Name: פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים plug-and-display המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: חקור פיתוח פלטפורמת חיסון "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות להצגת אנטיגנים של SARS-CoV-2. שיטה זו משפרת תגובות חיסוניות ספציפיות באמצעות הנדסה ביולוגית מתקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המפתח של קרן מדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (לא. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ופרויקט הקרן הלאומית הסינית למדעי הטבע (מס' 31670936, 82041045).

1. בנייה פלסמידית
<ol><li>הכנס את רצף SpyCatcher המקודד DNA (קובץ משלים 1) לתוך פלסמיד pThioHisA-ClyA עמיד לאמפיצילין (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- Sal I כדי לבנות את הפלסמיד pThioHisA ClyA-SC בעקבות דו"חשפורסם בעבר 20.</li>
	<li>ליגייט את גן ההיתוך SpyTag-RBD-Histag המסונתז (קובץ משלים 1) לפלסמיד pcDNA3.1 (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- EcoR I כדי לבנות את הפלסמיד pcDNA3.1 RBD-ST בעקבות דו"חשפורסם בעבר 19.</li>
</ol>2. הכנת OMV-SC
<ol><li>בצע המרה של ClyA-SC בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>הוסיפו 5 μL של תמיסת פלסמיד pThioHisA ClyA-SC (50 ננוגרם/מיקרול) ל-50 מיקרוגרם של זן BL21 מוכשר, נשפו בעדינות והניחו להתקרר על קרח למשך 30 דקות.</li>
		<li>מניחים את התמיסה במשך 90 שניות באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מיד לשים את הפתרון המעורב על קרח במשך 3 דקות.</li>
		<li>הוסיפו 500 μL של מדיום LB לתרחיף החיידקי, ולאחר הערבוב, תרבית ב-220 סל"ד ב-37°C למשך שעה אחת.</li>
		<li>צלחת את כל הטרנספורמציה על צלחת אגר LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: בניסויים מאוחרים יותר, האמפיצילין נשמר באותו ריכוז בתווך. אם לא, זה עלול לגרום לאובדן פלסמידים בחיידקים.</li>
	</ol></li>
	<li>עבור ייצור OMV-SC, בצע את השלבים הבאים.<ol><li>לבודד מושבה בודדת מהצלחת (שלב 2.1.4.) עד 20 מ"ל של LB (עמיד לאמפיצילין) בינוני ותרבות לילה ב-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לחסן את התמיסה החיידקית (משלב 2.2.1.) למדיום 2 ליטר, תרבית ב 220 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות עד שלב הצמיחה הלוגריתמית (OD600nm הוא בין 0.6 ל 0.8).</li>
		<li>כאשר ה-OD ב-600 ננומטר של תמיסת החיידקים מגיע ל-0.6-0.8, הוסיפו איזופרופיל בטא-D-thiogalactopyranoside (IPTG, ראו טבלת חומרים) כדי שהריכוז הסופי של תמיסת החיידקים יהיה 0.5 mM, ולאחר מכן תרבית לילה ב-220 סל"ד ב-25 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע טיהור OMV-SC.<ol><li>צנטריפוגה של תמיסת החיידקים ב-7,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>סנן את הסופר-נטנט עם מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן רכז אותו באמצעות ממברנת אולטרה-סינון של 100 kD או עמודת סיבים חלולים (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>סנן את התרכיז דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, לאחר מכן צנטריפוגה ב-150,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), והשלך את הסופר-נטנט עם פיפטה.</li>
		<li>להשעות את המשקעים עם PBS ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. הפתרון יכול לשמור על יציבות לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת RBD-ST
<ol><li>בצע טרנספקציה של RBD-ST לפי השלבים הבאים.<ol><li>בחר מערכת ביטוי אאוקריוטית מתאימה (למשל, HEK293F) ותרבת את התאים במשך הלילה ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס לאחר ההתאוששות.</li>
		<li>הוסף 20 μL של תמיסת תאי HEK293F לתוך מונה התאים האוטומטי (ראה טבלת חומרים), תעד את מספר התאים, התאם את הריכוז ל-1 x 106 תאים למ"ל, ולאחר מכן תרבית את התאים ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.</li>
		<li>סנן פלסמיד RBD-ST דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, והוסף 300 מיקרוגרם של פלסמידים למדיום תרבית התא (ראה טבלת חומרים) עד שהנפח הסופי הוא 10 מ"ל; לנער במשך 10 שניות.</li>
