Name: ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למדו שיטה מהירה וחסכונית לניטור מתילציה של ציטוזין בעוברי דגי זברה שלמים באמצעות זיהוי אוטומטי של 5-Methylcytosine. הפרוטוקול מאפשר לחוקרים לבחון שינויים אפיגנטיים בתגובה לגירויים סביבתיים בקלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה מחקרית ניתנה על ידי מלגת חטיבת בוגרי UCR ל- SAB, מלגת תוכנית הכשרה של NRSA T32 (T32ES018827) ל- SAB, ומענק של המכונים הלאומיים לבריאות (R01ES027576) ופרויקט האצ'ים של המכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA (1009609) ל- DCV.

מגדלים בוגרים טופלו וטופלו בהתאם ל 20180063 פרוטוקול שימוש בבעלי חיים (IACUC) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד.
1. איסוף עוברים של דגי זברה וחשיפה כימית
<ol><li>הוסף מלכודות רבייה בתוך המיכל למיכלים המכילים דגי זברה בוגרים בוגרים בוגרים מבחינה מינית וברי קיימא מבחינה רבייתית. הוסף לפחות שלוש מלכודות לכל מיכל 6 ליטר לפחות 12 שעות לפני האיסוף בשעה ~ 9:00 בבוקר, שהוא הזמן המשוער של הפריה והשרצה של ביצים בתוך מיכלים.</li>
	<li>הכינו פתרון חשיפה טרי בבוקר האיסוף. תמיסת החשיפה מוכנה באמצעות פיפטה של 5 מ"ל והוספת 5.0 מ"ל של מים ללא חלקיקים לצלחת פטרי זכוכית 60 מ"מ.</li>
	<li>לאחר מכן, השתמש בפיפטה מיקרו-קפילרית מזכוכית 10 μL כדי להעביר 10 μL של כלי רכב (דימתיל סולפוקסיד, או DMSO) או תמיסת מלאי כימית למערכת מים בצלחת הזכוכית.</li>
	<li>סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי להבטיח שתמיסת המלאי תתפוגג. הוסיפו עוד 5.0 מ"ל של מי מערכת לצלחת פטרי הזכוכית. סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי ליצור הומוגניות של תמיסת החשיפה.</li>
	<li>חזור על הפעולה עבור כל קבוצת טיפול בשכפולים של ארבעה כדי להניב ארבעה שכפולים לכל טיפול.</li>
	<li>לאחר הכנת פתרונות החשיפה, מכסים את כלי הזכוכית במכסי זכוכית כדי למזער את האידוי.</li>
	<li>תוך כדי הסרת מלכודות הרבייה מכל מיכל, יש לאפשר בזהירות למים שבתוך כל מלכודת להתנקז החוצה לתוך המיכל לפני ההסרה מהמכלים. ודא שהמלכודות נשארות בצד ימין למעלה.</li>
	<li>מעבירים את מלכודות הרבייה לכיור המעבדה ושוטפים אותן באמצעות בקבוק שפריץ מלא במי אוסמוזה הפוכה (RO) לרשת דגים שהושרתה בעבר ב-10% אקונומיקה ונשטפה במים. שטפו את העוברים עד שכל הפסולת תתפנה ויישארו רק עוברים נקיים.</li>
	<li>העבירו את העוברים מרשת הדגים באמצעות בקבוק שפריץ מלא במים של RO לתוך צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ. מיין באופן אקראי 50 עוברים חיים בשעה 0.75 שעות לאחר ההפריה (hpf) והסר עודפי מים RO.</li>
	<li>באמצעות מיקרוספטולה, הכניסו עוברים ממוינים לתמיסת הטיפול. כל העוברים חייבים להיות ברכב או בתמיסת טיפול לא לפני השעה 9:45. סובבו את כלי הזכוכית כדי להבטיח שהעוברים מצופים באופן שווה בתוך תמיסת הטיפול.</li>
	<li>לאחר שהוגדרו ארבע צלחות משוכפלות (N = 50 לכל שכפול) עבור כל קבוצת טיפול, הניחו את מכסה הזכוכית על גבי כלי החשיפה והעבירו את כל הכלים לחממה מבוקרת טמפרטורה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד 2 כ"ס, 4 כ"ס, 6 כ"ס, 8 כ"ס או 10 כ"ס.</li>
	<li>יש להכין פרפורמלדהיד טרי של 4% (PFA) לפחות 4 שעות לפני סיום החשיפה ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.<ol><li>הפעילו את הפלטה החמה ל-115 מעלות צלזיוס, הכינו 20 מ"ל של מי מלח 1x עם אגירת פוספט (PBS) (2 מ"ל של 10x PBS + 18 מ"ל של מי RO) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ושקלו 800 מ"ג של פרפורמלדהיד.</li>
