ג. אלגנס גונד דיסקציה והקפאת סדק לאימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI
16 בספטמבר 2022
זוהי שיטה נפוצה עבור דיסקציה של גונאד C. elegans ואחריה סדק הקפאה, אשר מייצרת דגימות germline עבור immunofluorescence באמצעות צביעת נוגדנים, או עבור צביעת DAPI פשוטה כדי לדמיין DNA. פרוטוקול זה זכה להצלחה עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדת מחקר ובהתנסות מחקרית לתואר ראשון מבוססת קורסים.
שיטה זו לדיסקציה ואימונופלואורסצנציה משמשת מעבדות C.elegans רבות. ניתן לאמץ אותו כדי לזהות כל חלבון שנוגדן או חלבון היתוך מתויג זמינים עבורו. למרות שזה דורש קצת תרגול כדי לקבל את זה ניתוח נכון, פרוטוקול זה הוא גמיש ופשוט לפתור בעיות.
עבורנו, צביעת DAPI תמיד עובדת ובדרך כלל אנו יכולים למצוא מצב שעובד עבור כל נוגדן. האתגר הגדול ביותר בטכניקה זו הוא שלב הנתיחה. אתה צריך לעבוד במהירות אבל בביטחון כדי לקבל הבלטה germline טוב.
תרגול הוא המפתח. כדי להתחיל, הנח שקופית אחיזה על הבמה של מיקרוסקופ מנתח והנח את הכיסוי על גבי שקופית האחיזה. לאחר מכן, הזיזו ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת החיתוך למרכז הכיסוי והזיזו את מגלשת האחיזה לצד אחד של הבמה כדי לפנות את הנוף.
בחר 10 עד 20 הרמפרודיטים מצלחת NGM לתוך טיפת תמיסת הניתוח. עדיף לבחור בערך 10 לכל שקופית אבל לא כל כך הרבה שלא ניתן לנתח אותם תוך חמש דקות. כדי לנתח את החיות, חצו את נקודות המחטים כדי ליצור צורת X והשתמשו בתחתית ה-X כדי להצמיד מבוגר אל פני השטח של הכיסוי.
לאחר מכן, מקם את צורת ה- X מיד מאחורי הלוע, כחמישית מאורך גופו של מבוגר צעיר או ממש מתחת לחלק הברור של הראש. לאחר מכן, לערוף את החיה בתנועת מספריים אחת, ולשחרר באופן מלא מחלל הגוף, יחד עם אחד או שני חצאי המעיים. כדי לתקן את הדגימה עם פורמלדהיד, פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת התיקון על הכיסוי, קרוב מאוד לטיפה עם בעלי חיים, תוך הימנעות פיפטה ישירות לתוך טיפת דיסקציה ועקירת הפגרים המנותקים.
הצמד את הכיסוי לשקופית ההחזקה באמצעות אצבע אחת. ביד השנייה, הזיזו בעדינות את הכיסוי כמה פעמים כדי לערבב את הטיפות. החזקת מגלשה טעונה חיובית בצד הקדמי כלפי מטה, השתמש בה כדי להרים את הכיסוי במרכז המגלשה על ידי נגיעה עדינה בטיפת הדגימה, ומתח הפנים של הטיפה ירים את הכיסוי.
מניחים את המגלשה על הספסל ומתקנים במשך חמש דקות בדיוק בטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, תייג את השקופית בעיפרון. כדי להקפיא את הדגימה באמצעות חנקן נוזלי תוך החזקת הקצה המסומן של המגלשה בפינצטה, הורידו אותה בעדינות לחנקן נוזלי.
שחררו את השקופית, כך שהיא תישען על צד הכוס כשצד הכיסוי כלפי מעלה, והשקופיות מוקפאות תוך 10 שניות. אם אתם משתמשים בקרח יבש כדי לקפוא, לאחר גירוד הכפור מפני השטח של גוש האלומיניום בעזרת סכין גילוח, החזיקו היטב את הקצה המסומן של המגלשה והניחו אותו על המשטח המנוקה, תוך הפעלת לחץ כלפי מטה כדי להבטיח מגע מלא עם הבלוק. הקפאה מתרחשת תוך 10 שניות כאשר הדגימה מתחת לכיסוי הופכת לקרח.