		<li>יש לחמם PEI (1 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ל-65°C באמבט המים, לערבב 0.7 מ"ל של PEI עם 9.3 מ"ל של מדיום תרבית תאים, ולנער לסירוגין במשך 10 שניות. הערה: אין לנער את התמיסה במרץ. אחרת, הבועות המתקבלות עשויות להשפיע על יעילות הטרנספקציה.</li>
		<li>מוסיפים תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI, מנערים את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>מוסיפים את התערובת ל-280 מ"ל של תרבית תאים בינונית ותרבית ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע טיהור RBD-ST.<ol><li>צנטריפוגה של התאים ב 6,000 x גרם ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant.</li>
		<li>מלאו את העמודה ב-2 מ"ל של אגרוז Ni-NTA (ראו טבלת חומרים) ושטפו אותה פי 3 עם 3x PBS.</li>
		<li>הוסיפו אימידזול (ראו טבלת חומרים) לסופרנטנט של התא כדי להגיע לריכוז הסופי של 20 מ"מ, והעמיסו את הסופרנטנט של התא פי 2.</li>
		<li>הוסיפו 3 נפחי עמודות (CV) של PBS המכילים 20 מ"מ של אימידזול לכביסה, ואספו את חלק הכביסה.</li>
		<li>גרדיאנט אלוטה עם 3 CV של PBS המכיל ריכוזים נמוכים עד גבוהים (למשל, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) של imidazole; elute 2x עבור כל ריכוז.</li>
		<li>השתמש ב- SDS-PAGE21 כדי לזהות את RBD-ST במעברי ריכוז שונים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ביו-קונגציה וטיהור OMV-RBD
<ol><li>קבעו את ריכוז החלבון בשיטת BCA (ראו טבלת חומרים).<ol><li>לדלל באופן סדרתי את תמיסת חלבון ה-BSA הסטנדרטית מ-2 מ"ג/מ"ל ל-0.0625 מ"ג/מ"ל, לדלל את ה-OMV-SC המטוהר ואת RBD-ST 10x, ולאחר מכן לערבב פתרונות עבודה של BCA A ו-B (המסופקים בערכת הבדיקה) ביחס של 50:1 (v/v).</li>
		<li>מוסיפים תמיסת חלבון מדולל (25 μL/well) ומערבבים עם תמיסה עובדת BCA (200 μL/well); לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		<li>מדוד את הספיגה (OD) ב-562 ננומטר של כל באר וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית22.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע התאמה ביולוגית של OMV-SC ו- RBD-ST לפי השלבים הבאים.<ol><li>ערבב OMV-SC ו-RBD-ST ב-PBS ביחס של 40:1 (w/w).</li>
		<li>סובבו אנכית כדי למזג את התערובת למשך הלילה ב-15 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס. הערה: אנטיגנים שונים עשויים להגיב בפרופורציות שונות. אפשר לנסות יחסי תגובה שונים המבוססים על מאפייני האנטיגן.</li>
	</ol></li>
	<li>ודא את יעילות התגובה.<ol><li>הכן 10 μL של OMV-SC, RBD-ST ואת מוצר התגובה (שלב 4.2.). הוסף 2.5 μL של מאגר העמסה פי 5 (ראה טבלת חומרים), וחמם את הדגימות ב-100 °C למשך 5 דקות. יש להעמיס את הדגימות לתוך הג'ל (10 μL/well). בצע אלקטרופורזה ב 60 V במשך 20 דקות ולשנות את המצב ל 120 V במשך שעה אחת.</li>
		<li>מעבירים את החלבון מהג'ל לממברנות PVDF מערביות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 100 וולט למשך 70 דקות.</li>
		<li>הכניסו את הממברנה לאבקת חלב 5% ללא שומן/TBST ונערו במשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.</li>
		<li>הכניסו את הממברנה לנוגדן His-Tag/TBST של 0.1% (ראו טבלת חומרים) ונערו במשך שעה אחת, ולאחר מכן שטפו 3x עם TBST למשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.</li>
		<li>הכניסו את הממברנה לנוגדן IgG1 נגד עכברים (HRP)/TBST (ראו טבלת חומרים) ונערו במשך 40 דקות, ולאחר מכן שטפו 3 פעמים עם TBST למשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.</li>
		<li>מוסיפים תמיסת כימילומינסנציה משופרת (ראו טבלת חומרים) וחושפים את הממברנה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע טיהור של OMV-RBD.<ol><li>יש לדלל 1 מ"ל של תמיסת OMV-RBD מגיבה ל-10 מ"ל, ולבצע צנטריפוגה של דילול ב-150,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.</li>
		<li>השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant ולהשעות את השאריות עם 10 מ"ל של PBS. צנטריפוגה המתלים ב 150,000 x גרם ב 4 °C במשך 2 שעות.</li>
