו את כדור התא עם 250 μL של תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה מחדש כמו בשלב 1.11.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט וליטף את התאים על ידי הוספת 80-100 μL של חיץ תזה של התא (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% נתרן דודציל סולפט (SDS), 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 1% טריטון X-100, וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x, ראה טבלת חומרים) ומערבולות.</li>
	<li>מחממים את הצינור בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לליז לחלוטין ולהכין את סך התא ליזאט. אחסן את הליזטים בטמפרטורה של 4 °C לביצוע שלבים 1.15-1.17 למחרת, אך לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סיים שלבים אלה באותו יום.</li>
	<li>הערך את כמות החלבון בכל דגימה באמצעות ערכת בדיקה של חומצות אמינו מסועפות שרשרת (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)11 יחד עם סמני משקל מולקולריים 11.</li>
	<li>מעבירים את החלבון לממברנת ניטרוצלולוז או פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים). הערה: קרום PVDF עשוי לתת רקע גבוה בחלק מתמונות הכתם המערביות; בדוק תאימות.</li>
	<li>בצע כתם מערבי כדי לזהות את החלבון המעניין בשיטה המתוארת במקום אחר11.</li>
	<li>השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדומה ובמעכבים. הערה: אם רמת החלבון התאוששה במסלול הדגימה הנגועה שטופלה במעכבי קספאז, החלבון נבקע או מתפרק על ידי קספאזות. אחרת, הוא מושפל על ידי ליזוזום או פרוטאזום.</li>
	<li>כימות התאוששות החלבון על ידי מדידת עוצמת הפסים שלו בכל נתיב מלפחות שלושה שכפולים של אותו ניסוי ונרמול שלו עם רצועת בקרת ההעמסה המתאימה.</li>
	<li>השתמש בכל תמונה עכשווית ובתוכנה הקשורה אליה (ראה טבלת חומרים) כדי לדמות את הכתמים המערביים ולכמת את התאוששות החלבון.</li>
</ol>2. אישור על ביקוע בתיווך קספאז או פירוק חלבונים בתאים נגועים ב-IAV על ידי הפרעות RNA
<ol><li>תכנון או השגה של RNA (siRNA) מתערב קטן בתכנון מראש המכוון לכלבים או לבני אדם caspase 3, caspase 6 ו-caspase 7 (caspases1 של התליין) ו-siRNA בקרה שאינו ממוקד (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>העבר כל siRNA לתאי MDCK או A549 על-ידי העברה הפוכהשל 8,11.</li>
	<li>לשם כך, יש לדלל בצינורות נפרדים 100 ננומטר של siRNA בקרה או caspase siRNA או נפח מומלץ של מגיב טרנספקציה (ראו טבלת חומרים) ב-100 μL של מדיום מתאים (כמו OptiMEM, ראו טבלת חומרים), ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכינו כל דילול בשכפול. הערה: שכפול זה כולל שכפול אחד לניתוח ההדחה של ביטוי קספאז על ידי RT-qPCR או כתם מערבי (אם קיימים נוגדנים לקספאזות) ושכפול אחר להערכת ההתאוששות של החלבון המעניין על ידי כתם מערבי.</li>
	<li>יש לערבב 100 μL של כל תמיסת siRNA עם 100 μL של תמיסת ריאגנט טרנספקציה (שלב 2.3) ולדגור במשך 20-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את קומפלקס הריאגנטים siRNA-transfection.</li>
