מדידת הדחיסות של תאים וגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי

מכניקת התאים ממלאת תפקיד חשוב בגרורות סרטניות, טרנספורמציה ממאירה של תאים, ורגישות רדיו. השיטה האקוסטופלואידית יכולה לממש מדידה מהירה ולא הרסנית במצבים מושהים. טכניקה זו יכולה לשמש לשיקוף השינוי של דחיסות עצמית במהלך אפיתל למעבר מזנכימלי והפרדת תאי גידול במחזור, מראה את סיכויי היישום שלה באבחון סרטן.

כדי להתחיל, קשר את בלוק PDMS לשבב על ידי ניקוב חורים בבלוק PDMS עבור יציאות כניסה ויציאה עם מחט חלולה בקוטר מילימטר אחד. ואז לשים את בלוקים PDMS שבב עם הישבן למעלה במנקה פלזמה במשך דקה אחת. לאחר יישור החורים בגושי PDMS עם כניסת השבב ושקעו, לחץ בעדינות על בלוקי PDMS לשבב למשך 15 שניות, וכתוצאה מכך תתרחש הצמדה בין בלוקי PDMS לבין פני השטח של השבב.

כדי לחבר את קטטר PTFE לשבב, חותכים שתי חתיכות קטטר בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר ובאורך של 10 סנטימטר. כופפו מחט נירוסטה בקוטר פנימי של 0.7 מילימטר ובאורך של 1.5 ס"מ על 90 מעלות לצורת L וחברו אותה לקצה אחד של הקטטר. הכנס את מחטי הנירוסטה לחורים של בלוקי PDMS.

עבור הכניסה, חבר מחט חלוקה של 19 מד לקצה השני של הקטטר כמחבר למזרק. לאחר מכן, הזריקו מים שעברו דה-יוניזציה כדי לבדוק את ההידוק של הערוץ הכולל. עבור הרכבה קרמית פיאזואלקטרית, בחר יריעות קרמיקה פיאזואלקטריות חתוכות מראש ברוחב של חמישה מילימטרים.

לאחר מכן לרתך חוטים משני הצדדים של קרמיקה piezoelectric בקצה אחד. הדביקו את הקרמיקה הפיאזואלקטרית לאמצע החלק האחורי של השבב על ידי הנחת טיפה של דבק ציאנואקרילט על הקרמיקה הפיאזואלקטרית. מחליקים את הדבק עם הקיסם ומסירים את עודפי הדבק.

לאחר מכן לחץ במהירות על השבב והמשיך ללחוץ במשך כדקה. כדי להרכיב את התקן המיקרו, חתכו חתיכת PDMS כבסיס של התקן המיקרו והדביקו צד אחד של הבסיס לכניסה וליציאת גושי PDMS ואת הצד השני לשקופית זכוכית שקופה באמצעות סרט דו-צדדי. תקן את כל המיקרו-מכשיר לשלב המיקרוסקופ כדי לשמור את השבב במישור מוקד אחד.

כדי להכין את תמיסות החלקיקים הסטנדרטיות של פוליסטירן הוסף 0.05 מיליליטר של תמיסת חלקיקי פוליסטירן ל -10 מיליליטר של PBS וערבב היטב. לאחר מכן הכינו את מתלי התאים על ידי שטיפת התאים הדבקים במפגש של 90% עם PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.25 טריפסין למשך דקה עד שתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת טריפסין, להוסיף מיליליטר אחד בינוני שלם וליצור השעיה התא על ידי פיפטינג. הבא צנטריפוגה מתלה התא ב 100 G במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuse ב 0.5 עד מיליליטר אחד של PBS על מנת לקבל השעיה התא.

אז תאים נספרו עם hemocytometer ואת הריכוז היה כ 300 עד 500, 000 תאים למיליליטר. לאחר הכנת תרחיף גרעין התא כפי שהוכח קודם לכן, הסר את הסופרנטנט והוסף 200 מיקרוליטרים של מגיב מיצוי חלבון ציטופלסמי A לכל לוח תאים של 20 מיקרוליטר וערבב היטב. ואז מערבבים את התערובת הנ"ל ב 220 גרם במשך חמש שניות ומניחים על אמבט קרח במשך 10 דקות.

לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של מיצוי חלבון cytoplasmic מגיב B לפתרון לאחר הדגירה. לאחר המערבולת, מניחים על אמבט קרח למשך דקה אחת ומערבבים שוב ב-220 גרם למשך חמש שניות. ואז, לבסוף צנטריפוגה ב 1000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant ו resuse את לוח הצבעים במיליליטר אחד של PBS. ואז צנטריפוגה ב 1000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות. לאחר הסרת הסופר-נטנט, יש להפסיק את השימוש ב-100 מיקרוליטרים של PBS כהשעיית גרעין התא.

הוסיפו טריפן כחול לתרחיף גרעין התא הנ"ל והכתימו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן, לספור את מספר הגרעינים תחת מיקרוסקופ הפוך עם מטרה 10x. לדלל את ההשעיה של גרעין התא הנ"ל עם חיץ PBS לריכוז של 200 עד 300, 000 גרעין למיליליטר.

לאחר מכן לסנן את תרחיף גרעין התא דרך מסננת של 70 מיקרומטר. כדי להגדיר את מערכת המדידה, הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ ופתח את תוכנת המצלמה. השתמש במטרה 4x כדי למצוא את המיקום האמצעי של המיקרו-ערוץ, כלומר, את המיקום של קרמיקה piezoelectric.

לאחר חיבור החוטים, לרתך אותם למסופים החיוביים והשליליים של פלט מחולל האותות של הקרמיקה הפיאזואלקטרית בהתאמה. לאחר מכן מניחים את המזרק על משאבת המיקרו הזרקה ומחברים אותו לקטטר הכניסה. כדי לאסוף את הנוזל מהמיקרו-ערוץ, הניחו מיכל קטן בקצה קטטר היציאה.

כדי לקבוע את פרמטרי המדידה, שאף את תמיסת חלקיקי הפוליסטירן עם המזרק. לאחר מכן הזריקו את התמיסה למיקרו-ערוץ השבב תוך הימנעות מבועות אוויר ובמיקרו-ערוץ שבב כדי להבטיח מדידה מדויקת. הגדר את הפלט של מחולל האותות לאות סימן עם תדר של מגה-הרץ אחד ומתח שיא לשיא של 10 וולט עד שנצפה כי החלקיקים נעים לעבר קו האמצע של המיקרו-ערוץ ונשארים בתנועה קדימה לאורך קו האמצע לאחר שהגיעו לקו האמצע.

לאחר ערבוב תא מיליליטר אחד או תרחיף גרעין עם תמיסת החלקיקים הסטנדרטית ביחס של אחד לאחד, להזריק אותו לתוך microchannel עם מזרק כדי למדוד תאים וגרעינים. התחל להקליט עם מצלמת CCD כאשר התאים או הגרעינים נכנסים לשדה הראייה ומפעילים את מחולל האותות. לאחר מכן יש לשטוף את המיקרו-ערוץ במים שעברו דה-יוניזציה, 75% אלכוהול ומים שעברו דה-יוניזציה ברצף לשימוש מאוחר יותר.

תנועת התאים והחלקיקים נצפתה תחת פעולת כוח השדה האקוסטי לעבר קו האמצע של המיקרו-ערוץ במרווחי זמן שונים. בוצע חישוב האנרגיה, הצפיפות ודחיסות התא וצפיפות האנרגיה האקוסטית ומסלול התנועה הנמדד של החלקיק התקבלו מהתוצאה המתאימה ביותר. הגרעינים בעלי הטוהר הגבוה והשלמות בודדו מתאים ומדידת דחיסות הגרעין הושגה על ידי קבלת מסלול התנועה של הגרעין.

הדחיסות של סוגים שונים של תאים ותאים סרטניים לאחר EMT המושרה על ידי תרופות או קרינת רנטגן עם מינונים שונים נמדדה והושוותה. התאים שנמדדו נאספו ונמצא כי לא היה הבדל משמעותי בשגשוג התאים ובכדאיות שלהם בהשוואה לקבוצה שלא טופלה לאחר 48 שעות של תרבית. מה שמעיד על כך שלמדידת הדחיסות אין השפעה על שגשוג התאים והישרדותם.

הדבר החשוב ביותר הוא לכוונן את תדר האות עד שיבחינו בכך שחלקיקים נעים לעבר קו האמצע של המיקרו-ערוץ.