Name: דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: למד את שיטת הדה-פולריזציה הסלקטיבית של מיטוכונדריה אקסונאלית באמצעות מיקרופלואידיקה בנוירונים היפוקמפליים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תרופתי ממוקד של דינמיקת מיטוכונדריה באקסונים ללא הפרעה לגוף התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית (HA 7728/2-1 ו- EXC2145 Project ID 390857198) ואגודת מקס פלנק.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של ממשלת בוואריה עילית. הנוירונים הראשוניים הוכנו מעוברי עכברים מסוג E16.5 C57BL/6 משני המינים בשיטות סטנדרטיות כפי שתואר קודםלכן 6.
1. הרכבה של המכשיר המיקרופלואידי
<ol><li>מצפים צלחת תרבית רקמה אחת בעלת תחתית זכוכית של שש בארות בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל של פולי-D-ליזין ו-3.4 מיקרוגרם/מ"ל של למינין ב-PBS (תמיסת מלח עם מאגרי פוספט) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>לדגור על הצלחת המצופה למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר. הערה: ניתן לבצע ציפוי גם בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 שעות. בחירת הציפוי תלויה בסוג התא המשמש.</li>
	<li>לאחר הציפוי, הביאו את שש הצלחות למכסה המנוע הסטרילי ושטפו אותן פעמיים עם ddH2O סטרילי. הערה: אין לשטוף עם מאגרים המכילים מלח, כגון PBS, שכן גבישי מלח יפריעו להיווצרות כלבי הים.</li>
	<li>אפשרו לצלחת להתייבש במצב מוטה למשך 3-5 דקות. הסר עודפי מים על ידי שאיבה ואקום או פיפטציה.</li>
	<li>השרו את התא המיקרופלואידי ב-80% אתנול. הערה: התא המיקרופלואידי התקבל ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>אפשרו לתא המיקרופלואידי להתייבש במשך 3-5 דקות במצב מוטה. הסר עודפי אתנול על ידי ואקום, יניקה או פיפטציה.</li>
	<li>כאשר יבש לחלוטין, מניחים את התא המיקרופלואידי במרכז הבאר. הערה: ניתן לראות את היווצרות האטם כשינוי בתכונות רפלקטיביות עם הרחקת האוויר מהממשק בין הצלחת למכשיר הסיליקון. גם הצלחת וגם התא המיקרופלואידי חייבים להיות יבשים לחלוטין לפני ההרכבה כדי ליצור אטימה טובה. עם זאת, יש למזער את זמן הייבוש ככל האפשר כדי להבטיח דבקות נכונה בתאים. לכן, הבארות והתאים חייבים להיבדק חזותית עבור טיפות נוזליות שנותרו. אם אין טיפות גלויות, מיד להרכיב את התאים.</li>
	<li>הקש בעדינות על התא המיקרופלואידי בגבולותיו ועל חלק המיקרו-חריץ באמצע לחיבור תקין לצלחת הזכוכית.</li>
</ol>2. זריעה ותחזוקה של נוירונים
<ol><li>אסוף את המספר הרצוי של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס בכל תא בצינור תגובה של 1.5 מ"ל. הערה: עבור המחקר הנוכחי, 1.5 x 105 נוירונים נזרעו לכל מכשיר עבור יישומים מבוססי הדמיה.</li>
	<li>נוירונים צנטריפוגים ב 1000 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להשליך את הסופר-נאטנט בעזרת פיפטה ולהשהות את הכדור ב-8 מיקרון של מדיה B27-Neurobasal (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>צלע את תמיסת התא לתוך פתח התעלה של התא המיקרופלואידי (b באיור 1A).</li>
	<li>הקש על גב הלוח כדי לסייע בזרימה דרך הערוץ. הערה: הקשה יכולה להיעשות די בכוח מבלי לחשוש שהאטם יישבר.</li>
	<li>שאפו עם פיפטה על כל תרחיף התאים שנותר ביציאה מהתעלה (g באיור 1A) כדי להקטין את מספר התאים מחוץ לערוץ.</li>
	<li>דגירה של החדר המיקרופלואידי עם תאים למשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.</li>
	<li>מלאו את הבאר האקסונאלית העליונה ב-50 μL של מדיה B27-Neurobasal (c באיור 1A).</li>
	<li>הקש על גב הלוח כדי לסייע בזרימה דרך הערוץ.</li>
	<li>מלאו בארות בצד הסומה (a ו-h באיור 1A) ב-150 μL של מדיה B27-Neurobasal כל אחת, ויצרו בועת מתח למעלה. נפח הבועה הוא כ 20 μL. הערה: יצירת בועת מתח אינה הכרחית כדי להשיג בידוד נוזלי, אך היא מספקת תמונה ברורה של הנפח הגבוה יותר בצד הסומא.</li>
	<li>מלאו את שתי הבארות של הצד האקסונאלי (c ו-i באיור 1A) ב-100 μL של מדיה B27-Neurobasal כל אחת. הערה: כדי לקדם צמיחה אקסונאלית דרך המיקרוגרובים, מומלץ שהבארות בצד הסומה יכילו יותר מדיה מאשר הבארות בצד האקסון. עם זאת, אקסונים יגדלו במקרה דרך המיקרוגרובים גם ללא הבדלי נפח.</li>
	<li>לדגום את התא המיקרופלואידי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 7-8 ימים. הערה: בדרך כלל ניתן לראות צמיחה של אקסונים לתוך התא האקסונאלי החל מהיום במבחנה (DIV) 5. זמני גידול ארוכים יותר אפשריים אם רוצים תרבויות בוגרות יותר.</li>