	<li>בינתיים, פצלו והוסיפו 1 x 105 תאי MDCK או A549 ב-800 μL של מדיום הגידול השלם, ערבבו עם 200 μL של קומפלקס מגיבי siRNA-transfection (שלב 2.5), והוסיפו 1 מ"ל של המתלה לבאר של צלחת תרבית של 12 בארות. דילול זה מביא את הריכוז הסופי של siRNA בקרה או caspase siRNA ל 10 ננומטר.</li>
	<li>דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 למשך 72 שעות.</li>
	<li>קצור את התאים משכפול אחד כמו בשלב 1.10, ועבד אותם כדי לאמת או לאשר את ההפלה של הביטוי של caspase 3, caspase 6 ו- caspase 7 על ידי RT-qPCR או כתם מערבי, בהתאמה, באמצעות שיטות סטנדרטיות ופרוטוקולים 8,11.</li>
	<li>להדביק את התאים באחרים להשתכפל עם IAV כמתואר בשלבים 1.4-1.9 (ללא מעכבים).</li>
	<li>לאחר 24 שעות, קציר, עיבוד וניתוח התאים על ידי כתם מערבי ומדידה וכימות של התאוששות החלבון כמתואר בשלבים 1.10-1.20.</li>
</ol>3. מוטגנזה מכוונת אתר לאיתור אתרי הבקיעה הקספאזית בפוליפפטיד
<ol><li>שכפלו את החלבון המקודד גנים בעל עניין בפלסמיד11 של ביטוי יונקים או השיגו אותו ממעבדת מחקר או ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). הערה: עדיף אם הגן משובט בתג אפיטופ או כאיחוי GFP כדי להבחין בין הפוליפפטיד המתבטא באופן אקטופי לבין זה המובע באופן אנדוגני במהלך הכתם המערבי.</li>
	<li>באמצעות מסדי נתונים של מצע קספאז4 או כלי יישור חלבונים, אתר את מוטיבים הקונצנזוס של מחשוף קספאז, XXXD ו- DXXD, על הפוליפפטיד. כמעט כל מוטיבים של מחשוף קספאז מכילים את החומצה האספרטית באתר המחשוף (P1)3,4.</li>
	<li>מוטציה של חומצה אספרטית P1 פוטטיבית לחומצה גלוטמית או חומצת אמינו לא קוטבית (אלנין, ואלין) על ידי מוטגנזה מכוונת אתר ואחריה ריצוף DNA11 באמצעות שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים.</li>
	<li>העבירו את הדנ"א מסוג בר (WT) ופלסמיד מוטנטי לתאי MDCK או A549 על-ידי העברה הפוכה11.<ol><li>לשם כך, יש לדלל 2 מיקרוגרם של דנ"א פלסמיד או נפח מומלץ של מגיב הטרנספקציה ב-100 μL של מדיום מתאים (ראו שלב 2.3 וטבלת חומרים) בצינורות נפרדים, ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>יש לערבב 100 μL של כל תמיסת DNA פלסמידית עם 100 μL של תמיסת מגיב הטרנספקציה ולדגור במשך 20-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את קומפלקס מגיב ה- DNA-transfection.</li>
	</ol></li>
	<li>בינתיים, פצלו והוסיפו 3 x 10 5תאי MDCK או A549 ל-800 μL של מדיום הגידול השלם, ערבבו עם 200 μL של קומפלקס ריאגנטים של DNA-transfection, והוסיפו את התרחיף של 1 מ"ל לבאר של צלחת תרבית של 12 בארות.</li>
	<li>דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 .</li>
	<li>לאחר 48 שעות, הדביקו את התאים ב-IAV כמתואר בשלבים 1.4-1.9 (מבלי להוסיף את המעכבים).</li>
	<li>לאחר 24 שעות, קציר, עיבוד וניתוח התאים על ידי כתם מערבי (אם רלוונטי, באמצעות הנוגדן לתג אפיטופ או GFP). לאחר מכן, מדוד וכמת את התאוששות החלבון כמתואר בשלבים 1.10-1.20.</li>
</ol>