		<li>השליכו את הסופר-נטנט והשעו את השאריות עם 1 מ"ל של PBS. הערה: אם המסיסות של האנטיגן נמוכה בהרבה, ניתן להשיג את אותו אפקט הפרדה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל19.</li>
	</ol></li>
</ol>5. אפיון
<ol><li>בצע פיזור אור דינמי (DLS).<ol><li>דלל את הדגימות לריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל והוסף 1 מ"ל דגימה לתא הדגימה.</li>
		<li>בחר "גודל" עבור "סוג מדידה", "חלבון" עבור "חומר מדגם", "מים" עבור "פיזור", "25 °C" עבור "טמפרטורה", ולאחר מכן טען דגימות ומדוד באופן אוטומטי23.</li>
	</ol></li>
	<li>צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM).<ol><li>יש לדלל את הדגימות ל-100 מיקרוגרם/מ"ל. קח רשת נחושת של 200 רשת, הוסף לה 20 μL של דגימה, ואפשר לה להיספג במשך 10 דקות.</li>
		<li>השתמש בנייר סינון כדי לפתות את התמיסה, הוסף 20 μL של 3% אורניל אצטט לסרט התמיכה, והכתים במשך 30 שניות.</li>
		<li>יש לפות את האורניל אצטט ולייבש את הסרט באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך שעה.</li>
		<li>טען את הדגימות למערכת TEM (ראה טבלת חומרים) ולכוד תמונות ב- 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
<li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433(2020).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles%3A+From+discovery+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li>
<li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li>
<li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683(2019).</li>
<li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li>
<li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines%3A+A+new+toolkit+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314(2019).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li>
<li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li>
<li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+Biology%2C+and+Structure-Based+Therapeutics+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+%28ZF2001%29+against+COVID-19+in+adults%3A+Two+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+1+and+2+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD%2C+RBD%2C+and+S2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li>
<li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403(2021).</li>
<li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739(2021).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+%28RBD%29+and+heptad+repeat+%28HR%29+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li>
<li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimer-PAGE%3A+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341(2017).</li>
<li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001(2021).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%3A+Design%2C+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li>
<li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li>
<li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li>
<li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li>
<li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li>
<li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890(2020).</li>
<li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li>
<li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כדי ליצור פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "Plug-and-Display", ClyA שהתמזגה ב-SC באה לידי ביטוי בזני BL21(DE3), שהוא אחד המודלים הנפוצים ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים בגלל יתרונותיו בביטוי חלבונים24, כך שיהיה מספיק מקטע SC המוצג על פני השטח של ה-OMVs במהלך תהליך התפשטות החיידקים. במקביל, אנטיגן מטרה שהתמזג ST הוכן לצימוד הכימי בין האנטיגנים ל- OMVs. היתרונות של תוכנית ניסיונית זו וסיכויי היישום העתידיים משתקפים בעיקר בשלושה היבטים. ראשית, מערכת "Plug-and-Display" של אנטיגנים שונים וננו-חלקיקים ביולו...

