Name: איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: למדו לכמת את שלבי יצירת ופירוש ה-D-loop ברקומבינציה הומולוגית ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי. שיטה זו מאפשרת חקר חלבונים במטבוליזם של D-loop ללא תלות בחיוניות התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת הייר נתמכת על ידי מענקים GM58015 ו- GM137751 ל- W.-D.H. המחקר במעבדת פיאצה נתמך על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-StG 3D-loop, הסכם גדול 851006). D.R. נתמך על ידי T32CA108459 וקרן א.פ. ג'יאניני. אנו מודים ל-Shih-Hsun Hung (מעבדת הייר) על שיתוף תוצאות בדיקת DLC/DLE שלו ועל אימות השינויים במבחנים המפורטים בפרוטוקול זה.

<ol><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li>
<li>Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).</li>
<li>Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sae2%2C+Exo1+and+Sgs1+collaborate+in+DNA+double-strand+break+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing.</a> Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).</li>
<li>Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Holliday+junctions+are+intermediates+of+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair.</a> Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).</li>
<li>Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+coordinates+DNA+end+resection+and+prevents+formation+of+DNA+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins.</a> Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).</li>
<li>Mazón, G., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mph1+and+Mus81-Mms4+prevent+aberrant+processing+of+mitotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates.</a> Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).</li>
<li>Saini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+bubble+during+break-induced+replication+drives+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis.</a> Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).</li>
<li>Piazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+processing+of+displacement+loops+during+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair.</a> Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).</li>
<li>Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity+ligation-based+method+for+quantitative+measurement+of+D-loop+extension+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).</li>
<li>Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+roles+of+Rad52%2C+Rad54%2C+and+Rad55+proteins+in+Rad51-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination.</a> Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).</li>
<li>Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+homology+search+during+DNA+double-strand+break+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo.</a> Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).</li>
<li>Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+of+homologous+DNA+pairing+by+yeast+Rad51+and+Rad54+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins.</a> Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).</li>
<li>Wright, W. D., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+functions+as+a+heteroduplex+DNA+pump+modulated+by+its+DNA+substrates+and+Rad51+during+D-loop+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation.</a> Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).</li>
<li>Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+role+of+Rad54+in+Rad51-ssDNA+filament-dependent+homology+search+and+synaptic+complexes+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation.</a> Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).</li>
<li>Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+and+telomerase-independent+telomere+maintenance+require+Pol32%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32.</a> Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombination+execution+checkpoint+regulates+the+choice+of+homologous+recombination+pathway+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).</li>
<li>Donnianni, R. A., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+occurs+by+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+break-induced+replication+shows+that+it+stalls+at+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks.</a> Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).</li>
<li>Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+kinetics+of+break-induced+replication+%28BIR%29+by+the+assay+for+monitoring+BIR+elongation+rate+%28AMBER%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER).</a> Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).</li>
<li>Pham, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+restraining+break-induced+replication+at+two-ended+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks.</a> The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).</li>
<li>Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralens+as+photoactive+probes+of+nucleic+acid+structure+and+function%3A+Organic+chemistry%2C+photochemistry%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry.</a> Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).</li>
<li>Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkali+reversal+of+psoralen+cross-link+for+the+targeted+delivery+of+psoralen+monoadduct+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion.</a> Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).</li>
<li>Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-catalyzed+reversal+of+a+psoralen-DNA+cross-link%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link.</a> Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Mph1+helicase+dissociates+Rad51-made+D-loops%3A+Implications+for+crossover+control+in+mitotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination.</a> Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srs2+promotes+synthesis-dependent+strand+annealing+by+disrupting+DNA+polymerase+%CE%B4-extending+D-loops%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops.</a> eLife. 6, 22195(2017).</li>
<li>Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top3-Rmi1+dissolve+Rad51-mediated+D+loops+by+a+topoisomerase-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism.</a> Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).</li>
<li>Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+treatment+and+single-molecule+real-time+sequencing+reveal+D-loop+length%2C+position%2C+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution.</a> eLife. 9, 59111(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המבחנים המוצגים מאפשרים זיהוי של לולאות D מתהוות ומורחבות (בדיקת DLC), הרחבת לולאת D (בדיקת DLE) ויצירת מוצר BIR (בדיקת DLE ללא אוליגונוקלאוטידים היברידיים) באמצעות קשירת קרבה ו- qPCR. ChIP-qPCR של Rad51 לאתרים מרוחקים מה-DSB שימש בעבר כפרוקסי לחיפוש הומולוגיה בתיווך Rad51 ויצירת לולאת D. עם זאת, אות ChIP-qPCR זה אינו תלוי בהומולוגיה של הרצף בין אתר ההפסקה לתורם פוטנציאלי, כמו גם בגורם המשויך ל- Rad51 Rad54, ולכן סביר יותר שהוא מייצג קשר חולף בין נימה Rad51-ssDNA ו- dsDNA ולא לולאת D ביניים10,11<s...

רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מנגנון בעל נאמנות גבוהה של תיקון שברים דו-גדיליים בדנ"א (DSBs), קישורים צולבים בין גדילים ופערי ssDNA, כמו גם מסלול לעמידות בפני נזקי DNA. HR שונה ממסלולים מועדים לשגיאות לתיקון/סובלנות נזקי DNA, כגון צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) וסינתזת טרנסלציה, בכך שהוא משתמש בדנ"א דופלקס שלם והומולוגי כתורם לעיצוב אירוע התיקון. יתר על כן, רבים מהמתווכים המרכזיים במסלול משאבי אנוש הם הפיכים, ומאפשרים ויסות מעולה של שלבי המסלול הבודדים. במהלך שלבי S, G2 ו-M של מחזור התא, HR מתחרה עם NHEJ על תיקון ה-DSBs1 הדו-קצוות. בנוסף, HR חיוני לשכפול דנ"א לתיקון נזקי דנ"א הקשורים לשכפול, כולל פערי ssDNA ו- DSBs חד-צדדיים, וכמנגנון של מעקף נגע DNA2.
אמצעי ביניים קריטי במסלול משאבי אנוש הוא לולאת התזוזה, או לולאת D (איור 1). לאחר כריתת הסוף, הרקומבינאז המרכזי בתגובה, Rad51, נטען על ה-ssDNA החדש של המולקולה השבורה, ויוצר נימה סלילית2. לאחר מכן Rad51 מבצע חיפוש הומולוגי כדי לזהות תורם הומולוגי מתאים, בדרך כלל כרומטיד האחות בתאים סומטיים. לולאת D נוצרת כאשר נימה Rad51-ssDNA פולשת לדנ"א דופלקס הומולוגי, מה שמוביל לזיווג בסיס ווטסון-קריק של הגדיל השבור עם הגדיל המשלים של התורם, תוך הזזת גדיל התורם הנגדי. הרחבה של קצה ה-3' של הגדיל השבור על ידי פולימראז דנ"א מחליפה את הבסיסים שאבדו במהלך אירוע הנזק לדנ"א ומקדמת את הרזולוציה של ביניים לולאת D המורחבת למכפלת dsDNA באמצעות חישול גדיל תלוי סינתזה (SDSA), צומת הולידיי כפול (dHJ), או תת-מסלולי HR של שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR).
בדיקות המנטרות פיזית את המתווכים במסלול משאבי אנוש מאפשרות ניתוח של הדרישות הגנטיות לכל שלב (כלומר, ניתוח מסלול). היווצרות DSB, כריתת קצה, dHJs, בועות שכפול BIR ומוצרי HR נצפים בקלות על ידי כתם דרומי 3,4,5,6,7. עם זאת, כתם דרומי אינו מדווח על לולאות D מתהוות ומורחבות, ולכן נדרשתשיטה חלופית למדידה אמינה של מולקולות מפרקים אלה 4,8,9. אסטרטגיה נפוצה אחת לניתוח היווצרות לולאת D מתהווה היא כרומטין-מיצוי חיסוני (ChIP) של Rad51 בשילוב עם PCR כמותי (qPCR)10,11. עם זאת, הקשר של Rad51 עם dsDNA כפי שנמדד על ידי ChIP-qPCR אינו תלוי בהומולוגיה של רצף ובגורם האביזרים Rad51 Rad5410,11. לעומת זאת, אות ניכר המשתמש בשיטה של ניתוח לולאת D המוצגת כאן, הנקראת בדיקת לכידת לולאת D (DLC), תלוי בהיווצרות DSB, הומולוגיה של רצף, Rad51, וחלבוני העזר Rad51 Rad52 ו- Rad548. הממצא כי Saccharomyces cerevisiae Rad51-מקודם D-loop היווצרות תלויה ב- Rad54 in vivo עולה בקנה אחד עם ניסויים רבים בשחזור חוץ גופי המצביעים על כך ש- Rad54 נדרש לחיפוש הומולוגי ויצירת לולאת D על ידי ניצני שמרים Rad51 8,12,13,14,15.