הסר את השקופית הקפואה על-ידי אחיזה חזקה בקצה הקצר המסומן של המגלשה, והצמד קצה ארוך אחד לספסל. ביד השנייה, אחזו בחוזקה בתער והחליקו את קצה סכין הגילוח במורד המגלשה כדי להסיר את הכיסוי מהדגימה ולהרחיק אותה. הניחו מיד את השקופית בצנצנת קופלין המכילה 95% אתנול, והשאירו את השקופיות באתנול למשך חמש דקות לפחות.
לאחר מכן, יש לשטוף את השקופיות ב-PBST שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר, תוך שימוש ב-PBST טרי לכל כביסה. תוצאות הדמיה פלואורסצנטית של גרעיני חיידקים הראו כי DAPI נקשר בחוזקה לדנ"א. צביעה אימונופלואורסצנטית הייתה יעילה כאשר הנוגדן המכוון ל-RAD-51, סמן לשברים דו-גדיליים, היה נוכח כמוקדים בדידים בתוך גרעינים מיוטיים, שעברו לוקליזציה משותפת על כרומוזומים המסומנים על ידי DAPI.
למוטנטים של kle-2 heterozygotes יש פגמים קלים במבנה הכרומוזומים, כפי שמוצג על ידי צביעת DAPI מעט לא מסודרת ועלייה במספר השבירה הדו-גדילי, המשתקפת במספר הגבוה יותר של מוקדי RAD-51. גם שלבי ההסרה וגם שלבי הסדק בהקפאה יכולים להיות מסובכים ולכן חשוב לעבוד במהירות ובצורה חלקה. אנו ממליצים לתרגל שלבים אלה לפני שתנסה את הפרוטוקול כולו.
לדוגמה, אתה יכול לתרגל כריתה בנפח גדול יותר של נוזל, כמו 200 מיקרוליטרים, ובהדרגה לרדת לנפח המומלץ שלנו של ארבעה מיקרוליטרים במחליק כיסוי. טכניקה זו יכולה לשמש להדמיה ברזולוציה גבוהה במיקרוסקופ תאורה קונפוקלי או מובנה, או שניתן להשתמש בה בשילוב עם DNA או RNA-FISH, הכלאה פלואורסצנטית באתרה, כדי לדמיין כיצד חלבונים מתמקמים ביחס לרצפים ספציפיים.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לדיסקציה של גונד (איבר מין) של C. elegans ולאחריה freeze crack, המאפשרת הכנה של דגימות מקו הנבט לצביעת אימונופלואורסצנציה או צביעת DAPI. הוא תוכנן להיות נגיש הן עבור סטודנטים לתואר ראשון במעבדות מחקר והן במסגרת חוויות למידה מבוססות קורס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- C. elegans הוא אורגניזם מודל הנמצא בשימוש נרחב במחקר ביולוגי.
- אימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI הן טכניקות חיוניות להדמיה של מבנים תאיים.
- טכניקות דיסקציה דורשות דיוק ותרגול כדי להשיג תוצאות אופטימליות.
- הבנת מבנה קו הנבטה (germline) היא קריטית לחקר תהליכים גנטיים.
מטרת המחקר
- לספק שיטה מהימנה לניתוח של גונדות של C. elegans.
- להקל על ויזואליזציה של גרעיני תאי הנבט באמצעות אימונופלואורסצנציה וצביעת DAPI.
- לשפר את חוויית הלמידה עבור חוקרים בדרגת תואר ראשון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של הרמאפרודיטים של C. elegans באמצעות מיקרוסקופ.
- קיבוע דגימות באמצעות פורמלהיד.
- סדקי הקפאה של דגימות באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש.
- צביעה ב-DAPI ובנוגדנים ספציפיים לצורך דימות.
תוצאות עיקריות
- DAPI נקשר ביעילות ל-DNA, מה שמאפשר ויזואליזציה של גרעיני תאי הנבט.