		<li>בתוך קולט אדים כימי, העבר תמיסת PBS אחת לבקבוק Erlenmeyer בגודל 250 מ"ל, הוסף 800 מ"ג של פרפורמלדהיד, ולאחר מכן הוסף 2 μL של 10 N NaOH. הניחו מדחום בתוך הבקבוקון, הניחו את הבקבוקון על הצלחת החמה, וצפו בטמפרטורה תוך כדי ערבוב.</li>
		<li>כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-62-65 מעלות צלזיוס, הסירו את ה-PFA של 4% מהצלחת החמה ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר (RT). יש לאחסן את ה-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר שמשך החשיפה הסתיים, הוציאו את העוברים מהאינקובטור והעבירו את כל העוברים החיים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שאיפה לפתרון חשיפה שיורית באמצעות פיפטה 1 מ"ל. אין לשאוף עוברים כלשהם.</li>
	<li>הוסף 500 μL של 4% PFA מקורר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וערבב את העוברים ב-4% PFA על ידי היפוך מספר פעמים. אפשרו לעוברים להתקבע ב-4% PFA למשך הלילה. הערה: לא מומלץ לאפשר לעוברים לשהות ב-PFA יותר מ-12 שעות.</li>
</ol>2. דכוריונציה של עוברים
<ol><li>למחרת, שאפו את ה-PFA של 4%, החזירו את העוברים ב-PBS אחד, ופיפטפו בעדינות למעלה ולמטה במשך 30 שניות. במידת הצורך, הפסיקו את הפרוטוקול בשלב זה ואחסנו את העוברים ב-PBS אחד ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות.</li>
	<li>באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק, העבירו בזהירות עוברים קבועים לצלחת זכוכית מלאה במים RO וסובבו בעדינות במשך 30 שניות. חזור על שלב זה פעם נוספת.</li>
	<li>השתמש במחטי מזרק תחת הגדלה של פי 5.0 באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי כדי לטהר ידנית את כל העוברים. עשו זאת על ידי שימוש בקצה המחט כדי לנקב את הכוריון ולקלף אותו בעדינות מהחלמון וממסת התא4.</li>
	<li>לאחר פירוק העוברים, השתמש בפיפטה מיקרו-קפילרית מזכוכית כדי להעביר עד 25 עוברים שלמים לסל אימונוכימיה אחד (IHC) והנח את סל ה- IHC בצלחת של 96 בארות. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשאוף את מי RO מכל באר.</li>
</ol>3. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן ספציפי ל-5 mC
<ol><li>יש להשעות את העוברים ב-500 μL של חיץ חוסם (1x PBST + 2% סרום כבשים + 2 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר) לכל באר, ולעטוף את הצלחת בפרפילם ובנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות על שייקר מסלולי (100 סל"ד).</li>
	<li>הסר את עטיפת הפרפילם והאלומיניום והשתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוף את המאגר החוסם מכל באר. החלף אותו עם 500 μL של דילול 1:100 של נוגדן עכבר חד שבטי נגד 5-mC במאגר החסימה. דגירה של כל העוברים עם נוגדנים ראשוניים למעט תת-קבוצה של עוברי בקרת רכב אשר יודגרו עם המאגר החוסם כדי להתחשב ברעשי רקע. היזהר לא לשבש את שלמות העוברים, ולא לשאוף עוברים במהלך שלב זה.</li>
	<li>עטפו מחדש את הצלחת בפרפילם ובנייר אלומיניום ואפשרו לצלחת לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר מסלולי (100 סל"ד).</li>
	<li>למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכל באר והחלף אותה ב- 1x PBS + 0.1% Tween-20 (1x PBST). יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBST אחד למשך 15 דקות לכל שטיפה על שייקר אורביטלי (100 סל"ד).</li>
	<li>החלף PBST 1x בדילול 1:500 של נוגדן IgG נגד עכברים עזים בחסימת חיץ ודגירה של כל העוברים עם הנוגדן המשני. תנו לצלחת לדגור ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר אורביטלי (100 סל"ד).</li>