	<li>הזן נוירונים כל 2-3 ימים על ידי הסרת המדיום משתי הבארות העליונות (a ו- c) והחלפתו במדיום B27-Neurobasal טרי עד ליצירת בועת מתח.</li>
</ol>3. הכתמה עם קרום המיטוכונדריה צבע רגיש פוטנציאלי
<ol><li>ב-DIV 7-8, העריכו כי האקסונים גדלו דרך המיקרו-חריצים והתרחבו לתוך התא האקסונאלי שמתחת למיקרוסקופ אור. הערה: שלבי DIV שונים אפשריים גם הם בהתאם לגיל הרצוי.</li>
	<li>בצע שתי שטיפות עם מדיום הדמיה מחומם מראש (37 °C) על ידי הסרת המדיום B27-Neurobasal מכל הבארות והוספת כ -100 μL של מדיום ההדמיה לבארות העליונות של הערוצים האקסונאליים והסומא (a ו - c). תנו למדיום לזרום אל הבארות התחתונות (h ו-i).<ol><li>מוציאים את המדיום מהבארות התחתונות ואת כל שאריות המדיום בבארות העליונות, וחוזרים על הפעולה עם מדיום טרי, ומשאירים את הבארות ריקות בסוף הכביסה. הערה: בשל הכוח הנימי הגבוה בתעלות (d ו-f), יישאר אמצעי שטיפה בתעלות שאין להסירו כדי למנוע מהנוירונים להתייבש. ניתן להשתמש בכל אמצעי הדמיה נטול פנול-אדום כאן, למשל, Hibernate E (ראו טבלת חומרים). אם המיקרוסקופ אינו מוגדר עם אספקת CO 2, ודא שאמצעי ההדמיה משתמש במערכת אגירה חלופית כדי קרבונט/CO2 (לדוגמה, HEPES)8.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לדלל 1 mM טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE, אדום, ראו טבלת חומרים) עד 5 ננומטר במדיום ההדמיה. הערה: אין לחרוג מ-1% DMSO בדילול הסופי כדי למנוע רעילות.</li>
	<li>הוסף 100 μL של דילול TMRE 5 ננומטר הן לבארות העליונות הסומטיות והן לבארות האקסונאליות (a ו - c), ותן למדיום לזרום דרך שני התאים הסומאטיים והאקסונאליים עד שיהיה נפח שווה בכל הבארות. מלאו את המדיום המכיל TMRE.</li>
	<li>החזירו את הנוירונים לתא סביבה מבוקרת (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2) למשך 25 דקות.</li>
	<li>בצע שתי שטיפות עם מדיום ההדמיה שחומם מראש (37 °C) כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.2). בכביסה האחרונה, מלאו 100 μL בכל באר וצרו בועת מתח של המדיום על הבארות הסומטיות (a ו - c).</li>
</ol>4. הדמיית תאים חיים
הערה: תמונות סטילס שהוצגו נרכשו במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, תוך שימוש במטרת טבילה של 40x NA 1.25 (ראו טבלת חומרים). נבחרו זמן חשיפה של 200 אלפיות השנייה ועוצמת לייזר של 10% עבור הערוץ האדום וזמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה עבור Brightfield. עם זאת, מיקרוסקופים קונפוקליים רגילים או רחבים הפוכים יכולים לשמש גם כדי לחקור את עוצמת TMRE.
<ol><li>דמיינו את התאים במיקרוסקופ הפוך.</li>
	<li>ודא כי המיקרוסקופ מצויד באינקובטור שלב כדי לשמור על התרבות העצבית ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>בחר אזור עניין בתא הסומטי, ועקוב אחריו דרך המיקרו-גרובים לתוך התא האקסוןאלי. ודא שהמיקרו-גרובים שצולמו תואמים לאלה שבתאים הסומטיים והאקסונאליים (להשוואה קלה יותר בין הבסיס ולאחר הטיפול).</li>
	<li>צלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות עירור ב-561 ננומטר ופליטה ב-625 ננומטר לאות פלואורסצנטי אדום.</li>
	<li>רכשו את התמונות.</li>
	<li>כדי לגרום לדה-פולריזציה של המיטוכונדריה, יש להוסיף 20 μM Antimycin A (ראו טבלת חומרים) במדיום ההדמיה לתא האקסונאלי. כדי להבטיח הפרש נפח בין התאים הסומא והאקסונאליים, בדוק את נוכחותה של בועת מתח בצד הסומטי (שווה לנפח >110 μL).<ol><li>הסר את כל מדיום ההדמיה מהבאר התחתונה של הצד האקסונאלי (i), למעט המדיום שבתוך הערוץ (f). הוסף 160 μL של 20 μM Antimycin A לבאר האקסונאלית העליונה (c) ותן לה לזרום דרך הערוץ עד שיהיה נפח שווה בשתי הבארות האקסונליות. הנפחים בבארות אקסונאליות הם בערך 80 μL לכל באר. הערה: ודא שהנפח בבארות האקסונאליות קטן יותר מאשר בבארות הסומטיות כדי להבטיח לחץ נוזלים תקין. מומלץ הבדל של לפחות 10 μL (10% מנפח הבאר), אך גם הבדלים גבוהים יותר אפשריים.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור נוירונים בתא הסביבה המבוקרת (37 מעלות צלזיוס) במשך 20-30 דקות.</li>
	<li>חזור על ההדמיה כמתואר לעיל (שלבים 4.3-4.5). ודא שאותם מיקומים מצולמים (מזוהים בקלות על ידי המיקרו-גרובים) כמו במהלך הרכישה הבסיסית.</li>
</ol>