הגישות הנוכחיות למדידת הארכת לולאת D, בעיקר באמצעות PCR כמותי למחצה, הן בעייתיות באופן דומה. בדיקה טיפוסית מבוססת PCR לאיתור הארכת D-loop מגבירה רצף ייחודי, הנובע מרקומבינציה בין אתר הפסקה לתורם חוץ רחמי ומסינתזת הדנ"א הקשורה לרקומבינציה שלאחר מכן, באמצעות פריימר במעלה הזרם של אזור ההומולוגיה על הגדיל השבור ופריימר נוסף במורד הזרם של אזור ההומולוגיה על גדיל התורם. באמצעות שיטה זו, זיהוי של סינתזת DNA הקשורה לרקומבינציה דורש את גורם העיבוד הלא חיוני של Pol δ Pol3216. ממצא זה סותר את התצפית כי למחיקה של POL32 יש השפעה קלה בלבד על המרת גנים in vivo17. יתר על כן, בדיקות מבוססות PCR אלה אינן מצליחות לפתור באופן זמני את הרחבת לולאת D ואת היווצרות המוצר של BIR, מה שמרמז על כך שהאות נובע ממוצרי dsDNA ולא מתווך ssDNA17,18,19. בדיקת הרחבת D-loop (DLE) פותחה לאחרונה כדי לטפל בפערים אלה. בדיקת ה-DLE מכמתת סינתזת דנ"א הקשורה לרקומבינציה באתר של ~400 זוגות בסיסים (bp) במורד הזרם של הקצה הפולש הראשוני 3'9. בשיטה זו, הרחבת D-loop אינה תלויה ב-Pol32 וניתנת לזיהוי תוך 4 שעות לאחר אינדוקציה של DSB, בעוד שתוצרי BIR נצפים לראשונה ב-6 שעות. ואכן, פרסום שפורסם לאחרונה במעבדות הבר ומלקובה ציין כי שימוש בשיטה זו של הכנת דנ"א גנומי מביא לשימור ssDNA 9,20.
כאן, מבחני DLC ו- DLE מתוארים בפירוט. מבחנים אלה מסתמכים על קשירת קרבה כדי לזהות לולאות D מתהוות ומורחבות ב-S. cerevisiae (איור 2)8,9. ניתן לכמת מוצרי BIR באמצעות אותה מערכת בדיקה. עבור שני המבחנים, היווצרות DSB באתר חיתוך אנדונוקלאז HO הממוקם בלוקוס URA3 על כרומוזום (Chr.) V מושרית על ידי הביטוי של אנדונוקלאז HO תחת שליטתו של מקדם גלקטוז הניתן להשרה. פלישת גדילי דנ"א בתיווך Rad51 מובילה להיווצרות לולאת D מתהווה באתר של תורם חוץ רחמי הממוקם במוקד LYS2 ב- Chr. II. מכיוון שהצד הימני של ה- DSB חסר הומולוגיה לתורם, תיקון באמצעות SDSA ו- dHJ אינו אפשרי. תיקון ראשוני של DSB על ידי BIR אפשרי, אבל היווצרות של מוצרים קיימא מעוכב על ידי נוכחות של centromere21. תכנון מכוון זה מונע תיקון DSB פרודוקטיבי, ובכך מונע את חידוש הצמיחה על ידי תאים עם DBSs מתוקנים, אשר אחרת יכול לעקוף את התרבית במהלך ניתוח מהלך הזמן.
במבחן DLC, קישור צולב פסורלן של שני הגדילים של הדנ"א ההטרודופלקס בתוך לולאת D משמר את ביניים הרקומבינציה. לאחר שיקום אתר אנזים ההגבלה על הגדיל השבור (שנכרת) והעיכול, הקישור הצולב מאפשר קשירת הרצפים הייחודיים במעלה הזרם של הדנ"א ההומולוגי השבור והתורם. באמצעות qPCR, ניתן לכמת את רמת מולקולת הדנ"א הכימרית הקיימת בכל דגימה. במבחן DLE, אין צורך בקישור צולב, ושיקום ועיכול אתר אנזים ההגבלה ואחריו קשירה תוך-מולקולרית מקשרים במקום זאת את קצה 5' של המולקולה השבורה לקצה החדש של 3'. שוב, qPCR משמש לכימות הכמויות היחסיות של מוצר כימרי זה בכל דגימה. בהיעדר שחזור אתר אנזים הגבלה, בדיקת ה-DLE מדווחת על הרמות היחסיות של תוצר ה-BIR (dsDNA) שנוצר בעקבות הארכת לולאת D.
מוצגות תוצאות מייצגות עבור כל בדיקה המשתמשת בזן מסוג פראי, והקוראים מופנים לפיאצה et al.8 ולפיאצה ואחרים לשימוש במבחנים אלה לניתוח מוטציות רקומבינציה 8,9. מטרת תרומה זו היא לאפשר למעבדות אחרות לאמץ את מבחני DLC ו- DLE, ותמיכה בהם זמינה על פי בקשה.

