דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

מיטוכונדריה חיונית לבריאות תאי העצב. במחלות נוירודגנרטיביות רבות, המיטוכונדריה האקסונאלית היא הראשונה שסובלת, אך לא ברור מה הופך את המיטוכונדריה האקסונלית למיוחדת כל כך. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים המשמשים בפרוטוקול זה מאפשר טיפול סלקטיבי באקסונים של המיטוכונדריה.

זה משאיר את תהליכי הגוף התא ללא הפרעה, ומאפשר לנו להתמקד בביולוגיה אקסונאלית. אנו מראים כאן את הדה-פולריזציה של מיטוכונדריה עם צבע רגיש פוטנציאלי לממברנה, אך ניתן ליישם שיטה זו על סוגי תאים עצביים רבים ושונים, ועל קריאות פלואורסצנטיות. כדי להתחיל, הניחו את שש צלחות הבאר המקודדות במכסה מנוע סטרילי, ושטפו אותן פעמיים במים מזוקקים כפולים סטריליים.

תנו לצלחות להתייבש במצב מוטה למשך שלוש עד חמש דקות. הסר עודפי מים על ידי שאיבה ואקום או פיפטציה. לאחר מכן השרו את התא המיקרופלואידי ב-80% אתנול.

שוב, לייבש את החדר microfluidic במשך שלוש עד חמש דקות במצב מוטה, ולהסיר אתנול עודף עם קצה פיפטה. כאשר יבש לחלוטין, מניחים את התא המיקרופלואידי במרכז הבאר ובצלחת. הקש בעדינות על התא המיקרופלואידי בגבולותיו ועל חלק המיקרו-חריץ באמצע לחיבור תקין לצלחת הזכוכית.

ראשית, אסוף את המספר הרצוי של נוירונים מנותקים בהיפוקמפוס בצינור תגובה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 1000 פעמים G במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט, והניחו את הכדור בשמונה מיקרוליטרים של B-27 נוירו באזל.

לאחר מכן יש לחלק את תמיסת התא לתוך פתח התעלה של החדר המיקרופלואידי. הקש על גב הלוח כדי לסייע לזרימה דרך הערוץ. באמצעות פיפטה, לשאוף כל השעיה התא הנותר ביציאה של הערוץ.

דגרו את התא המיקרופלואידי עם תאים למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, מלאו את הבאר האקסונאלית העליונה ב-50 מיקרוליטרים של מדיה נוירובסלית B-27, והקישו על גב הצלחת כדי לסייע לזרימה. מלא כל באר בצד סומה עם 150 microliters של B-27 neurobasal מדיה, יצירת בועת מתח על גבי.

כמו כן למלא את שתי הבארות של הצד האקסונאלי עם 100 microliters של B-27 neurobasal מדיה כל אחד. לאחר שבעה עד שמונה ימים של תרבית במבחנה, ודא שהאקסונים גדלו דרך המיקרו-גרובים, והתרחבו לתא האקסונאלי. שטפו את המכשיר על ידי הסרת המדיום הנוירובסאלי B-27, והוספת 100 מיקרוליטרים של מדיום הדמיה מחומם מראש לבארות העליונות של הערוצים האקסונאליים והסומא.

תנו למדיום לזרום אל הבארות התחתונות. מוציאים את המדיום מהבארות התחתונות, ואת כל שאריות המדיום מהבארות העליונות, וחוזרים עם מדיום טרי, ומשאירים את הבארות ריקות בסוף הכביסה. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חמישה דילול TMRE ננומולרי הן לבארות העליונות הסומטיות והן לבארות העליונות האקסונאליות.

תן למדיום לזרום דרך שני התאים, עד שיהיה נפח שווה בכל הבארות. מלאו את המדיום המכיל TMRE. בחר אזור עניין בתא הסומטי, ועקוב אחריו דרך המיקרו-גרובים לתוך התא האקסוןאלי.

ודא שהמיקרו-חריצים המצולמים בתאים הסומטיים והאקסונאליים מותאמים זה לזה. לאחר שינוי שם הקובץ, קבל תמונות פלואורסצנטיות אדומות באמצעות עירור של 561 ננומטר ואורכי גל פליטה של 625 ננומטר. ודא הפרש נפח בין התאים הסומא והאקסונאליים על ידי בדיקת נוכחות של בועת מתח בצד הסומטי.

לאחר מכן הסר את מדיום ההדמיה משתי הבארות של הצד האקסונאלי, למעט המדיום בתוך הערוץ. כדי לגרום לדה-פולריזציה של המיטוכונדריה, הוסיפו 160 מיקרוליטרים של 20 מיקרומולר אנטימיצין A מדולל במדיום ההדמיה לבאר האקסונלית העליונה. תן לו לזרום דרך הערוץ עד שיש נפח שווה בשתי הבארות האקסונליות.

חזור על ההדמיה, וודא שאותן עמדות מוצגות כמו במהלך הרכישה הבסיסית, על ידי זיהוי המיקרוגרובים. באמצעות פרוטוקול זה, נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס גודלו במכשירים מיקרופלואידיים, ולאחר מכן הכתימו את המיטוכונדריה עם צבע רגיש לממברנה, TMRE. צביעה הומוגנית של המיטוכונדריה נצפתה משני צידי המיקרוגרובים, אך לא באמצע.

עם הוספת אנטימיצין A לצד האקסונאלי, המיטוכונדריה הסומלית שמרה על אות ה-TMRE, בעוד שהפלואורסצנציה אבדה מהמיטוכונדריה האקסונאלית ודא שלא נותרת לחות בבאר או במכשיר לפני הרכבת המכשיר. אחרת, התאים לא יהיו אטומים. באמצעות שיטה זו אנו יכולים לחקור את ההשפעות של אובדן תפקוד מיטוכונדריאלי באקסון ובתפקודים מקומיים, כמו גם את השפעתו על איתות מדרדר והישרדות תאים גלובלית.

זה זמן רב חשבו שביוגנזה מיטוכונדריאלית מתרחשת אך ורק בגוף התא. שיטה זו אפשרה לנו לגלות שפגיעה אקסונלית במיטוכונדריה דרשה תרגום מקומי של החלבון PINK1.