	<li>למחרת, הסר את הנוגדן המשני ושטוף את התמיסה השיורית שלוש פעמים עם PBST אחד למשך 15 דקות לכל שטיפה על שייקר אורביטלי (100 סל"ד). הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן עד 48 שעות אם סלי IHC מאוחסנים בבארות נקיות מלאות ב- PBS 1x.</li>
	<li>השתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוף 1x PBST מכל באר והנח את סל ה- IHC לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאה במי RO. תחת סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי, מיין באופן אקראי עוברים שלמים לצלחת של 96 בארות, והתוצאה היא עובר אחד לכל באר.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הסר את כל מי ה- RO מבארות בודדות והחלף אותם ב- 200 μL של PBS אחד. צנטריפוגה את הצלחת במשך 3 דקות ב 1 x גרם.</li>
</ol>4. הדמיה אוטומטית של עוברים בתוך לוחות 96 בארות
<ol><li>דמיינו את העוברים עם מטרה של פי 2 תחת האור המועבר ו-FITC באמצעות מערכת סינון בעלת תוכן גבוה (Table of Materials). הערה: תמונה פלואורסצנטית של כל עובר צולמה באופן אוטומטי באמצעות ההגדלה הנ"ל ומסנן FITC19.<ol><li>בחר מיקוד אוטומטי כדי להבטיח שהמיקוד של המצלמה יהיה בתחתית הלוח ויוסט על-ידי העובי התחתון.</li>
		<li>בחר אורך גל FITC עם משך חשיפה של 100 אלפיות השנייה, והגדר את המיקוד האוטומטי ללייזר עם היסט Z. שימו לב ואשרו רכישת תמונה נכונה במספר בארות לפני תחילת רכישת הלוחות. הערה: המכשיר מקבל באופן אוטומטי תמונות מכל הבארות שנבחרו המכילות עוברים. לוח של 96 בארות דרש כ-30 דקות לרכישת תמונות ואחסון נתונים. במשך תקופת הרכישה, הטמפרטורה הפנימית בתוך מערכת ההדמיה נשמרה ב- RT.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר רכישת תמונה, בצע ניתוח נתונים באמצעות מערכת סינון תוכן גבוהה והליך ניתוח תמונה אוטומטי מותאם אישית. בחר כל עובר על צלחת 96 באר כדי לנתח את השטח הכולל ואת עוצמת הפלואורסצנציה המשולבת. הערה: הניתוח כלל מתן תמונות שהכילו שכבות-על של נקודות נתונים מהניתוח.</li>
	<li>לאחר מכן, טבל את נקודות הנתונים וייצא אותן ממערכת הסינון בעלת התוכן הגבוה על-ידי מעבר תחת מדידה ובחירה באפשרות פתח יומן נתונים לגיליון אלקטרוני. חלקי רכישת הלוחות וניתוח הנתונים מתוארים באיור 1.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>העלה את הגיליון האלקטרוני המיוצא לתוכנית מחשב שבה חבילת הפורס (dplyr) משמשת למיון, לסיכום נתונים עבור כל באר ולסינון לפי מספר באר. לאחר מכן, חבילת writexl משמשת לייצוא הנתונים המסוכמים לגיליון אלקטרוני. קוד התוכנית 5mC מוצג בקובץ משלים 1.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li>
<li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078(2022).</li>
<li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179(2021).</li>
<li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).</li>
<li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands%2C+cytosine+methylation%2C+and+the+metabolome+in+driving+tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li>
<li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li>
<li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li>
<li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation-mediated+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li>
<li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li>
<li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li>
<li>Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי לא ידוע להם על אינטרסים כלכליים מתחרים או קשרים אישיים שיכולים היו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

