הערכה ומניפולציה של פעילות עצבית באמצעות מיקרוסקופיה הולוגרפית דו-פוטונית

פרוטוקול זה מספק מידע זמני מרחבי מדויק על נוירואקטיביות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לתפעל ולהעריך נוירואקטיביות עם רזולוציה טמפורלית מרחבית גבוהה. זה עשוי להיות שימושי להמחשת הפתוגנים של הפרעות נוירופסיכיאטריות המובילות להפרעות בפעילות העצבית.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של נוירונים, כמו גם בריאות באיברים אחרים. מי שידגים את ההליך יהיה Zhongtian Guo, דוקטורנט מהמעבדה שלנו. יום לאחר השתלת לוחית הראש יש לתת 1.32 מיליגרם לקילוגרם דקסמתזון נתרן פוספט תוך צפקי שעה לפני הניתוח כדי למנוע בצקת מוחית.

תחת סטריאוסקופ, בצע קרניוטומיה מעגלית בקוטר של כשני מילימטר באמצעות מקדחה דנטלית. כדי להפחית את הנזק המוחי, הפעל את מקדח השיניים בזהירות עם תנועה קלה מתמדת ולחץ קל כלפי מטה. הסר את שברי העצם מספר פעמים באמצעות מערכת יניקה.

לאחר הסרת שבר העצם, השתמש בנוזל עמוד שדרה מלאכותי או בתמיסת ACSF כדי להסיר ולשטוף את כל הפסולת שנותרה על פני המוח. חזור על הליך ניקוי זה מספר פעמים כדי לדכא תגובות דלקתיות. באמצעות מערכת הזרקת לחץ, הגדר את הלחץ המתאים להזרקת 500 ננוליטר של תמיסת AAV דרך נימי זכוכית בקוטר קצה של 10 עד 20 מיקרומטר למשך 10 דקות.

אם רמת תמיסת ה- AAV בנימי הזכוכית יורדת בהדרגה, תמיסת ה- AAV ניתנת למוח. השאירו את נימי הזכוכית במקומם למשך 10 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת. חזור על כך שלוש פעמים כדי לתת סך של 1.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV לתוך המוח.

החל אגרוז נמס נמוך 2% על פני המוח של S1 באמצעות micropipette, ולאחר מכן מניחים חלון זכוכית מעל craniotomy עם שתי כוסות כיסוי. לחץ את הכיסוי על האגרוז בעודו נוזלי. זה מונע היווצרות של בועות אוויר באגרוז.

אטמו את שולי חלון הגולגולת במלט שרף דבק דנטלי. כדי לכייל את מערכת הגירוי ההולוגרפי, מקם את פני השטח של שקופית פלואורסצנטית אדומה במישור הדגימה והגדר את המיקרוסקופ למצב הדמיה חיה עם אור עירור חלש. הפעל את ממשק המשתמש הגרפי של הכיול.

mfile, בדוק את חלונית הפרמטרים ולחץ על להציל לחצן. לחץ על לחצן Z Scan בחלונית שלב 1 אם הוא ייצור באופן אוטומטי שלושה כתמים אקראיים ב- 21 מישורי ציר שונים במרחק של שני מיקרומטרים מכל מישור. הזז את פס השקופיות ובדוק את התמונה החיה.

מצא את המישור המושלם שבו הכתמים מופיעים הקטנים והבהירים ביותר, ולאחר מכן לחץ על הלחצן שמור. פעולה זו תיצור באופן אוטומטי חזית גל כדורית של היסט עבור ההולוגרמה הדיגיטלית. לחץ על לחצן Go בחלונית שלב שני ולאחר מכן לחץ על שישה מקומות בריבוע הימני.

בדוק את התמונה החיה. אם יש שישה כתמים פלואורסצנטיים מובחנים, הקלד את ציר x ו- Y שלהם בתיבות העריכה ולחץ על הלחצן שמור. פעולה זו תיצור באופן אוטומטי מקדם טרנספורמציה עדין כדי לתאם את הכיול בין מערכת הגירוי ההולוגרפי למערכת ההדמיה.

לאחר מכן, לחץ על לחצן סרוק בחלונית שלב שלוש. היא תיצור 441 הולוגרמות דיגיטליות לביצוע סריקה נקודתית יחידה על פני שדה הראייה ב-21 על 21 צעדים. בדוק את התמונות בעת שינוי תבניות בתיבת הרשימה.

כוונן את עוצמת הלייזר לקבלת תמונות ספוט בטווח הדינמי של התקן ההדמיה. העבר את התקן ההדמיה למצב הקלטה ולחץ על לחצן הפעל. לאחר סיום ההפעלה, לחצו על 'צור מפת משקל' בחלונית 'שלב 4' ובחרו תמונה מוערמת.