כפלטפורמת חיסון פוטנציאלית, שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) משכו יותר ויותר תשומת לב בשנים האחרונות 1,2. OMVs, המופרשים באופן טבעי בעיקר על ידי חיידקים גראם שליליים3, הם חלקיקים ננומטריים כדוריים המורכבים מדו-שכבת שומנים, בדרך כלל בגודל של 20-300 ננומטר4. OMVs מכילים רכיבים שונים של חיידקי הורים, כולל אנטיגנים חיידקיים ותבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs), המשמשים כפוטנציאטורים חיסוניים מוצקים5. הודות למרכיביהם הייחודיים, מבנה השלפוחית הטבעי ואתרי שינוי נהדרים בהנדסה גנטית, OMVs פותחו לשימוש בתחומים ביו-רפואיים רבים, כולל חיסונים חיידקיים6, אדג'ובנטים7, תרופות אימונותרפיות לסרטן8, וקטורים למתן תרופות9 ודבקים אנטי-בקטריאליים10.
מגיפת SARS-CoV-2, שהתפשטה ברחבי העולם מאז 2020, גבתה מחיר כבד מהחברה העולמית. תחום קשירת הקולטן (RBD) בחלבון ספייק (חלבון S) יכול להיקשר עם אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (ACE2), אשר לאחר מכן מתווך את כניסת הנגיף לתא11,12,13. לפיכך, נראה כי RBD הוא יעד עיקרי לגילוי חיסונים14,15,16. עם זאת, RBD מונומרי הוא אימונוגני גרוע, והמשקל המולקולרי הקטן שלו מקשה על מערכת החיסון לזהות, ולכן אדג'ובנטים נדרשים לעתים קרובות17.
על מנת להגביר את האימונוגניות של RBD, נבנו OMVs המציגים RBDs רב-ערכיים. מחקרים קיימים המשתמשים ב-OMV להצגת RBD בדרך כלל ממזגים RBD עם OMV כדי להתבטא בחיידקים18. עם זאת, RBD הוא חלבון שמקורו בנגיף, וביטוי פרוקריוטי עשוי להשפיע על פעילותו. כדי לפתור בעיה זו, נעשה שימוש במערכת SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), הנגזרת מ-Streptococcus pyogenes, ליצירת איזופפטיד קוולנטי עם OMV ו-RBD במערכת חיץ קונבנציונלית19. תחום ה-SC בא לידי ביטוי עם ציטוליזין A (ClyA) כחלבון היתוך על ידי קולי Escherichia מהונדס ביולוגית, ו-ST התבטא עם RBD באמצעות מערכת הביטוי התאית HEK293F. OMV-SC ו- RBD-ST היו מעורבים ודוגרו בן לילה. לאחר טיהור על ידי ultracentrifugation או כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC), OMV-RBD התקבל.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin נתרן</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA ערכת כימות חלבון</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc מערכת הדמיה נוגעת</td><td>ביו-ראד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אור דנאמי פיזור Malvern</td><td></td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>מנגנון אלקטרופורזה</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST Buffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>עז pAb לעכבר IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה הקפאה במהירות גבוהה</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag עכבר mAb</td><td>Cell איתות טכנולוגיה</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>איזופרופיל בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב ללא שומן</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 מדיום תרבית תאים</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST פלסמיד</td><td>ווהאן genecreat טכנולוגיה</td><td></td><td></td>ביולוגית</tr><tr><td>מאגר פוספט מלח</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין ליניארי</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>סולם חלבון צבוע מראש</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC פלסמיד</td><td>ווהאן genecreat טכנולוגיה ביולוגית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF הממברנות המערביות</td><td>רוש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>03010040001 Quixstand מערכות שולחניות (עמוד סיבים חלולים 100 kD)</td> מאגר טעינה <td>SDS-PAGE של GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (פתרון כימילומינסנציה משופר)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מתלה</td><td>Life</td><td>Technology Hula מיקסר</td><td></td></tr><tr><td>שידור מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>היטאצ'י</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר אולטרה סגול</td><td>היטאצ'י</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן sars-cov-2