<ol><li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+neuronal+health%3A+from+energy+metabolism+to+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663(2021).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li>
<li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-+tetrahydropyridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li>
<li>Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
<li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li>
<li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li>
<li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזרוע ולתרבת נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשיר מיקרופלואידי לטיפול במיטוכונדריה אקסונאלית בנפרד. התועלת של גישה זו עם הצבע הרגיש לממברנה TMRE ומעכב III המורכב Antimycin A (כפי שהוכח בעבר7) מודגמת כאן, אך ניתן להתאים שיטה זו בקלות לצבעים מיטוכונדריאליים אחרים או לחיישנים מקודדים גנטית של פונקציות מיטוכונדריאליות המאפשרות קריאות מקומיות, מבוססות מיקרוסקופיה9. ניתן לגדל סוגי תאים עצביים אחרים גם בתאים מיקרופלואידיים, כגון נוירונים קליפתיים ראשוניים<...

מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. מכיוון שבריאות עצבית קשורה קשר הדוק לתפקוד המיטוכונדריה, אין זה מפתיע כי ויסות לא מתפקד של אברונים אלה נקשר עם הופעת מחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון1. יתר על כן, שיכרון מיטוכונדריאלי שימש בהצלחה למודל תסמיני פרקינסון בבעלי חיים2. הן במודלים של בעלי חיים והן במחלות אנושיות, מותם של תאי עצב מתחיל בחלקים הדיסטליים 3,4, מה שמרמז על כך שהמיטוכונדריה האקסונלית עשויה להיות רגישה יותר לעלבונות. עם זאת, הביולוגיה של המיטוכונדריה באקסונים אינה מובנת היטב בשל הקשיים הקשורים לטיפול ממוקד וניתוח של מיטוכונדריה אקסונאלית ללא הפרעה בו זמנית של תהליכים בגוף התא.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות culturing של נוירונים מנותקים במבחנה מאפשרת כעת הפרדה נוזלית של אקסונים וגופי תאים באמצעות התקנים מיקרופלואידיים5. כפי שמתואר באיור 1A, המכשירים האלה כוללים ארבע בארות גישה (a/h ו-c/i), עם שני ערוצים המחברים כל זוג (d ו-f). הערוצים הגדולים מחוברים זה לזה בסדרה של מיקרו-ערוצים באורך 450 מיקרומטר (e). הבדלים מכוונים ברמות המילוי בין שני התאים יוצרים שיפוע לחץ נוזל (איור 1B) שמונע דיפוזיה של מולקולות קטנות מהתעלה עם רמת נוזל נמוכה יותר לצד השני (איור 1C, מודגם בצבע כחול טריפאן).
לאחרונה השתמשנו בהתקנים מיקרופלואידיים כדי לחקור את דרישות התרגום המקומיות במיטופגיה אקסונאלית, הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה6. בפרוטוקול הנוכחי מוצגים צעדים שונים לגרימת נזק מיטוכונדריאלי מקומי באמצעות טיפול סלקטיבי באקסונים באמצעות מעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי III Antimycin A 6,7.