במהלך פרוטוקול זה, ישנם כמה שלבים שהם קריטיים. ראשית, בעת דכוריזציה של עוברים, חשוב לכוון את המחט הרחק מהרקמה של העובר/שק החלמון/מסת התא, שכן חלקים אלה של העובר המתפתח שבריריים מאוד וקלים לניקוב. שנית, בעת העברת עוברים מסומנים לבארות בודדות, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר עוברים מכיוון שהם יידבקו לפיפטה מפלסטיק. שלישית, בעת ביצוע IHC הרכבה שלמה, ודא כי הצלחת מוגנת מפני אור. לבסוף, לאחר השלמת פרוטוקול IHC בהרכבה מלאה, אפשרו לצלחת לדגור ב-PBS 1x ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני ההדמיה, מכיוון שהדבר ימזער את ה-autofluoresc...

שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין 1,2. טריס(1,3-דיכלורו-2-פרופיל) פוספט (TDCIPP) הוא מעכב בעירה בשימוש נרחב בארצות הברית שהוכח בעבר כמשנה את המסלול של מתילציה ציטוזין בעקבות חשיפה עוברית מוקדמת מ-0.75 שעות לאחר ההפריה (HPF) ועד גסטרולציה מוקדמת (6 כ"ס)3,4,5,6,7,8 . בתוך בעלי חוליות, 5-mC ונגזרותיו המתוקנות הם קריטיים לוויסות ההתפתחות העוברית המוקדמת9. הפריה של עובר גורמת לדה-מתילציה של הדנ"א ההורי, ואחריה פירוק mRNA אימהי, הפעלת הגנום הזיגוטי ומתילציה מחדש של הגנום הזיגוטי9. תהליכים רלוונטיים ביולוגית המשתמשים במתילציה של ציטוזין כוללים שינוי היסטון, גיוס מכונות שעתוק, מתילציה של RNA, תכנות מחדש אפיגנטי וקביעת מבנה הכרומטין10,11. מתילציה של ציטוזין נשמרת גם בקרב מיני בעלי חוליות, מה שמדגיש את החשיבות של הבנה וחקירה של האופן שבו מתילציה של ציטוזין סוטה עשויה להשפיע על מסלול ההתפתחות של אורגניזם11. יתר על כן, התפתחות הרחם רגישה לחשיפה אימהית ויש לה פוטנציאל לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים, והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים12,13,14.
קטעים ארוכים של זוגות ציטוזין-גואנין, או איי CpG, היו המוקדים העיקריים של חוקרים שמטרתם לאפיין את הדינמיקה של מתילציה של ציטוזין על פני הגנום15,16,17. אסטרטגיות מבוססות ביסולפיט כגון ריצוף ביסולפיט בגנום שלם, ריצוף ביסולפיט בייצוג מופחת וריצוף אמפליקון ביסולפיט מייצגות את תקן הזהב לחקר מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים. עם זאת, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בנוסף, גישות מבוססות ריצוף אינן מספקות מידע על לוקליזציה מרחבית, שהיא קריטית להבנת סוגי תאים ואזורים שעלולים להיות מושפעים בתוך עובר מתפתח. באופן דומה, מבחני מתילציה גלובליים של דנ"א, כגון ניתוח הגבלות תלויות מתילציה, בדיקות חיסוניות הקשורות לאנזים 5-mC (ELISAs), וספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית 5-מתיל-2'-דאוקסיציטידין (5-mC) (LC-MS) מסת על הומוגנאטים של תאים או רקמות, וככאלה, מונעים את היכולת לנטר את הלוקליזציה והגודל של מתילציה של ציטוזין על פני מרחב וזמן בתוך דגימות שלמות12,18.
בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של הרחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים להיות בשימוש נרחב כמודלים שלמים מבחינה פיזיולוגית כדי לחשוף מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים זמינים מסחרית ספציפיים ל-5-mC, הפרוטוקול שלהלן מתאר אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברים בודדים ושלמים של דגי זברה על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה (IHC), הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי.
למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לניטור 5-mC בתוך עוברים שלמים של דגי זברה. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ"א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10-& L זכוכית מיקרו-נימי</td><td>פיפטה פישר סיינטיפיק</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מפלסטיק 100 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה 1 מ"ל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13690032</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק ארלנמאייר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB501250</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה 5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי זכוכית 60 מ"מ עם מכסים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08747A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 מצומד עז נגד עכבר IgG נוגדן&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>מלכודות רבייה בתוך המיכל</td><td>בתי גידול מימיים</td><td>N/A</td><td>מוצר זה אינו זמין עוד בעקבות רכישת בתי גידול מימיים על ידי Pentair.&nbsp; חוקרים יכולים להשתמש במיכלי גידול סטנדרטיים מחוץ למערכת הזמינים ממספר ספקים.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS מערכת סינון בעלת תוכן גבוה Widefield</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>N / A</td><td>כל מערכת סינון בעלת תוכן גבוה המצוידת באור משודר ומסנן FITC תתאים.</td></tr><tr><td>סל אימונוכימיה (IHC)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מיוצר בבית באמצעות צינורות מיקרוצנטריפוגה עם חלק חרוטי שהוסר ותחתית מצוידת ברשת, בגודל של צלחות של 24 או 48 בארות.</td></tr><tr><td>מטאקספרס - MetaXpress 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>N/A</td><td>כל תוכנה המסוגלת לכמת את השטח הכולל ואת העוצמה המשולבת של הקרינה תתאים.</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד 5-mC עכבר חד-שבטי</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>פיפטת העברת פלסטיק Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio היא תוכנת קוד פתוח וניתן להוריד אותה בכתובת https://www.rstudio.com.</td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור מבוקר טמפרטורה&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PR505755L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P7949-500 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