<ol><li>Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANoptosis+in+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PANoptosis in microbial infection.</a> Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).</li>
<li>Zheng, M., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+ZBP1-NLRP3+inflammasome+and+its+implications+in+pyroptosis%2C+apoptosis%2C+and+necroptosis+%28PANoptosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis).</a> Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).</li>
<li>Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hijacking+of+host+caspases%3A+An+emerging+category+of+pathogen-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).</li>
<li>Julien, O., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspases and their substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).</li>
<li>Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+and+perils+of+necroptosis+in+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection.</a> Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).</li>
<li>Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+apoptosis+and+virus+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation.</a> Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+degradation+of+host+cortactin+that+promotes+influenza+A+virus+infection+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells.</a> Virology. 497, 146-156 (2016).</li>
<li>Galvin, H. D., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+host+caspase+and+viral+PA-X+antagonize+the+antiviral+host+factor%2C+histone+deacetylase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).</li>
<li>Husain, M., Harrod, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+caspase-3+cleaves+the+histone+deacetylase+6+in+infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells.</a> FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).</li>
<li>Husain, M., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6+inhibits+influenza+A+virus+release+by+downregulating+the+trafficking+of+viral+components+to+the+plasma+membrane+via+its+substrate%2C+acetylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+human+cortactin+during+influenza+A+virus+infection+occurs+in+its+actin-binding+domains+and+is+associated+with+released+virus+titres%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres.</a> Viruses. 12 (1), 87(2020).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+pathogenicity+is+determined+by+caspase+cleavage+motifs+located+in+the+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li>
<li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+murine+norovirus+NS1%2F2+potentiates+apoptosis+and+is+required+for+persistent+infection+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells.</a> PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940(2019).</li>
<li>Richard, A., Tulasne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+of+viral+proteins%2C+another+way+for+viruses+to+make+the+best+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis.</a> Cell Death & Disease. 3 (3), 277(2012).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+propagation+in+embryonated+chicken+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52421(2015).</li>
<li>Lüthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+A+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: A searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+sites+in+the+human+proteome%3A+CaspDB%2C+a+database+of+predicted+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates.</a> PLoS One. 9 (10), 110539(2014).</li>
<li>Igarashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CutDB%3A+A+proteolytic+event+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research.+35+%28Database+issue%29%22%5BJournal%5D)">CutDB: A proteolytic event database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DegraBase%3A+A+database+of+proteolysis+in+healthy+and+apoptotic+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).</li>
<li>Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+The+peptidase+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MEROPS: The peptidase database.</a> Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).</li>
<li>Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopFIND%2C+a+knowledgebase+linking+protein+termini+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function.</a> Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).</li>
<li>Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+TopFIND+3.0+with+TopFINDer+and+PathFINDer%3A+Database+and+analysis+tools+for+the+association+of+protein+termini+to+pre-+and+post-translational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).</li>
</ol>