<table><tbody><tr><td>צלחת תחתונה זכוכית 6 בארות</td><td>Cellvis</td><td>P06.1.5H-N</td><td>מכשיר סיליקון</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M5000 מיקרוסקופ שדה רחב</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>EVOS M5000</td><td>מיקרוסקופ דיגיטלי רחב שדה משולב במלואו</td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE500</td><td></td></tr><tr><td>דיסק מסתובב הפוך קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>TI2-E + CSU-W1</td><td>עם תא חממה</td></tr><tr><td>למינין</td><td>Invitrogen</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>מכשירים מיקרופלואידיים</td><td>XONA מיקרופלואידיקה</td><td>RD450</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>סיגמא</td><td>87917</td><td></td></tr></tbody></table>

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

מיטוכונדריה הם הספקים העיקריים של ATP (אדנוזין טריפוספט) בתאי עצב. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא פנוטיפ נפוץ במחלות נוירודגנרטיביות רבות. בהתחשב בארכיטקטורה המשוכללת ובאורך הקיצוני של חלק מהאקסונים, אין זה מפתיע שהמיטוכונדריה באקסונים יכולה לחוות סביבות שונות בהשוואה למקביליהם בגוף התא. באופן מעניין, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה האקסונלית לעתים קרובות קודם להשפעות על גוף התא. כדי ליצור מודלים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה במבחנה, התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים טיפול במיטוכונדריה אקסונאלית מבלי להשפיע על המיטוכונדריה הסומאלית. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מונע דיפוזיה של מולקולות כנגד השיפוע, ובכך מאפשר ניתוח של תכונות המיטוכונדריה בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מקומיים בתוך האקסונים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס במכשירים מיקרופלואידיים, הכתמה בצבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, טיפול ברעלן מיטוכונדריאלי, והניתוח המיקרוסקופי שלאחר מכן. שיטה רב-תכליתית זו לחקר הביולוגיה האקסונאלית יכולה להיות מיושמת על הפרעות פרמקולוגיות רבות וקריאות הדמיה, והיא מתאימה למספר תת-סוגים עצביים.

נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס גודלו במכשירים מיקרופלואידיים במשך 7-8 ימים לפני שהמיטוכונדריה הוכתמה בצבע הרגיש לממברנה (TMRE) במשך 25 דקות בשתי הערוצים. כפי שניתן לראות באיור 2A, זה הניב כתמים הומוגניים של המיטוכונדריה משני צידי המיקרו-גרובים, אך לא היה די בכך כדי לאזן את הכתמים במרכז המיקרו-גרובים. עם הוספת אנטימיצין A לצד האקסונאלי, המיטוכונדריה הסומלית שמרה על אות ה-TMRE (איור 2B ווידאו 1), בעוד שהפלואורסצנציה של TMRE אבדה מהמיטוכונדריה האקסונלית (<strong clas...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה והכתמה של מיטוכונדריה עצבית בתאים מיקרופלואידיים. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מאפשר טיפול סלקטיבי במיטוכונדריה באקסונים כדי לנתח את תכונותיהם בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מבלי להשפיע על תא גוף התא.