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

ננו-חלקיקים ביומימטיים המתקבלים מחיידקים או מווירוסים משכו עניין רב במחקר ובפיתוח חיסונים. שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) מופרשות בעיקר על ידי חיידקים גראם-שליליים במהלך גדילה ממוצעת, עם קוטר בגודל ננומטרי ופעילות אדג'ובנטית עצמית, שעשויה להיות אידיאלית להעברת חיסונים. OMVs תפקדו כמערכת אספקה רבת פנים לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות. כדי לנצל את מלוא המאפיינים הביולוגיים של OMVs, נעשה שימוש ב-OMVs שמקורם ב-Escherichia coli שעברו הנדסה ביולוגית כנשא ותחום קשירת קולטן SARS-CoV-2 (RBD) כאנטיגן לבניית פלטפורמת חיסון "הכנס-והצג". תחומי SpyCatcher (SC) ו- SpyTag (ST) בסטרפטוקוקוס פיוגנס יושמו כדי להצמיד OMVs ו- RBD. הגן Cytolysin A (ClyA) תורגם עם הגן SC כחלבון היתוך לאחר טרנספקציה פלסמידית, והשאיר אתר תגובתי על פני השטח של OMVs. לאחר ערבוב RBD-ST במערכת חיץ קונבנציונלית בן לילה, נוצר קשירה קוולנטית בין OMVs ו- RBD. כך הושג חיסון OMV רב-ערכי. על ידי החלפה באנטיגנים מגוונים, פלטפורמת החיסון OMVs יכולה להציג ביעילות מגוון אנטיגנים הטרוגניים, ובכך למנוע במהירות מגיפות של מחלות זיהומיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מדויקת לבניית פלטפורמת החיסון OMV, כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. פרוטוקול זה יכול להיות גישה כללית לשימוש ב-OMVs כפלטפורמת חיסונים; צריך רק לבחור את מערכות הביטוי המתאימות על סמך סוג האנטיגנים.
איור 2 מספק סכימת תכנון פלסמידית אפשרית. הגן SC מחובר לגן ClyA באמצעות מקשר גמיש, בעוד ST מתחבר למסוף 5' של הגן RBD עם גן תג שלו לטיהור ואימות. כתם מערבי הראה שהתגובה מסתיימת בהדרגה עם עלייה ב-OMV-SC (איור 3A). לאחר האולטרה-צנטריפוגציה, ...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