למחבר אין ניגודי עניינים לחשוף.

נקבע כי וירוסים מתאימים את הגורמים והמסלולים המארחים לטובתם. בתורו, התאים המארחים מתנגדים לכך על ידי שימוש באסטרטגיות שונות. אחת מאותן אסטרטגיות היא PANoptosis, שבה משתמשים תאים מארחים כאסטרטגיה אנטי-ויראלית נגד זיהומים בנגיף. עם זאת, וירוסים כמו IAV פיתחו אסטרטגיות משלהם כדי להתמודד עם PANoptosis ולנצל אותו לטובתם 1,3,6. יחסי הגומלין האלה כוללים את הבקיעה של חלבונים פונדקאיים ונגיפיים שונים על ידי קספאזות. זיהוי הקספאזות הללו ו...

נגיף שפעת A (IAV) הוא חבר אב טיפוס במשפחת Orthomyxoviridae וידוע כגורם למגפות עולמיות ולמגפות בלתי צפויות. IAV גורם למחלה נשימתית אנושית, שפעת, הידועה בכינויה "שפעת". שפעת היא מחלה חריפה הגורמת להשראת תגובות חיסוניות מולדות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות ולמוות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות. שני התהליכים נשלטים על ידי תופעה הנקראת מוות תאי מתוכנת1. האיתות למוות תאי מתוכנת מושרה ברגע שקולטני זיהוי פתוגנים שונים חשים את חלקיקי הנגיף הנכנסים בתאים המארחים. זה מוביל לתכנות של מוות של תאים נגועים ואיתות לתאים בריאים שכנים על ידי שלושה מסלולים מחוברים הנקראים פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס - שנטבעו לאחרונה כתהליך אחד, PANoptosis1.
PANoptosis כרוך בעיבוד פרוטאוליטי של חלבונים רבים של פונדקאים ונגיפים משלב האינדוקציה ועד לביצוע. עיבוד כזה של חלבונים מובל בעיקר על ידי משפחה של פרוטאזות ציסטאין הנקראות קספאזות 1,2. עד 18 קספאזות (מקספאזה 1 עד קספאזה 18) ידועות3. רוב הקספאזות מבוטאות כפרו-קספאזות ומופעלות על ידי עיבוד פרוטאוליטי משלהן על ידי אוטוקטליזה או קספאזותאחרות 4 בתגובה לגירוי כמו זיהום בווירוס. ה-PANoptosis של תאים נגועים ב-IAV נחשב למנגנון הגנה מארח, אך IAV פיתח דרכים להתחמק ממנו ולנצל אותו כדי להקל על שכפולו 1,2,5,6. אחד מהם הוא לנטרל את הגורמים המארחים באמצעות ביקוע או השפלה בתיווך קספאז שהם אנטי-ויראליים מטבעם או מפריעים לאחד השלבים במחזור החיים של ה-IAV. לשם כך התגלו גורמים מארחים, קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 שעברו ביקוע או השפלה בתיווך קספאז בתאי אפיתל נגועים ב-IAV 7,8,9. ה-HDAC4 וה-HDAC6 הם גורמים אנטי-IAV8,10, והקורטקטין מפריע לשכפול ה-IAV בשלב מאוחר יותר של ההדבקה, באופן פוטנציאלי במהלך הרכבת הנגיף וניצנים 11.
בנוסף, מופעלות גם קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מרובים כדי להפעיל את התגובה הדלקתית של המארח במהלך זיהום ב- IAV 1,2. יתר על כן, נוקליאופרוטאין (NP), חלבון M2 תעלת יונים של IAV 12,13,14, וחלבונים שונים של נגיפים אחרים 3,15,16 עוברים גם הם ביקוע בתיווך קספאז במהלך ההדבקה, המשפיע על פתוגנזה נגיפית. לכן, יש צורך מתמשך לחקור ביקוע בתיווך קספאז או השפלה של חלבונים מארחים ונגיפיים במהלך IAV וזיהומים נגיפיים אחרים כדי להבין את הבסיס המולקולרי של פתוגנזה נגיפית. כאן מוצגות השיטות כדי (1) להעריך את הבקיעה או הפירוק של חלבונים כאלה על ידי קספאזות, (2) לזהות את הקספאזות האלה, ו-(3) לאתר את אתרי הבקיעה.

<table><tbody><tr><td>תאי A549</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td>אנושי, אפיתל, ריאות</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Caspase 3</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>264156-M</td><td>ידוע גם בשם 'מעכב InSolution Caspase-3 II - Calbiochem'cOmplete</td></tr><tr><td>, מיני מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>עיזים אנטי-NP מתנת נוגדנים</td><td></td><td></td><td>מריצ'רד וובי (St Jude Children' בית החולים למחקר, ממפיס, ארה"ב) ל-MH</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>תאי MDCK</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>כלב, אפיתל, כליה</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7449</td><td></td></tr><tr><td>מינימום חיוני בינוני (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td>הוסף L-גלוטמין, אנטיביוטיקה או תוספי מזון אחרים לפי הצורך</td></tr><tr><td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc imager עם תוכנת Image Studio Lite 5.2&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Fc הוחלף ב-Odyssey XF ותוכנת Image Studio Lite הוחלפה בתוכנת Empiria Studio.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA Pierce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד המבטא היתוך קורטקטין-GFP אנושי&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>50728</td><td>מתנה מקנת ימאדה ל-Addgene</td></tr><tr><td>RNA מפריע קטן (siRNA) מעוצב מראש לקספאז 3</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>NM_004346 מזהה siRNA: SASI_Hs01_00139105</td></tr><tr><td>RNA מפריע קטן שתוכנן מראש לקספאז 6</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>NM_001226</td><td>siRNA מזהה: SASI_Hs01_00019062</td></tr><tr><td>RNA מפריע קטן שתוכנן מראש לקספאז 7</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>NM_001227</td><td>מזהה siRNA: SASI_Hs01_00128361</td></tr><tr><td>זוגות פריימר SYBR Green RT-qPCR שתוכננו מראש מזהי</td> זוגות זוגות פריימר <td>Sigma-Aldrich</td><td>KSPQ12012</td><td>: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוז פרימיום פרוטראן</td><td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)10600003</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>נוגדן נגד אקטין ארנב</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד קורטקטין</td><td>איתות תאים</td><td>3502</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נוגדן נגד GFP</td><td>Takara</td><td>632592</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue חלבון מוכתם מראש</td><td>סטנדרטי ThermoFisher מדיום טרנספקציה מדעי</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>, Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, NaCl, SDS, נתרן דאוקסיכולאט, טריטון X-100</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr>טריפסין, <td>4370285</td><td></td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>שטופל ב-TPCK</td></tr></tbody></table>

זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת a

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

Caspases, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, מתזמרת מוות תאי מתוכנת בתגובה לגירויים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים. מוות תאי מתוכנת, שתואר בתחילה כמתרחש על ידי אפופטוזיס, ידוע כיום כמקיף שלושה מסלולים הקשורים זה בזה: פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, יחד נטבעו כתהליך אחד, PANoptosis. השפעה זיהום בנגיף (IAV) משרה PANoptosis בתאי יונקים על ידי גרימת הפעלה של קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מארחים שונים כמו גם ויראליים, מה שמוביל לתהליכים כמו הפעלת התגובה האנטי-ויראלית המולדת של המארח או השפלה של חלבונים מארחים אנטגוניסטיים. בהקשר זה, ביקוע קספאז 3 בתיווך של קורטקטין מארח, היסטון דאצטילאז 4 (HDAC4) והיסטון דאצטילאז 6 (HDAC6) התגלה הן בתאי אפיתל של בעלי חיים והן בתאי אפיתל אנושיים בתגובה לזיהום ב- IAV. כדי להדגים זאת, נעשה שימוש במעכבים, הפרעות RNA ומוטגנזה מכוונת אתר, ולאחר מכן, הבקיעה או ההתנגדות לביקוע וההתאוששות של פוליפפטידים של קורטקטין, HDAC4 ו- HDAC6 נמדדו על ידי כתם מערבי. שיטות אלה, בשילוב עם RT-qPCR, יוצרות אסטרטגיה פשוטה אך יעילה לזיהוי הפונדקאי, כמו גם חלבונים נגיפיים העוברים ביקוע בתיווך קספאז במהלך זיהום של IAV או נגיפים אחרים בבני אדם ובבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את התוצאות המייצגות של אסטרטגיה זו, והדרכים להפוך אותה ליעילה יותר נדונות גם הן.

טיפול במעכב קספז 3 התגלה כי פוליפפטידים של קורטקטין מארח, HDAC4 ו-HDAC6 עוברים פירוק בתגובה לזיהום ב-IAV הן בתאי הכלבים (MDCK) והן בתאי האדם (A549, NHBE) 7,8,9. על ידי שימוש בגישות הנ"ל, נחשף כי קספאזות מארחות המושרות על ידי IAV, במיוחד caspase 3, גורמות להשפלתן 7,8,9. הקורטקטין התפרק באופן תלוי-מינון זיהום ותלוי-זמן...

זיהום בנגיף שפעת A (IAV) מפעיל את הקספאזות שמבקעות חלבונים פונדקאיים ונוגפיים, אשר בתורם הם בעלי תפקידים פרו-ויראליים. על ידי שימוש במעכבים, הפרעות RNA, מוטגנזה מכוונת אתר, וטכניקות כתם מערביות ו- RT-qPCR, זוהו קספאזות בתאי יונקים נגועים המבקעים קורטקטין מארח והיסטון דאקטילאזות.

זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

שיטה זו תסייע לקבוע ולאשר אם חלבון בתאים נגועים בנגיף שפעת עובר השפלה או ביקוע על ידי caspases ולזהות את אתרי הבקיעה caspase. שיטה זו דורשת רק הגדרות מעבדה בסיסיות לביולוגיה מולקולרית ותאית ומיומנויות מחקר ואינה דורשת כל ציוד מיוחד או הכשרה בתוכנה. ניתן להתאים שיטה זו להשגת מטרות דומות הכוללות הדבקה בנגיפים או במיקרובים אחרים מן החי, וחשיפה לגירויים חיצוניים, כמו רעלנים וכימיקלים.כדי להתחיל, זרע תאי MDCK או A549 בצלחת תרבית תאים של 12 באר. לדגור על התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני. למחרת, הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים ושטוף את התאים בכל באר פעמיים עם מיליליטר אחד של MEM ללא סרום.לאחר מכן, להדביק את התאים על ידי הוספת 400 microliters של שפעת A וירוס inoculum, ומניחים את הצלחת עבור הדגירה במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, להסיר את הנגיף inoculum ולשטוף את התאים עם MEM. הוסף מיליליטר אחד של MEM ללא סרום לכל באר ודגירה של התאים כפי שמוצג בשלב הקודם.לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם בוכנה מזרק של מיליליטר אחד ולהעביר אותם צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 12, 000G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לאסוף את supernatant. לשטוף את כדור התא עם 250 microliters של מלח חוצץ פוספט צנטריפוגה.הסר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של מאגר תזה תאים. מערבבים לפי מערבולת. מחממים את הצינור ב 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי lyse לחלוטין את התאים.לאחר מכן, פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל פוליאקרילאמיד SDS. לאחר אלקטרופורזה, מעבירים את ג'ל החלבון לקרום ניטרוצלולוז או PVDF ומבצעים כתם מערבי. השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדומה ובמעכבים.ב-100 מיקרוליטרים של מדיום מתאים, כמו Opti-MEM, מדללים 100 ננו-מולרים של בקרה או קספאז siRNA, או נפח מתאים של מגיב טרנספקציה. לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 מיקרוליטרים מכל תמיסת siRNA עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת מגיב טרנספקציה ומדגרים במשך 20 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.לפצל ולהוסיף 100, 000 תאי MDCK או A549 ב 800 microliters של מדיום הצמיחה המלא. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של קומפלקס מגיבי טרנספקציה של siRNA והוסיפו את התרחיף הזה לצלחת תרבית של 12 בארות. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות.להדביק את התאים עם וירוס שפעת A, אבל ללא מעכבים. בצע כתם מערבי, והשווה את רמות החלבון כפי שהוצג קודם לכן. אתרו את מוטיבים המחשוף הקספאזי XXXD ו-DXXD על הפוליפפטיד.מוטציה של חומצה אספרטית P1, שתי חומצות גלוטמיות, או אלנין על ידי מוטגנזה מכוונת אתר ואישור על ידי ריצוף DNA. ב-100 מיקרוליטרים של מדיום מתאים, יש לדלל שני מיקרוגרמים של דנ"א פלזמה מסוג בר או מוטציה או נפח מומלץ של מגיב הטרנספקציה ולדגירה של הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים 100 מיקרוליטרים של תמיסת DNA פלזמה עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת מגיב הטרנספקציה ודוגרים במשך 20 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר.בינתיים, לפצל ולהוסיף 300, 000 MDCK או A549 תאים ל 800 microliters של בינוני צמיחה מלאה. הוסף 200 מיקרוליטרים של קומפלקס מגיב טרנספקציה DNA והוסף את המתלה הזה לצלחת תרבית של 12 בארות. לדגום את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.לאחר 48 שעות, להדביק את התאים עם וירוס שפעת A ללא מעכבים. בצע כתם מערבי, והשווה את רמות החלבון כפי שהוצג קודם לכן. באמצעות הכתמה מערבית, הוערכה ההשפלה של קורטקטין מארח על ידי קספאזות פונדקאיות הנגרמות על ידי שפעת.טיפול בתאים נגועים בנגיף השפעת עם מעכב קספאז-3 הביא להצלת קורטקטין ופירוק NP נגיפי. כימות עוצמת רצועות הקורטקטין והנורמליזציה שלו עם רצועת האקטין המתאימה הראו כי רמת הקורטקטין בתאים נגועים שטופלו במעכבי קספאז-3 הייתה גבוהה יותר בהשוואה לתאים נגועים שלא טופלו. בתאים מדולדלים של קספאז-6 או קספאז-7.לא נצפתה התאוששות משמעותית ברמות הפוליפפטידים של קורטקטין, ואילו בתאים מדולדלים של קספאז-3, קורטקטין שהתאושש מנגיף השפעת גרם להתפרקות. כימות והשוואה של רמות הפוליפפטידים הראו כי רמת הפוליפפטיד של קורטקטין בתאים נגועים עם ביטוי קספאזי-3 מדולדל הייתה גבוהה יותר מאשר תאים עם ביטוי קספאז-3 רגיל. המוטציה של חומצה אספרטית בעמדה 116 לחומצה גלוטמית הפכה את הפוליפפטיד של הקורטקטין לעמיד בפני השפלה הנגרמת על ידי נגיף השפעת.כימות והשוואה של רמות הפוליפפטידים הראו כי רמת הפוליפפטיד של קורטקטין מוטנטי בתאים נגועים הייתה גבוהה מזו של פוליפפטיד קורטקטין מסוג בר. הוא נדרש ליצור עשרות מוטנטים ולבצע כתמים מערביים חוזרים ונשנים כדי לזהות את אתר המחשוף הקספאזי בפוליפפטיד. ניתן לפתח בדיקה ביוכימית במבחנה המכילה קספאז מטוהר ופוליפפטיד מטרה כדי לאשר שהחלבון המעניין הוא מצע מבוסס גז ישיר.פרוטוקול זה יסייע להבין את המשמעות, ההשפלה או הבקיעה של חלבון המטרה במערכת הנחקרת, כגון זיהום בנגיף או מחלה.