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

מיטוכונדריה חיונית לבריאות תאי העצב. במחלות נוירודגנרטיביות רבות, המיטוכונדריה האקסונאלית היא הראשונה שסובלת, אך לא ברור מה הופך את המיטוכונדריה האקסונלית למיוחדת כל כך. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים המשמשים בפרוטוקול זה מאפשר טיפול סלקטיבי באקסונים של המיטוכונדריה.זה משאיר את תהליכי הגוף התא ללא הפרעה, ומאפשר לנו להתמקד בביולוגיה אקסונאלית. אנו מראים כאן את הדה-פולריזציה של מיטוכונדריה עם צבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, אך ניתן ליישם שיטה זו על סוגי תאים עצביים רבים ושונים, ועל קריאות פלואורסצנטיות. כדי להתחיל, הניחו את שש צלחות הבאר המקודדות במכסה מנוע סטרילי, ושטפו אותן פעמיים במים מזוקקים כפולים סטריליים.תנו לצלחות להתייבש במצב מוטה למשך שלוש עד חמש דקות. הסר עודפי מים על ידי שאיבה ואקום או פיפטציה. לאחר מכן השרו את התא המיקרופלואידי ב-80% אתנול.שוב, לייבש את החדר microfluidic במשך שלוש עד חמש דקות במצב מוטה, ולהסיר אתנול עודף עם קצה פיפטה. כאשר יבש לחלוטין, מניחים את התא המיקרופלואידי במרכז הבאר ובצלחת. הקש בעדינות על התא המיקרופלואידי בגבולותיו ועל חלק המיקרו-חריץ באמצע לחיבור תקין לצלחת הזכוכית.ראשית, אסוף את המספר הרצוי של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס בצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 1000 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט, והניחו את הכדור בשמונה מיקרוליטרים של B-27 נוירו באזל.לאחר מכן יש לחלק את תמיסת התא לתוך פתח התעלה של החדר המיקרופלואידי. הקש על גב הלוח כדי לסייע לזרימה דרך הערוץ. באמצעות פיפטה, לשאוף כל השעיה התא הנותר ביציאה של הערוץ.דגרו את התא המיקרופלואידי עם תאים למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, מלאו את הבאר האקסונאלית העליונה ב-50 מיקרוליטרים של מדיה נוירובסלית B-27, והקישו על גב הצלחת כדי לסייע לזרימה. מלא כל באר בצד סומה עם 150 microliters של B-27 neurobasal מדיה, יצירת בועת מתח על גבי.כמו כן למלא את שתי הבארות של הצד האקסונאלי עם 100 microliters של B-27 neurobasal מדיה כל אחד. לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבית במבחנה, ודא שהאקסונים גדלו דרך המיקרו-גרובים, והתרחבו לתא האקסונאלי. שטפו את המכשיר על ידי הסרת המדיום הנוירובסאלי B-27, והוספת 100 מיקרוליטרים של מדיום הדמיה מחומם מראש לבארות העליונות של הערוצים האקסונאליים והסומא.תנו למדיום לזרום אל הבארות התחתונות. מוציאים את המדיום מהבארות התחתונות, ואת כל שאריות המדיום מהבארות העליונות, וחוזרים עם מדיום טרי, ומשאירים את הבארות ריקות בסוף הכביסה. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חמישה דילול TMRE ננומולרי הן לבארות העליונות הסומטיות והן לבארות העליונות האקסונאליות.תן למדיום לזרום דרך שני התאים, עד שיהיה נפח שווה בכל הבארות. מלאו את המדיום המכיל TMRE. בחר אזור עניין בתא הסומטי, ועקוב אחריו דרך המיקרו-גרובים לתוך התא האקסוןאלי.ודא שהמיקרו-חריצים המצולמים בתאים הסומטיים והאקסונאליים מותאמים זה לזה. לאחר שינוי שם הקובץ, קבל תמונות פלואורסצנטיות אדומות באמצעות עירור של 561 ננומטר ואורכי גל פליטה של 625 ננומטר. ודא הפרש נפח בין התאים הסומא והאקסונאליים על ידי בדיקת נוכחות של בועת מתח בצד הסומטי.לאחר מכן הסר את מדיום ההדמיה משתי הבארות של הצד האקסונאלי, למעט המדיום בתוך הערוץ. כדי לגרום לדה-פולריזציה של המיטוכונדריה, הוסיפו 160 מיקרוליטרים של 20 מיקרומולר אנטימיצין A מדולל במדיום ההדמיה לבאר האקסונלית העליונה. תן לו לזרום דרך הערוץ עד שיש נפח שווה בשתי הבארות האקסונליות.חזור על ההדמיה, וודא שאותן עמדות מוצגות כמו במהלך הרכישה הבסיסית, על ידי זיהוי המיקרוגרובים. באמצעות פרוטוקול זה, נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס גודלו במכשירים מיקרופלואידיים, ולאחר מכן הכתימו את המיטוכונדריה עם צבע רגיש לממברנה, TMRE. צביעה הומוגנית של המיטוכונדריה נצפתה משני צידי המיקרוגרובים, אך לא באמצע.עם הוספת אנטימיצין A לצד האקסונאלי, המיטוכונדריה הסומלית שמרה על אות ה-TMRE, בעוד שהפלואורסצנציה אבדה מהמיטוכונדריה האקסונאלית ודא שלא נותרת לחות בבאר או במכשיר לפני הרכבת המכשיר. אחרת, התאים לא יהיו אטומים. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לחקור את ההשפעות של אובדן תפקוד מיטוכונדריאלי באקסון ובתפקודים מקומיים, כמו גם את השפעתו על איתות מדרדר והישרדות תאים גלובלית.זה זמן רב חשבו שביוגנזה מיטוכונדריאלית מתרחשת אך ורק בגוף התא. שיטה זו אפשרה לנו לגלות שפגיעה אקסונלית במיטוכונדריה דרשה תרגום מקומי של החלבון PINK1.