<table><tbody><tr><td><חזק>1. טרום צמיחה, אינדוקציה DSB ואיסוף דגימות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ו-50 מ"ל צינורות</td><td></td><td></td><td></td>חרוטיים</tr><tr><td>15 מ"ל 250</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מ"ל, 500 מ"ל או 1 ליטר צלוחיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי שקופות אופטית עם תחתית</td><td></td> שטוחה<td></td><td>הצעה: קורנינג, מספר קטלוגי 430166; או Genesee Scientific, מספר קטלוגי 32-150G</td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסלית עם מתאמי</td><td></td><td></td><td></td>צינור חרוטי של 15 ו-50 מ"ל</tr><tr><td>שייקר מסלולי ספסל או מסובב/אקדח</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור מסובב</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker או קופסת אור עם נורות UV של 365 ננומטר המונחות על גבי שייקר</td><td></td><td></td> <td>מסלוליהצעה: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) או Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, מספר קטלוגי 611110831</td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% w/w נתרן DL-לקטט סירופ סיגמא-אולדריץ</td><td>'</td><td>L1375</td><td>להכנת מדיה</td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר</td><td>BP1423500</td><td>להכנת מדיה</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD Difco</td><td>211840</td><td>להכנת מדיה</td></tr><tr><td>תמצית שמרי בקטו</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td>להכנת מדיה</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>BD Difco</td><td>0155-17-4</td><td>להכנת מדיה</td></tr><tr><td>Trioxsalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137</td><td>לקישור צולב פסורלן</td></tr><tr><td><חזק>2. שחזור אתר אנזים ספרופלסטינג, ליזה והגבלה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוצנטריפוגה</tr><tr><td>אמבט</td><td></td><td></td><td></td>יבש</tr><tr><td>חנקן נוזלי או קרח יבש/אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה או מיקרוצנטריפוגה</td> <td>מקוררת</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X אנזים הגבלה (CutSmart) (500 מ"מ אשלגן אצטט, 200 מ"מ טריס-אצטט, 100 מ"מ מגנזיום אצטט, 1 מ"ג/מ"ל BSA, pH 7.8-8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>זימוליאז 100T</td><td>US Biological</td><td>Z1004</td><td>לספרופלסטינג</td></tr><tr><td><חזק>3. עיכול אנזים הגבלה וקשירה תוך-מולקולרית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט</td><td></td><td></td><td></td> מים</tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3101</td><td>עיכול אנזים הגבלה לבדיקת DLC</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3104</td><td>עיכול אנזים הגבלה לבדיקת DLE</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202</td><td>קשירה תוך מולקולרית</td></tr> <tr><td><חזק>4. טיהור DNA</חזק><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ו-2 מ"ל צינורות מיקרו-צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקים>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (P/C/IA) בשעה 25:24:1</td><td>טיהור</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA Sigma-Aldrich P2069<חזק>5. היפוך קישור צולב פסורלן</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת תרמו-מחזורר/PCR<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חזק>6. qPCR</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזורי אור 480</td><td>רוש</td><td>5015278001</td><td>מכונת qPCR המשמשת את המחברים</td></tr><tr><td>מכונת Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>qPCR המשמשת את המחברים</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 צלחת 96 בארות,</td> צלחות <td>Roche</td><td>4729692001</td><td>96 בארות לבנה עבור qPCR</td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green Super Mix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>ערכת qPCR המשמשת את המחברים</td></tr><tr><td>SYBR Green I Master Mix</td><td>ערכת ה-qPCR של Roche</td><td>4707516001</td><td>המשמשת את המחברים</td></tr></tbody></table>