identifying-caspases-their-motifs-that-cleave-proteins-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

נגיפי שפעת לשכפל גנום הרנ"א שלהם בשיתוף עם הכרומטין מארח תאים. כאן, אנו מציגים שיטה לטיהור שלמים מתחמי ribonucleoprotein ויראלי של הכרומטין של תאים נגועים. מטוהרים מתחמי ויראלי יכול להיות מנותח על ידי כתם הן המערבי תחל הרחבה של חלבון ותוכן RNA, בהתאמה.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

סרטון זה מדגים את ההערכה של הפעלות קספז מרובות במקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות גירוי עם נגיף השפעת. בעקבות ליזה מקרופאגים, נטרול חום של ליזט וצנטריפוגה, נאספים קספזות תוך תאיות לניתוח חיסוני עוקב.

הערכת ההפעלה של קספזות מרובות במקרופאגים

הסרטון מדגים שיטה להערכת פיצול חלבונים בתיווך קספאז בתאים נגועים בנגיף. לאחר זיהום ויראלי, קספזות מופעלות ומפרקות חלבונים תאיים שונים של המאכסן ונוקלאופרוטאינים נגיפיים, בעוד מעכבי קספז ספציפיים מונעים פירוק זה, כפי שאושר על ידי כתם מערבי.

הערכת פיצול בתיווך קספאז של חלבונים נגיפיים ומארחים בתאים נגועים בנגיף

פירוק ליבות נגיף שפעת A במהלך כניסת הנגיף לתאי המארח הוא תהליך רב-שלבי. אנו מתארים שיטה במבחנה לניתוח השלבים המוקדמים של הסרת ציפוי נגיפי. בגישה זו, צנטריפוגה בשיפוע מהירות משמשת לניתוח ביוכימי של השלבים המתחילים הסרת ציפוי בתנאים מוגדרים.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

אנו מציגים פפטיד fluorogenic assay המחשוף המאפשר הקרנה מהירה הפעילות הפרוטאוליטי של פרוטאזות על פפטידים המייצגים האתר המחשוף של פפטידים פיוז'ן ויראלי. שיטה זו יכולה לשמש גם על כל מוטיב חומצת אמינו אחרות בתוך רצף חלבונים כדי לבדוק את הפעילות פרוטאז.

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

אנו מציגים פרוטוקול כללי לזיהוי קטעים קצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (SSHHPS) מוטבע polyprotein הנגיפי. SSHHPS מזוהים על ידי הפרוטסים נגיפי ולהפנות את ההרס המיועד של חלבונים מארחים ספציפיים על ידי מספר וירוסים הקבוצה הרביעית.

ניתוח של הקבוצה הרביעית ויראלית שימוש במבחנה ובשיטות סיליקו

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מקיפה להערכת הפעלת קספאז (קספאז-1, קספאז-3, קספאז-7, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-11) בתגובה הן למודלים במבחנה והן ב-in vivo (בעכברים) של זיהום, עלבונות סטריליים וסרטן כדי לקבוע את התחלתם של מסלולי מוות תאי, כגון פירופטוזיס, אפופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis.

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי וטיהור של Drosophila caspases Dronc ו- Drice, והשימוש בהם במבחני מחשוף במבחנה .

במבחנה מבחני ביקוע באמצעות מפלי דרוזופילה רקומביננטיים מטוהרים לבדיקת מצעים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות למדידת פעילות הקספז באמצעות מצע פלואורוגני באמצעות ציטומטריית זרימה או ספקטרופלואורומטר.

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

חקור את תפקיד הקספאזות בביקוע חלבוני מארח במהלך הידבקות בנגיף שפעת A. השיטה מזהה אתרי ביקוע ספציפיים בקורטקטין והיסטון דיאצטילאזים בתאי יונקים.

זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A

גלה סרטונים נוספים