- צביעה אימונופלואורסצנטית חושפת מוקדי RAD-51 המעידים על שברים בשרשרת הכפולה.
- מוטנטים הטרוזיגוטים עבור Kle-2 מראים פגמים במבנה הכרומוזומים.
- ניתן להשיג דימוג מוצלח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיה של תאורה מובנית.
מסקנות
- הפרוטוקול גמיש וניתן להתאימו לסוגים שונים של נוגדנים.
- תרגול הוא חיוני לשליטה בטכניקת הנתיצה.
- שיטה זו תומכת בדימות ברזולוציה גבוהה ובמחקרים גנטיים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
צביעת אימונופלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה וצביעת DAPI של גונדות של C. elegans מאפשרות הדמיה מדויקת של ההתקדמות המיוטית והארכיטקטורה הכרומוזומלית, ובכך הן תומכות בתיקוף מטרות בשלב מוקדם בביולוגיה של קו הנבטה. סבב עבודה זה מספק גישה חזקה וניתנת לשחזור לכל השלבים המיוטיים בתוך תכשיר בודד, מה שמקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים ועל ניתוח השוואתי של הפרעות גנטיות. הגמישות והכושר ההסתגלות של הפרוטוקול הופכות אותו לנכס רב-פעמי עבור צוותי מחקר החוקרים לוקליזציה של חלבונים, תיקון DNA ושלמות כרומוזומלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של מיקום חלבונים ואירועים כרומוזומליים לאורך שלבי המיוזה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של יעדים גנטיים המעורבים בתיקון DNA ובמבנה הכרומוזומים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להשוואה מקבילה בין פנוטיפים של סוג בר (wild-type) לבין פנוטיפים מוטנטיים.
- מספק פלטפורמה לחקירה מונחית-השערות של מסלולים ספציפיים לתאי נבט.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספקת דגימות שלמות (whole-mount) שעברו ולידציה ומתאימות לבדיקות אימונופלואורסצנציה כמותיות.
- מבטיחה הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות שלבי קיבוע וחדירה (permeabilization) חסונים.
- מאפשרת תהליכי דימות ניתנים להרחבה לסריקת ספציפיות של נוגדנים ואיתור מיקום האות.
- תומכת בשילוב של שלבים מאוחרים יותר עם DNA/RNA-FISH ופלטפורמות מיקרוסקופיה מתקדמות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים הרלוונטיים למחלה לצורך חקר יציבות הגנום ופגמים מייוטיים.
- מספק רציפות מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות בתאי הנבט.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים של מטרות המשפיעות על שלמות הכרומוזומים ותיקון DNA.
- מציע ערך ניבוי לפיתוח ביומרקרים תרגומיים בביולוגיה של הרבייה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי וניתן לשחזור של אירועים בקו הנבט ב-C. elegans. הוא תומך בתהליכי עבודה החל מתיקוף מטרה (target validation), דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד למחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים בפיתוח תאי נבט ובתיקון DNA.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה לצורך תיקוף נוגדנים وديמות כמותי.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות אמינות של לוקליזציה של חלבונים, מבנה כרומוזומלי וסמני נזק ל-DNA.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים גנטיים למודלים פרה-קליניים של חוסר יציבות גנומית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למטרות חלבון מגוונות ותואמת למספר שיטות דימות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי קו נבט (germline).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת דגימות עבור תהליכי עבודה של דימוי הניתנים לשחזור וברי-הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה בין וריאנטים גנטיים והתערבויות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מטרות המשפיעות על שלמות הכרומוזומים ותיקון DNA.
שיקולי יישום
- נדרשת מיומנות בטיפול ובטכניקות דיסקציה של C. elegans.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ולנוגדנים מאושרים או לחלבונים מתויגים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי קיבוע, פרמיאביליזציה וצביעה.
- ניתן להתאמה לרקעים גנטיים שונים, ותואם לזרימות עבודה של DNA/RNA-FISH.
- שלבי הדיסקציה והסדק בהקפאה (freeze crack) דורשים תרגול כדי להבטיח איכות דגימה עקבית.