microfluidics-assisted-selective-depolarization-of-axonal-mitochondria

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר תחבורה אקסונלית בנוירונים מוטוריים באמצעות מערכת תא מיקרופלואידית. זה כרוך בגידול רקמות חוט השדרה העוברי של עכבר בבארות מצופות פולימר עם מדיום מזין כדי לגרום לצמיחה אקסונלית. התנועה של אברונים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי בהדמיה חיה, מאשרת את ההובלה האקסונלית הדו-כיוונית.

מעקב אחר הובלה אקסונלית של אברונים בנוירונים מוטוריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס.

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

הרשת המיטוכונדריאלית מורכבת ביותר, מה שהופך אותה למאתגרת מאוד לניתוח. כלי חדשני של MATLAB מנתח מיטוכונדריה עם תמונות קונפוקליות חיות בתמונות timelapse, אך התוצאה היא נפח פלט גדול הדורש תשומת לב ידנית אישית. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחה אופטימיזציה שגרתית, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר.

ניתוח אוטומטי אופטימלי של אפנון הומאוסטזיס מיטוכונדריה עצבית חיה על ידי קולטני חומצה רטינואית ספציפיים לאיזופורם

כאן, אנו מתארים את מדידת קצב ההובלה האקסונלית של מייצבים מכוננים של ממברנות רשתית אנדופלזמית (ER) הקשורות למיטוכונדריה (MAMs) על ידי הגדלה או שמירה על יצירת β-עמילואיד (Aβ) נוירוטוקסית מנוירונים של מחלת אלצהיימר (AD) בזמן אמת כדי לשמש כמדד ישיר וכמותי למדידת ייצוב MAM ולסייע בפיתוח טיפולים במחלת אלצהיימר.

ניתוח כמותי של ייצוב קרום הרשתית האנדופלזמית (MAM) הקשור למיטוכונדריה במודל עצבי של מחלת אלצהיימר (AD) 

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

אנו מציגים פרוטוקול לחדירות סלקטיבית של ממברנת הפלזמה, המאפשר אספקה ממוקדת של סובסטרטים ומעכבים להערכת פוספורילציה חמצונית מיטוכונדריאלית (OXPHOS) בתאים מתורבתים, תוך התגברות על מחסומי העברת ממברנת הפלזמה שבדרך כלל מונעים ניתוח כזה. באמצעות טכניקה זו הראינו כיצד תפקוד OXPHOS מווסת על ידי אגוניסטים ואנטגוניסטים מוסקריניים.

מודולציה תלויה בליגנד כולינרגי של קישור זרחון חמצוני בתאי נוירובלסטומה BE(2)-C עם פרי דיגיטונין

למד את שיטת הדה-פולריזציה הסלקטיבית של מיטוכונדריה אקסונאלית באמצעות מיקרופלואידיקה בנוירונים היפוקמפליים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תרופתי ממוקד של דינמיקת מיטוכונדריה באקסונים ללא הפרעה לגוף התא.

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

גלה סרטונים נוספים