לאחר מכן סגור את חלון ממשק המשתמש הגרפי של הכיול. הוא ייצור באופן אוטומטי מפת משקל כדי לפצות על העוצמה הלא מאוזנת בכל נקודה. הניחו את העכבר המוזרק AAV עם לוחית ראש מתחת למיקרוסקופ ובצעו הדמיה של שני פוטונים באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי ולייזר ספיר טיטניום נעול במצב מכוונן ל-920 ננומטר עם מטרה של פי 25.

פתח את תוכנת ההדמיה המסחרית במצב הדמיה חיה. התאם את המתח של גלאי התמונה ואת עוצמת לייזר ההדמיה כדי למטב את בהירות הנוירונים המבטאים GCaMP8f. צלם תמונות של תאי העצב המבטאים חלבון זה.

כדי להאיר את תאי העצב הספציפיים באמצעות תאורה הולוגרפית, הפעל את SLMcontrol. קובץ סקריפט M. לחצו על תמונת ההפניה ובחרו בתמונה שנרכשה.

לאחר מכן, לחץ על לחצן ספוט כדי לבחור פיקסלים ספציפיים על תאי העצב בתמונה ולחץ על הלחצן Enter במקלדת כדי לסיים אותו. כדי לזהות פעילות עצבית ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות חיישן תמונה, הגדר את זמן החשיפה, אזור ההדמיה והבינינג ולאחר מכן בצע את רכישת התמונה. לאחר הנחת העכבר מתחת למיקרוסקופ וביצוע הדמיה של שני פוטונים, פתח את תוכנת ההדמיה המסחרית.

במצב הדמיה חיה, התאם את המתח של גלאי התמונה ואת עוצמת לייזר ההדמיה כדי למטב את בהירות הנוירונים המבטאים GCaMP-6m-p2A-ChRmine. צלם תמונות של תאי העצב המבטאים חלבונים אלה ולאחר מכן האיר את תאי העצב הספציפיים בעקבות ההליך שהוצג קודם לכן. כדי לחקור את הקישוריות התפקודית בתוך שכבה שתיים ושלוש נוירונים, השתמשו במודולטור אור מרחבי כדי ליצור תבניות הולוגרפיות של גירוי אופטוגנטי ושלבו אותו עם דימות סידן של שני פוטונים.

הגדר את עוצמת לייזר ההדמיה ל- 920 ננומטר ב- 10 עד 20 מילי וואט ואת שדה הראייה ל- 256 מיקרומטר על 256 מיקרומטר שנמדד בעומק של 100 עד 150 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים על 1.5 מיקרו-שניות עבור שני הרץ או 100 ננו-שניות עבור 30 הרץ. השתמשו בשני הרץ וב-30 הרץ כקצב מסגרות הדמיה כדי לראות אם גירוי הולוגרפי יחיד גרם לתגובת סידן בנוירונים.

הגדר את עוצמת לייזר הגירוי ההולוגרפי המגרה נוירון יחיד ב- 10 מילי וואט, וזה מספיק כדי לגרום לפעילות עצבית. במקביל, דמיינו את תגובת הסידן ברזל ב-920 ננומטר עם 10 גירויים הולוגרפיים ב-1040 ננומטר ובמרווחים של שמונה שניות למשך זמן של 50 אלפיות השנייה לאחר פרק זמן בסיסי של 10 שניות. לאחר מכן, להחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלה.

התמונה המייצגת ועקבות של נוירונים המבטאים GCaMP8f בהדמיה של 100 הרץ עם גירוי הולוגרפי וחיישן תמונה מוצגים כאן. גרף זה מציג את התגובה העצבית לגירוי הולוגרפי בכל עוצמת לייזר. העקבות המייצגים של סידן 2+ במהלך גירוי הולוגרפי של 10 נוירונים שונים בשני הרץ ובקצב מסגרות הדמיה של 30 הרץ מוצגים כאן.

אותו צבע מציין את אותו תא עצב. תרשים סכמטי המעריך קשרים פונקציונליים בין נוירונים מתואר כאן. כאשר תא העצב הכתום מגורה, תאי העצב האדומים מגיבים באותו הזמן, מה שמצביע על כך שקיימת קישוריות תפקודית בין תאי העצב האלה.

תמונה טיפוסית של נוירוני קליפת המוח הסומטוסנסוריים הראשוניים המבטאים GCaMP6m בסוג פראי מוצגת כאן. תמונות גרפיות אלה מייצגות את עקבות סידן 2+ טיפוסי במהלך גירוי הולוגרפי בקצב פריימים של שני הרץ ו-30 הרץ. ניתן לזהות תגובה עצבית לגירוי הולוגרפי הן במהירויות הדמיה של שני הרץ והן במהירויות הדמיה של 30 הרץ.

צעדים אלה חשובים כדי להפחית את תנועת המוח ושניים, להשיג תוצאות יציבות. אנו מאמינים שהמיקרוסקופ הזה יכול לגרום להתנהגות בתאי עצב כתובים עם דפוסים ספציפיים. בעזרת טכניקה זו, אנו מסוגלים כעת להעריך ולתפעל את הפעילות של נוירון בודד ולאפיין נוירופסיכיאטריה בפירוט.