פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

ננו-מדע יכול לשפר ביעילות את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן לאחר הצגת אנטיגנים על פני השטח היתרון העיקרי בפלטפורמת חיסון זו יכול להשיג את הפלאק והתצוגה. במילים אחרות, הפלטפורמה מסוגלת להציג את מגוון האנטיגנים בשיטה זו ניתן ליישם גם על ננו-חלקיקים ביולוגיים אחרים כדי להציג מנוע לנשאים בגודל ננו. כדי לבצע ציטוליזין טרנספורמציה של צנתר ריגול, התחל עם הוספת חמישה מיקרוליטרים של תמיסת פלזמה ל -50 מיקרוליטרים של זן BL 21 מוכשר.

נושפים בעדינות ומניחים להתקרר על הקרח במשך 30 דקות. מניחים את הפתרון במשך 90 שניות באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מיד לשים את הפתרון המעורב על קרח במשך שלוש דקות. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום לוריא ברטני לתרחיף החיידקים ולאחר ערבוב תרבית ב-220 סיבובים לדקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, צלחת את כל צלחת אגר לוריא ברטני המכילה אמפיצילין ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס. עבור ייצור לוכד ריגול OMV, התחל על ידי בידוד מושבה אחת מהצלחת ל 20 מיליליטר של לוריא ברטני בינוני ותרבות לילה ב 220 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס. לדגום את תמיסת החיידקים למדיום של שני ליטרים ולתרבית ב-220 סיבובים לדקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות עד שמגיעים לשלב הגדילה הלוגריתמי.

הוסיפו איזופרופיל בטא D-IPTG כדי שהריכוז הסופי של תמיסת החיידקים יהיה 0.5 מילימולאר ולאחר מכן תרבית בן לילה ב-220 סיבובים לדקה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע טיהור לוכד ריגול OMV. התחל עם התמזגות צנטרית של תמיסת החיידקים.

סנן את הסופרנטנט עם מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן רכז אותו באמצעות עמודת סיבים חלולה. לסנן את התרכיז דרך מסנן קרום 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן צנטרי למזג אותו ב 150, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמצעות נתיך אולטרה צנטרי, ולהשליך את supernatant עם פיפטה. להשעות מחדש את המשקעים עם PBS, ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע טרנספקציה של תג ריגול RBD, התחל בבחירת מערכת ביטוי אאוקריוטית מתאימה ותרבת את התאים בן לילה ב 130 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס לאחר ההתאוששות. הוסף 20 מיקרוליטרים HEK 293F של תמיסת תאים לתוך מונה התא האוטומטי. רשום את מספר התאים, התאם את הריכוז לפעם אחת 10 לששת התאים למיליליטר.

ואז תרבית את התאים ב 130 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. סנן פלסמיד תג ריגול RBD דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר והוסף 300 מיקרוגרם של פלסמידים למדיום תרבית התא עד שהנפח הסופי הוא 10 מיליליטר. יש לנער במשך 10 שניות.

מחממים PEI ל-65 מעלות צלזיוס באמבט המים. יש לערבב 0.7 מיליליטר PEI עם 9.3 מיליליטר של תרבית תאים, ולנער לסירוגין במשך 10 שניות. הוסף תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI.

מנערים את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות, ודוגרים אותה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מוסיפים את התערובת ל-280 מיליליטר של תרבית תאים, ואת התרבית ב-130 סיבובים לדקה ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. לאחר מכן, בצע טיהור תג ריגול RBD.

התחל עם התמזגות צנטרית של התאים ב 6, 000 פעמים G ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant. ממלאים את העמודה בשני מיליליטר ניקל NTA agarose ולשטוף אותו שלוש פעמים עם PBS. הוסיפו אימידזול לסופרנאטנט של התא כדי ליצור את הריכוז הסופי של 20 מילימולר, והעמיסו את הסופרנטנט של התא.

הוסיפו שלושה נפחי עמודה של PBS המכילים 20 מילימולאר של אימידזול לשטיפה, ואספו את חלק הכביסה. אלוטה הדרגתית עם שלושה נפחי עמודה של PBS המכילים ריכוזים נמוכים עד גבוהים של אימידזול אלוטה פעמיים עבור כל ריכוז. כדי לקבוע את ריכוז החלבון בשיטת BCA, דילל באופן סדרתי את תמיסת החלבון BSA הסטנדרטית משניים ל-0.0625 מיליגרם למיליליטר, דילל את לוכד הריגול OMV המטוהר ואת תג הריגול RBD 10 פעמים.

לאחר מכן ערבבו פתרונות עבודה של BCA A ו- B ביחס של 50 לאחד. הוסיפו תמיסת חלבון מדולל וערבבו עם תמיסת BCA עובדת. דגירה ב 37 מעלות במשך 30 דקות.

מדוד את הספיגה ב-562 ננומטר של כל באר, וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית. כדי לבצע התאמה ביולוגית של לוכד ריגול OMV ותג ריגול RBD, ערבבו את לוכד הריגול OMV ואת תג הריגול RBD ו- PBS ביחס של 40 לאחד. סובבו אנכית כדי למזג את התערובת למשך הלילה בקצב של 15 סיבובים לדקה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בצע טיהור של OMV RBD באמצעות פתרון PBS באמצעות הליך דומה לטיהור לוכד ריגול OMV. סכמת תכנון הפלזמה מראה כי הגן spycatcher מחובר לגן cly A באמצעות מקשר גמיש בעוד שתג הריגול מתחבר לחמשת הטרמינלים העיקריים של הגן RBD עם גן תג hys לטיהור ואימות. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, כמעט כל תג הריגול RBD שלא הגיב נשאר בסופר-נטנט.

האולטרה-צנטריפוגציה השנייה לא סיפקה יתרון משמעותי נוסף בפעם הראשונה. הקוטר ההידרודינמי הממוצע של לוכד המרגלים OMV היה 133 ננומטר ואילו 152.6 ננומטר עבור OMV-RBD. הבדלים אלה עשויים להיות בגלל RBD מגדיל את גודל חלקיקי OMV לאחר תצוגה אינטנסיבית.

התוצאות של TEM עולות בקנה אחד עם התפלגות גודל החלקיקים המתקבלת מתוצאות DLS. סיבוב למיזוג התערובת חשוב מאוד. יעילות התגובה יכולה להיות נמוכה בהרבה ללא סיבוב.