Name: סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למד סינתזת חלבונים נטולת תאים באמצעות תבניות DNA ליניאריות מתמציות E. coli חסרות אקסונוקלאז. שיטה זו מייעלת תהליכי ביטוי גנים ומאיצה פיתוח אב טיפוס במערכות ביולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ACB ו-JLF מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF ו-JB מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA ו-JLF מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB מאשרת תמיכה מה-ERC החל מ-"COMPUCELL" (מספר מענק 657579). המרכז לביוכימי סטרוקטורלה (Centre de Biochimie Structurale) מכיר בתמיכת התשתית הצרפתית לביולוגיה מבנית משולבת (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). ח"כ מודה על תמיכה במימון ממחלקת MICA של INRAe, אוניברסיטת פריז-סקלי, DIM-RFSI של אזור איל-דה-פראנס (IdF) ו-ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). עבודה זו נתמכה על ידי מימון באמצעות פרס המאגד של מועצת המחקר האירופית (865973 ל-CLB).

<ol><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).</li>
<li>McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+use+of+linear+DNA+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective use of linear DNA in cell-free expression systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).</li>
<li>Schinn, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+directly+from+PCR%3A+progress+and+applications+of+cell-free+protein+synthesis+with+linear+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA.</a> New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).</li>
<li>Prell, A., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+linear+and+circular+DNA+with+gaps+by+the+recBC+enzyme+of+Escherichia+coli.+Effects+of+gap+length+and+the+presence+of+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts.</a> European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+containing+%CF%87+sites+enhances+DNA+stability+and+gene+expression+in+E.+coli+cell-free+transcription-translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).</li>
<li>Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+linear+DNA+templates+in+cell-free+expression+systems+from+diverse+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
<li>Zhu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell-free+gene+expression+yields+from+linear+templates+in+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens+extracts+by+using+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).</li>
<li>Batista, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+optimized+cell-free+buffer+enables+robust+expression+from+unprotected+linear+DNA+in+exonuclease-deficient+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> JoVE. (144), e58882(2019).</li>
<li>Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+Coli-based+cell-free+protein+expression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
</ol>

כאן אנו מראים כי ליזאט תאים שהוכן מ- E. coli BL21 Rosetta2 עם נוקאאוט גנומי עבור אופרון recB או recBCD תומך בביטוי חלבון גבוה מתבניות DNA ליניאריות. פרוטוקול זה מפרט הליך כיול ליזאט שלב אחר שלב הספציפי לתבניות דנ"א ליניאריות (איור 2), שהוא שלב קריטי שמוביל לביטוי גבוה של מקדמי σ70 בדנ"א ליניארי, ומגיע לרמות כמעט פלסמיד עבור ריכוזי דנ"א שווים. פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של כיול המאגר בהתאם לסוג הדנ"א (ליניארי או פלסמיד) שישמש ביישום הסופי.
<p class="jove_conte...

מערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) משמשות יותר ויותר כשיטה מהירה, פשוטה ויעילה להנדסת ביו-סנסורים, ייצור מבוזר ויצירת אב-טיפוס של מעגלים גנטיים1. בשל הפוטנציאל הגדול שלהם, מערכות CFPS משמשים באופן קבוע בתחום הביולוגיה הסינתטית. עם זאת, עד כה מערכות CFPS מסתמכות על פלסמידים מעגליים שיכולים להגביל את הטכנולוגיה מלהגיע למלוא הפוטנציאל שלה. הכנת דנ"א פלסמיד תלויה בשלבים רבים שגוזלים זמן רב במהלך השיבוט ובכמויות גדולות של בידוד דנ"א. מצד שני, ניתן להשתמש בהגברת PCR מפלסמיד, או מתבנית DNA מסונתזת, כדי פשוט להכין תבניות CFPS תוך מספר שעות 2,3. לכן, יישום של DNA ליניארי מציע פתרון מבטיח עבור CFPS. עם זאת, דנ"א ליניארי מתפרק במהירות על-ידי אקסונוקלאזות הנמצאות באופן טבעי בתמציות תאים4. ישנם פתרונות המטפלים בבעיה זו, כגון שימוש בחלבון λ-phage GamS5 או DNA המכיל אתרי צ'י6 כסוכני הגנה, או הגנה ישירה על הדנ"א הליניארי על ידי שינוי כימי של קצותיו 2,7,8,9. כל השיטות הללו דורשות תוספי מזון לתמצית התא, שהם יקרים וגוזלים זמן רב. זה ידוע כבר זמן רב כי קומפלקס אקסונוקלאז V (RecBCD) משפיל דנ"א ליניארי בתאיםליזטים 4. לאחרונה, הראינו שדנ"א ליניארי יכול להיות מוגן הרבה יותר טוב בליזאטים מתאים שהוצאו עבור גנים של אקסונוקלאז (recBCD)10.
בפרוטוקול זה, צעדים להכנת ליזטים ללא תאים מזן E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי סוניקציה ליזיס מתוארים בפירוט. סוניקציה ליזה היא טכניקה נפוצה ובמחיר סביר בשימוש על ידי מספר מעבדות11,12. התמציות המופקות מזן זה אינן זקוקות לתוספת של כל רכיב נוסף או שינוי בתבנית דנ"א כדי לתמוך בביטוי מתבניות דנ"א ליניאריות. השיטה מסתמכת על השלב החיוני של אופטימיזציה של חיץ עבור תמציות תאים במיוחד לביטוי DNA ליניארי ממקדמי E. coli מקומיים. הוכח כי אופטימיזציה ספציפית זו של חיץ לביטוי DNA ליניארי היא המפתח עבור מקדמי σ70 מקומיים להניב ייצור חלבון גבוה ללא חלבון GamS או תוספת DNA צ'י, אפילו הימנעות טיהור של מוצרי PCR10. הריכוז האופטימלי של Mg-glu לביטוי DNA ליניארי נמצא דומה לזה של דנ"א פלסמיד. עם זאת, הריכוז האופטימלי של K-glu הראה הבדל משמעותי בין דנ"א ליניארי לפלסמיד, ככל הנראה בשל מנגנון הקשורלתעתוק 10. הפונקציונליות של חלבונים המתבטאים בשיטה זו הוכחה עבור מספר יישומים, כגון סריקה מהירה של מתגי toehold והערכת פעילות של גרסאות אנזים10.
פרוטוקול זה מספק פתרון פשוט, יעיל וחסכוני לשימוש בתבניות דנ"א ליניאריות במערכות ללא תאי E. coli פשוט על ידי שימוש בתמציות תאים מוטנטיות ΔrecBCD וכיול ספציפי לדנ"א ליניארי כתבנית.

<table><tbody><tr><td>2-YT מרק</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור</td></tr><tr><td>384 בארות מיקרו-פלטה תחתונה מרובעת</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>חותם צלחת דבק</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (אדנוזין 3' 5'-מונופוספט מחזורי)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (קו-אנזים A הידרט)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 מ"ל PP צינורות צנטריפוגה, מתלה ארוז במכסה CentriStar,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>430790</td><td>15 מ"ל צינור</td></tr><tr><td>קורנינג 50 מ"ל PP צינורות צנטריפוגה, תחתית חרוטית עם מכסה CentriStar,</td><td>430828 צינור סטרילי</td><td></td><td>50 מ"ל CTP</td></tr><tr><td>(Cytidine 5'-triphosphate, מלח דיסודיום הידרט)</td><td>אלפא אזר</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-DITHIOTHREITOL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פולינית (חומצה פולינית מוצקה, מלח סידן)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (גואנוזין 5?-טריפוספט,&nbsp; מלח דיסודיום)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)</td><td>קרל רוט</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K פוספט מונו-בסיסי (H2KO4P)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-גלוטמט</td><td>אלפא Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>מ"ג-גלוטמט&nbsp;</td>יחידת מסנן מזרק <td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m, polyethersulfone</td><td>Merck Millipore</td><td>מסנן</td><td>ממברנה SLGP033RB 0.22 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & ערכת ניקוי DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & ערכת ניקוי DNA</td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה פלסמיד מונרך</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>ערכת מיני-הכנה פלסמיד</td></tr><tr><td>NAD (B-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד הידרט)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NIST-traceable FITC תקן</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>פלסמיד Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>סינרגיה HTX</td><td></td></tr><tr><td>מטוהר רקומביננטי EGFP חלבון</td><td>Chromotek</td><td>EGFP-250</td><td>רקומביננטי eGFP</td></tr><tr><td>Q5 נאמנות גבוהה 2X מאסטר מיקס</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA פולימראז</td></tr><tr><td>Q5 נאמנות גבוהה 2X מאסטר מיקס</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA פולימראז</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR ערכת בדיקה</td><td>תרמו</td><td>Q32850</td><td>בדיקה פלואורומטרית עם צבע קושר DNA</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td>סטריליים מים מטוהרים ממערכת Millipore RiOs 8, מעוקרים על ידי חיטוי.</td></tr><tr>מוצרי מדעי החיים <td>הבסיסיים של Tris</td><td>Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>מעבד אולטרסאונד תא ויברה VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>סוניקטור</td></tr><tr><td>UTP Na3 (אורידין 5'- טריפוספט, טריסודיום מלח הידרט)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>מים, מים ללא נוקלאז</td><td>Thermo</td><td>R0581</td> ללא <td>נוקלאז</td></tr></tbody></table>

סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות dna ליניאריות

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) הפכה לאחרונה לפופולרית מאוד בתחום הביולוגיה הסינתטית בשל יתרונותיה הרבים. שימוש בתבניות דנ"א ליניאריות עבור CFPS יאפשר עוד יותר לטכנולוגיה למצות את מלוא הפוטנציאל שלה, ויקצר את זמן הניסוי על ידי ביטול שלבי השיבוט, הטרנספורמציה ומיצוי הפלסמיד. ניתן להגביר את הדנ"א הליניארי במהירות ובקלות על ידי PCR כדי להשיג ריכוזים גבוהים של התבנית, תוך הימנעות מרעילות פוטנציאלית של ביטוי in vivo . עם זאת, תבניות דנ"א ליניאריות מתפרקות במהירות על-ידי אקסונוקלאזות שנמצאות באופן טבעי בתמציות התאים. ישנן מספר אסטרטגיות שהוצעו כדי להתמודד עם בעיה זו, כגון הוספת מעכבי נוקלאז או שינוי כימי של קצוות DNA ליניאריים להגנה. כל האסטרטגיות הללו עולות זמן ומשאבים נוספים ועדיין אינן משיגות רמות כמעט פלסמידים של ביטוי חלבונים. פרוטוקול מפורט לאסטרטגיה חלופית מוצג כאן לשימוש בתבניות DNA ליניאריות עבור CFPS. על-ידי שימוש בתמציות תאים מתאי נוקאאוט עם מחסור באקסונוקלאז, תבניות דנ"א ליניאריות נשארות שלמות ללא צורך בשינויי קצה כלשהם. אנו מציגים את שלבי ההכנה של ליזאט תאים מזן Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי תזה סוניקטיבית וכיול חיץ עבור Mg-גלוטמט (Mg-glu) ו- K-גלוטמט (K-glu) במיוחד עבור DNA ליניארי. שיטה זו מסוגלת להשיג רמות ביטוי חלבון דומות לאלה של דנ"א פלסמיד ב- E. coli CFPS.

תוצאות מייצגות מוצגות כאן לאחר כיול הליזאט לרמות אופטימליות של Mg-גלוטמט ו-K-גלוטמט בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד (איור 1). הריכוז האופטימלי של Mg-גלוטמט דומה בתמציות Δ recB ו-ΔrecBCD ב-8 mM (איור 1B). עם זאת, ריכוז K-גלוטמט אופטימלי עבור דנ"א פלסמיד הוא 140 mM, בעוד שריכוז K-גלוטמט אופטימלי עבור דנ"א ליניארי עבור אותה תמצית הוא 20 mM (איור 1C). בניתוח השוואתי של ביטוי GFP בתמציות מתאיWT ו- Δ recBCD, נרא...

מוצג כאן פרוטוקול להכנה וכיול חיץ של תמציות תאים מזני נוקאאוט אקסונוקלאז V של Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD ו- ΔrecB). זוהי גישה מהירה, קלה וישירה לביטוי במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים באמצעות תבניות דנ"א ליניאריות.

סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

הפרוטוקול משמעותי מאוד משום שהוא מאפשר שימוש מהיר, קל וישיר בתבניות דנ"א ליניאריות במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים, אפילו מפרמטרים מקוריים של E.coli. היתרונות העיקריים הם כמות הזמן שנחסך על ידי הימנעות משיבוט, שינויים כימיים של קצוות DNA ליניאריים ותוספי הגנה כמו דנ"א גמא או צ'י. מכיוון שתמציות סינתזה המדווחות על עצמן מפותחות עבור אורגניזמים שונים בעלי עניין, השיטה שלנו מציגה דרך להאיץ את יצירת האב-טיפוס בתמציות אלה באמצעות דנ"א ליניארי.כדי להתחיל, זן פסים BL21 Rosetta-2 דלתא recBCD מ מינוס 80 מעלות צלזיוס גליצרול על צלחת אגר 2x YTP המכילה 10 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחסן מושבה אחת מצלחת האגר לקצת יותר מ-40 מיליליטר של 2x YTP בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול ולדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות של 200 סל"ד. לאחר מכן, צור תת-תרבות על ידי דילול תרבית הלילה 100 פעמים לארבעה ליטרים של מדיית YTP טרייה 2x המכילה 10 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול.מחלקים את ארבעת ליטר המדיה לארבעה צלוחיות נפרדות. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד, במשך כשלוש עד ארבע שעות של צמיחה כדי להגיע לצפיפות אופטית של 1.5 עד 2.0. שים את התרבית על קרח, לסובב את התאים ב 5, 000 G במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשליך את supernatant על ידי decanting.לאחר מכן, להשעות את כדורי התא ב 800 מיליליטר של S30A צונן עם DTT. שוב, לסובב את התאים ב 5, 000 G במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס כפי שהוכח בעבר ולהשליך את supernatant על ידי decanting. לאחר החייאת כדוריות תאים ב-160 מיליליטר של S30A מצונן עם DTT, העבירו את התאים לצינורות 50 מיליליטר מקוררים ושקלים מראש.סובבו את התאים ב-2000 G למשך שמונה דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ואז השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק. שוב, סובבו את התאים ב-2000 G למשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נאטנט הנותר באמצעות פיפטה. לאחר מכן, remeasure את המשקל של הצינור כדי לחשב את המשקל של כדור התא ולשמור על כדורי התא במינוס 80 מעלות צלזיוס.לאחר נטילת כדורי התא ממינוס 80 מעלות צלזיוס, הפשירו אותם על קרח למשך שעה עד שעתיים והחזירו את כדורי התא ב-0.9 מיליליטר של S30A עם חיץ DTT לגרם ממשקל כדור התא. לאחר מכן, פיפטה לאט כדי להשעות את התאים, הימנעות קצף העליון ככל האפשר. מניחים אליקוטים של מיליליטר אחד של התאים המחודשים לתוך מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר ושומרים אותם על קרח או בלוק קר מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, סוניקטור כל צינור בסוניקטור עם הגדרה של 20% משרעת במשך שלושה מחזורים ולסובב את הליזאט ב 12, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר איסוף supernatant עם פיפטה, להעביר צינור 50 מיליליטר. לדגום את התא ליזאט ב 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד תסיסה במשך 80 דקות.לאחר סיבוב הליזאט ואיסוף הסופרנאטנט במיקרו-צינוריות 1.5 מיליליטר מקוררות מראש, אליקוט 30 מיקרוליטר בצינורות PCR 8 רצועות מקוררים מראש, תוך שמירה על כל הצינורות על הקרח. יש להקפיא את האליקוטים של ליזאט על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הכינו תערובת אב בהתאם ללשונית הכנת החיץ כמתואר בכתב היד.לקבלת נפח תגובה של 10.5 מיקרוליטר, יש להוסיף 1.05-מיקרוליטר של ריכוזי מלאי שונים של Mg-גלוטמט ו-9.45 מיקרוליטר של תערובת האב ולערבב בעדינות. מפרקים 10 מיקרוליטרים מהתגובות הנ"ל למיקרו-פלטה תחתונה מרובעת בעלת 384 באר ומכסים אותה באמצעות אטם צלחת דבק. מדוד ביטוי גנים כפלט פלואורסצנטי על ידי רישום נתוני פלואורסצנטיות עם קורא צלחות במרווחי זמן קבועים במשך שמונה שעות דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 מחזורים לדקה.לאחר זיהוי ריכוז ה-Mg-גלוטמט שמביא לערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר בנקודת הסיום, המשך לכיול K-גלוטמט. הפעל את הניסוי וזהה את הערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר מבין ריכוזי K-גלוטמט שנבדקו, ובכך זיהה את הרכב החיץ האופטימלי עבור Mg-גלוטמט ו- K-גלוטמט עבור ליזאט זה. לאחר קביעת ערכי Mg-גלוטמט ו- K-גלוטמט, הכן צינורות מלאי של הרכב החיץ האופטימלי בהתאם לנפח האצווה המתקבל.לאחר חישוב מספר צינורות החיץ הדרושים, aliquot 38 microliters לכל צינור ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. ראשית, תייג מיקרו-צינורית של 1.5 מיליליטר להכנת תערובת מאסטר אופטימלית. מוסיפים את הנפחים הנכונים של המאגר והליזאט ומערבבים אותם בעדינות.לאחר מכן, פיפטה דגימות הדנ"א תחילה, לאחר מכן מים ללא נוקלאזות, ולבסוף, תערובת האב האופטימלית. ערבבו בעדינות את התגובה נטולת התאים עם פיפטה רגע לפני הוספתם לקורא הצלחות והימנעו מבועות. לאחר הגדרת התגובות בקורא הלוחות, ריצות קינטיות רשמו נתונים פלואורסצנטיים במרווחי זמן קבועים במשך שמונה שעות דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 מחזורים לדקה.לאחר כיול הליזאט, הריכוז האופטימלי של Mg-גלוטמט היה דומה בשמונה מילימולר על פני תמציות הן עבור דנ"א ליניארי והן עבור פלסמיד. עם זאת, הריכוז האופטימלי של K-גלוטמט עבור דנ"א פלסמיד הוא 140 מילימולר, ואילו הריכוז האופטימלי של K-גלוטמט עבור דנ"א ליניארי הוא 20 מילימולר. לאחר שלבי כיול, הושוו רמות של ביטויי GFP בין דנ"א ליניארי ופלסמיד בתמציות מסוג בר, דלתא recB ודלתא recBCD.ביטוי GFP מדנ"א ליניארי הגיע ל-102% ו-138% מהביטוי מדנ"א פלסמיד בתמציות מזני דלתא recB ודלתא recBCD, בהתאמה. הדברים החשובים ביותר בפרוטוקול הם תזה סוניקציונית של התא ושלבי כיול המאגר בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד, במיוחד בעת שימוש בפרמטרים המקוריים. טכניקה זו תסייע להאיץ את הבדיקה של עיצובים ביולוגיים במערכות ללא תאים, למשל, סינון של ביוסנסורים, אנזימים ומסלולים, או אב טיפוס של מעגלים גנטיים סינתטיים.