ננו-מדע יכול לשפר ביעילות את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן לאחר הצגת אנטיגנים על פני השטח היתרון העיקרי בפלטפורמת חיסון זו יכול להשיג את הפלאק והתצוגה. במילים אחרות, הפלטפורמה מסוגלת להציג את מגוון האנטיגנים בשיטה זו ניתן ליישם גם על ננו-חלקיקים ביולוגיים אחרים כדי להציג מנוע לנשאים בגודל ננו. כדי לבצע ציטוליזין טרנספורמציה של צנתר ריגול, התחל עם הוספת חמישה מיקרוליטרים של תמיסת פלזמה ל -50 מיקרוליטרים של זן BL 21 מוכשר.נושפים בעדינות ומניחים להתקרר על הקרח במשך 30 דקות. מניחים את הפתרון במשך 90 שניות באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מיד לשים את הפתרון המעורב על קרח במשך שלוש דקות. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום לוריא ברטני לתרחיף החיידקים ולאחר ערבוב תרבית ב-220 סיבובים לדקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר מכן, צלחת את כל צלחת אגר לוריא ברטני המכילה אמפיצילין ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס. עבור ייצור לוכד ריגול OMV, התחל על ידי בידוד מושבה אחת מהצלחת ל 20 מיליליטר של לוריא ברטני בינוני ותרבות לילה ב 220 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס. לדגום את תמיסת החיידקים למדיום של שני ליטרים ולתרבית ב-220 סיבובים לדקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות עד שמגיעים לשלב הגדילה הלוגריתמי.הוסיפו איזופרופיל בטא D-IPTG כדי שהריכוז הסופי של תמיסת החיידקים יהיה 0.5 מילימולאר ולאחר מכן תרבית בן לילה ב-220 סיבובים לדקה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע טיהור לוכד ריגול OMV. התחל עם התמזגות צנטרית של תמיסת החיידקים.סנן את הסופרנטנט עם מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן רכז אותו באמצעות עמודת סיבים חלולה. לסנן את התרכיז דרך מסנן קרום 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן צנטרי למזג אותו ב 150, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמצעות נתיך אולטרה צנטרי, ולהשליך את supernatant עם פיפטה. להשעות מחדש את המשקעים עם PBS, ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לבצע טרנספקציה של תג ריגול RBD, התחל בבחירת מערכת ביטוי אאוקריוטית מתאימה ותרבת את התאים בן לילה ב 130 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס לאחר ההתאוששות. הוסף 20 מיקרוליטרים HEK 293F של תמיסת תאים לתוך מונה התא האוטומטי. רשום את מספר התאים, התאם את הריכוז לפעם אחת 10 לששת התאים למיליליטר.ואז תרבית את התאים ב 130 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. סנן פלסמיד תג ריגול RBD דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר והוסף 300 מיקרוגרם של פלסמידים למדיום תרבית התא עד שהנפח הסופי הוא 10 מיליליטר. יש לנער במשך 10 שניות.מחממים PEI ל-65 מעלות צלזיוס באמבט המים. יש לערבב 0.7 מיליליטר PEI עם 9.3 מיליליטר של תרבית תאים, ולנער לסירוגין במשך 10 שניות. הוסף תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI.מנערים את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות, ודוגרים אותה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מוסיפים את התערובת ל-280 מיליליטר של תרבית תאים, ואת התרבית ב-130 סיבובים לדקה ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. לאחר מכן, בצע טיהור תג ריגול RBD.התחל עם התמזגות צנטרית של התאים ב 6, 000 פעמים G ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant. ממלאים את העמודה בשני מיליליטר ניקל NTA agarose ולשטוף אותו שלוש פעמים עם PBS. הוסיפו אימידזול לסופרנאטנט של התא כדי ליצור את הריכוז הסופי של 20 מילימולר, והעמיסו את הסופרנטנט של התא.הוסיפו שלושה נפחי עמודה של PBS המכילים 20 מילימולאר של אימידזול לשטיפה, ואספו את חלק הכביסה. אלוטה הדרגתית עם שלושה נפחי עמודה של PBS המכילים ריכוזים נמוכים עד גבוהים של אימידזול אלוטה פעמיים עבור כל ריכוז. כדי לקבוע את ריכוז החלבון בשיטת BCA, דילל באופן סדרתי את תמיסת החלבון BSA הסטנדרטית משניים ל-0.0625 מיליגרם למיליליטר, דילל את לוכד הריגול OMV המטוהר ואת תג הריגול RBD 10 פעמים.לאחר מכן ערבבו פתרונות עבודה של BCA A ו- B ביחס של 50 לאחד. הוסיפו תמיסת חלבון מדולל וערבבו עם תמיסת BCA עובדת. דגירה ב 37 מעלות במשך 30 דקות.מדוד את הספיגה ב-562 ננומטר של כל באר, וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית. כדי לבצע התאמה ביולוגית של לוכד ריגול OMV ותג ריגול RBD, ערבבו את לוכד הריגול OMV ואת תג הריגול RBD ו- PBS ביחס של 40 לאחד. סובבו אנכית כדי למזג את התערובת למשך הלילה בקצב של 15 סיבובים לדקה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בצע טיהור של OMV RBD באמצעות פתרון PBS באמצעות הליך דומה לטיהור לוכד ריגול OMV. סכמת תכנון הפלזמה מראה כי הגן spycatcher מחובר לגן cly A באמצעות מקשר גמיש בעוד שתג הריגול מתחבר לחמשת הטרמינלים העיקריים של הגן RBD עם גן תג hys לטיהור ואימות. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, כמעט כל תג הריגול RBD שלא הגיב נשאר בסופר-נטנט.האולטרה-צנטריפוגציה השנייה לא סיפקה יתרון משמעותי נוסף בפעם הראשונה. הקוטר ההידרודינמי הממוצע של לוכד המרגלים OMV היה 133 ננומטר ואילו 152.6 ננומטר עבור OMV-RBD. הבדלים אלה עשויים להיות בגלל RBD מגדיל את גודל חלקיקי OMV לאחר תצוגה אינטנסיבית.התוצאות של TEM עולות בקנה אחד עם התפלגות גודל החלקיקים המתקבלת מתוצאות DLS. סיבוב למיזוג התערובת חשוב מאוד. יעילות התגובה יכולה להיות נמוכה בהרבה ללא סיבוב.