מתילציה של ציטוזין נשמרת מאוד בין מיני בעלי חוליות, וכגורם מפתח לתכנות אפיגנטי ולמצב הכרומטין, יש תפקיד קריטי בהתפתחות העוברית המוקדמת. שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין. תכנות מחדש אפיגנטי הוא תקופה קריטית במהלך התפתחות הרחם , ולחשיפה אימהית לכימיקלים יש פוטנציאל לתכנת מחדש את האפיגנום בתוך הצאצאים. זה עלול לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים. למרות שריצוף מבוסס ביסולפיט מאפשר לחוקרים לחקור מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של רחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים לשמש כמודל שלם מבחינה פיזיולוגית לחשיפת מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים ל-5 mC הזמינים מסחרית, אנו מתארים אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה בודדים ושלמים על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה, הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי. למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לזהות ולכמת בהצלחה רמות של 5-mC באתרם בתוך עוברי דגי זברה במהלך ההתפתחות המוקדמת. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ"א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לקבוע אם טיפול משפיע על השפע היחסי של 5-mC על ידי הערכת השטח הכולל והעוצמה היחסית של פלואורסצנטיות בתוך עוברים קבועים ומסומנים של דגי זברה. לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע תחילה אם IHC השלם היה מוצלח. כאשר עוברים מסומנים נצפים תחת מסנן FITC או GFP, תוצאה חיובית מסומנת על ידי אות FITC חיובי בתוך העובר, ואילו תוצאה שלילית מסומנת על ידי היעדר פלואורסצנטיות בתוך עוברי בקרה. באמצעות מערכת סינון בעלת תוכן גבוה, ניתן לאשר תוצאות אלה גם במהלך רכישת תמונה בא...

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

פרוטוקול זה מציע שיטה מהירה יחסית וחסכונית, כמו גם רכישה וניתוח אוטומטיים ובכך מייצר סינון ברגישות נמוכה של 5-מתילציטוזין שהוא סמן ביולוגי אפיגנטי נפוץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בגמישות שהיא מציעה עיצוב ניסיוני שמשתמשים יכולים לייעל למודל שלהם ולשלב הפיתוח. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות כיצד חשיפה כימית משנה את השפע היחסי של 5-מתילציטוזין בתוך אורגניזם מתפתח, שבדרך כלל ניתן היה לעשות זאת רק באמצעות שיטות יקרות של trpA גבוה כגון ריצוף.שיטה זו שימושית לכל מחקר שמטרתו להשתמש בשיטות NCG כדי להבין שינויים אפיגנטיים של 5-מתילציטוזין בתגובה לגירויים סביבתיים. התחילו בהכנת פתרון חשיפה חדש בבוקר האיסוף. הוסיפו חמישה מיליליטר של מי מערכת נטולי חלקיקים לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 60 מילימטר.לאחר מכן השתמש בפיפטה זכוכית מיקרו נימי של 10 מיקרוליטר כדי להעביר 10 מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד או תמיסת מלאי כימית למי המערכת. סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי להבטיח שתמיסת המלאי תתפוגג. מוסיפים עוד חמישה מיליליטר של מי מערכת לצלחת פטרי הזכוכית ומערבבים את המנה כדי להפוך את תמיסת החשיפה להומוגנית.מכסים את כלי הזכוכית במכסי זכוכית כדי למזער את האידוי. לאחר מכן, השתמש בבקבוק שפריץ מלא במים RO כדי להעביר את העוברים מרשת הדגים לצלחת של 100 מילימטר. מיין באופן אקראי 50 עוברים חיים בשעה 0.75 שעות לאח

rapid-efficient-spatiotemporal-monitoring-normal-aberrant-cytosine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Somitogenesis הוא תהליך התפתחותי קצבי שמרחבית דפוסי ציר הגוף של עוברי החולייתנים. בעבר, פיתחנו קווי דג הזברה מהונדסים המשתמשים בכתבי ניאון להתבונן גנים מחזוריים המניע את התהליך הזה. כאן, אנו תרבות מפוזרת תאים משורות אלה ותמונת התנודות שלהם לאורך זמן במבחנה.

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

מחקר זה קובע שיטת הדמיה רגישה מבוססת אימונופלואורסצנציה לכימות מתילציה גלובלית של DNA בלבבות עובריים בודדים של דגי זברה. גישה זו מתגברת על האתגר של מגבלות חומר רקמה ועוקפת את הצורך בהמרת ביסולפיט.

זיהוי מתילציה גלובלית של DNA בלבבות זחלי דגי זברה

למדו שיטה מהירה וחסכונית לניטור מתילציה של ציטוזין בעוברי דגי זברה שלמים באמצעות זיהוי אוטומטי של 5-Methylcytosine. הפרוטוקול מאפשר לחוקרים לבחון שינויים אפיגנטיים בתגובה לגירויים סביבתיים בקלות.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

גלה סרטונים נוספים