cell-free-protein-synthesis-from-exonuclease-deficient-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

מקור: Wiegand, D. J., et al. ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות החיידק Vibrio natriegens הגדל במהירות. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את השימוש במערכת ביטוי חלבון נטולת תאים חיידקית המבוססת על Vibrio natriegens ליזאט גולמי לביצוע שעתוק ותרגום משולבים במבחנה. הוא מדגיש את הכנת תערובת המאסטר עם רכיבים חיוניים ואת הסינתזה שלב אחר שלב של חלבונים פונקציונליים מתבנית DNA.

ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות תמצית תאים גולמיים חיידקים

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

מערכות ללא תא ביטוי הן כלי עוצמתי וחסכוני עבור תפוקה גבוהה סינתזה ו ההקרנה של חלבונים חשובים. כאן, אנו מתארים את הכנת המערכת ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות ויבריו natriegens לייצור חלבון המהירה באמצעות פלסמיד DNA DNA ליניארי, תבנית ה-mRNA.

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

שיטות מהירות ואנזימטיות להגברה של תבניות ליניאריות מינימליות לאבן טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה לייצור ליסאט חיידקי לביטוי גנים ללא תאים, באמצעות זן מהונדס של Escherichia coli ודורש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

חלקים גנטיים מאופיינים היטב נחוצים לתכנון מעגלים גנטיים חדשים. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לאפיון מהיר של חלקים גנטיים. השיטה שלנו מפחיתה עלויות וזמן על ידי שילוב ליזטים נטולי תאים, DNA ליניארי למניעת שיבוט וטיפול בנוזלים אקוסטיים כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית את נפחי התגובה.

אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים

עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

למד סינתזת חלבונים נטולת תאים באמצעות תבניות DNA ליניאריות מתמציות E. coli חסרות אקסונוקלאז. שיטה זו מייעלת תהליכי ביטוי גנים ומאיצה פיתוח אב טיפוס במערכות ביולוגיות.

סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות

גלה סרטונים נוספים