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מתאר הליך כללית לחקר קולטן מחייבים תחום רקומביננטי (RBD) מבוססי למקטע חיסונים נגד מחלת הסארס. היא כוללת שיטות transfection וביטוי של חלבונים בתאים מזוכך 293T, חיסון של עכברים עם RBD וזיהוי פעילות נטרול של העכבר סרה באמצעות נטרול הסארס הוקמה assay pseudovirus.

פרוטוקול רקומביננטי מזוכך מבוססי חיסונים הסארס: הכנת חלבון, חיסון בעלי חיים איתור נטרול

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת חיסונים רב-ערכיים נגד שלפוחית הממברנה החיצונית (OMV). תאי יונקים עוברים טרנספורמציה כדי לבטא ולהפריש אנטיגנים נגיפיים המאוחים ל-SpyTag ולתג פוליהיסטידין. אנטיגנים אלה מטוהרים לאחר מכן באמצעות עמודת זיקה של חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA). האנטיגן המטוהר מעורבב עם בועיות קרום חיצוניות המבטאות חלבון SpyCatcher (SC) הקשור למשטח. אנטיגנים מרובים נצמדים באופן קוולנטי ל- SpyCatchers באמצעות SpyTags שלהם (ST), ויוצרים OMVs המציגים את האנטיגן, ומשמשים כחיסון רב-ערכי.

יצירת חיסון רב-ערכי נגד שלפוחית הממברנה החיצונית

שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר חלקיקים pseudotyped באווירה BSL-2 שילוב החלבון ספייק של וירוסים פתוגני במזרח התיכון תסמונת נשימתית, מעוררת סארס. החלקיקים pseudotyped מכילים גנים כתב לוציפראז המאפשר כימות של וירוס הערך לתוך התאים מארח היעד.

הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.

הדמיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה של מטרימי ספייק SARS-CoV-2 מצומדים קוונטיים למעקב אחר כריכה ואנדוציטוזיס בתאי HEK293T

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

כאן, אנו מתארים בדיקה חיסונית פלואורסצנטית מרובת מרבבים שפותחה לאחרונה המשתמשת במערכת ציטומטרית זרימה דו-מדווחת כדי לזהות בו זמנית שני אפיטופים ייחודיים של חלבון ספייק על חלקיקים נגיפיים שלמים של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) שנלכדו על ידי מיקרוספרות מגנטיות מצומדות אנזים 2-2 הממירות אנגיוטנסין.

יצירת פרופיל של אפיטופים של חלבון פני השטח על חלקיקים נגיפיים על ידי אסטרטגיית Multiplex Dual-Reporter

אנו מציגים פרוטוקול מבחנה אופטימלי לייצור חלקיקים דמויי נגיף SARS-CoV-2 המחקים באופן הדוק את הנגיף האותנטי. גישה זו מאפשרת לחקור מנגנוני זיהום, הרכבה ויציאה של זיהום נגיפי ללא האילוצים של דרישת מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 3.

ייצור מערכת חלקיקים דמוית נגיף SARS-CoV-2 לחקירת מחזורי חיים נגיפיים במבחנה

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה ליצירת חלקיקים מדומים מסוג SARS-CoV-2 באמצעות מערכת מדווח לוסיפראז ואת השימוש בה לזיהוי מעכבי כניסה. פרוטוקולים אלו מודגים באמצעות שני מעכבי כניסה שונים: חלבון מיזוג ACE2-Fc האנושי רקומביננטי והתרכובת המולקולית הקטנה ארבידול.

נהלים לזיהוי מעכבי כניסה ל-SARS-CoV-2 כאנטי-ויראליים פוטנציאליים באמצעות פסאודו-וירוסים מבוססי MLV

חקור פיתוח פלטפורמת חיסון "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות להצגת אנטיגנים של SARS-CoV-2. שיטה זו משפרת תגובות חיסוניות ספציפיות באמצעות הנדסה ביולוגית מתקדמת.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

גלה סרטונים נוספים