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-pcr כמותי ב-saccharomyces cerevisiae

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

נזק לדנ"א, כולל שברים דו-גדיליים בדנ"א וקישורים צולבים בין גדילים, שנגרם במהלך שלבי S ו-G2 של מחזור התא, ניתן לתיקון על-ידי רקומבינציה הומולוגית (HR). בנוסף, HR מייצג מנגנון חשוב של חילוץ מזלג שכפול לאחר עיכוב או קריסה. הסדרת הצעדים הרבים ההפיכים והבלתי הפיכים של מסלול מורכב זה מקדמת את נאמנותו. הניתוח הפיזיקלי של מתווכי הרקומבינציה שנוצרו במהלך HR מאפשר לאפיין בקרות אלה על ידי גורמי נוקלאופרוטאין שונים והאינטראקטורים שלהם. למרות שישנן שיטות מבוססות היטב לבחון אירועים ומתווכים ספציפיים במסלול הרקומבינציה, זיהוי היווצרות והרחבה של לולאת D, שני שלבים קריטיים במסלול זה, התגלה כמאתגר עד לאחרונה. כאן מתוארות שיטות יעילות לאיתור אירועי מפתח במסלול HR, כלומר היווצרות שבירה דו-גדילית של DNA, היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באמצעות שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR) ב- Saccharomyces cerevisiae . מבחנים אלה מזהים את חומרי הביניים והמוצרים הרקומבינציה הרלוונטיים שלהם ברגישות גבוהה ואינם תלויים בכדאיות התאית. הזיהוי של לולאות D, הרחבת D-loop ומוצר ה- BIR מבוסס על קשירת קרבה. יחד, מבחנים אלה מאפשרים לחקור את הקינטיקה של HR ברמת האוכלוסייה כדי לטפל בעדינות בתפקודים של חלבוני משאבי אנוש ורגולטורים בשלבים משמעותיים במסלול.

בדיקת DLC בדיקת DLC מזהה הן לולאות D מתהוות והן לולאות D מורחבות שנוצרו על-ידי פלישה של DSB ספציפי לאתר לתורם יחיד (איור 2). Psoralen crosslinking מקשר פיזית את הגדיל השבור ואת התורם באמצעות הדנ"א ההטרודופלקס בתוך לולאת D. שיקום אתר אנזים ההגבלה עם אוליגו ארוך והכלאה על גדיל הכרית של השבר מאפשר ביקוע אנזים הגבלה, ולאחר מכן קשירת הגדיל השבור לתורם הפרוקסימלי ליצירת תוצר כימרי הניתן לכימות על ידי qPCR. יש לציין כי אות ה-DLC תלוי בהצלבת הפסורלן, אוליגו ההכלאה, הרקומ...

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

מבחני הלכידה וההארכה של לולאת D הם הראשונים שמאפשרים כמות בלתי משוחדת וישירה של היווצרות לולאת D ושלבי הארכה במהלך רקומבינציה הומולוגית בתאי שמרים הגדלים במיטו. טכניקה עצמאית זו מאפשרת לחקור חלבונים במטבוליזם של לולאת D שאחרת לא היה ניתן להתנתק מתפקידים מאוחרים יותר, רק להסתכל על מוצרי BIR. בעתיד, אנו צופים מעבר של מבחנים אלה לתאים אנושיים כדי להבין טוב יותר את תפקידם של חלבוני מפתח, כולל BRCA2 והמקרים של פריחה וקילו וורנר ברקומבינציה הומולוגית.התחל על ידי צנטריפוגה של הדגימות במשך חמש דקות. החזירו את הכדור ל-2.5 מיליליטר של תמיסת פסורלן 1x והעבירו אותו לצלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר. ללא שליטה בקישור צולב, השהה מחדש את הכדור ב- 2.5 מיליליטר של פתרון TE1.לאחר מכן, הגדר את מקור האור UV את החלק העליון בשייקר מסלולי, שנקבע על 50 סל"ד. כדי להצליב את הדגימות באמצעות קישור צולב UV עם נורות גל באורך 365 ננומטר. מקמו את צלחות הפטרי במרחק של סנטימטר עד שניים מתחת למקור אור ה-UV למשך 10 דקות עם ניעור עדין על צלחת פלסטיק או פרספקס מקוררת מראש.לאחר מכן להעביר את הדגימה לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. שטוף את צלחת הפטרי עם 2.5 מיליליטר של תמיסת TE1 והוסף אותה לצינור. צנטריפוגה את הדגימות במשך חמש דקות.יש להשליך את הסופר-נטנט ולאחסן את הכדור בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. מניחים את הדוגמאות על קרח להפשרה. במקביל, מחממים אמבטיה יבשה ל -30 מעלות צלזיוס.השהה את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ spheroplasting והעבר אותן לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים 3.5 מיקרוליטרים של תמיסת זימוליאז ומערבבים בעדינות על ידי הקשה. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.ואז מניחים את הצינורות על קרח. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ומניחים את הדגימות על קרח. שטפו את הדגימות שלוש פעמים בחיץ ספרופלסט מיליליטר אחד וצנטריפוגות את הדגימות במשך שלוש דקות.יש להשעות את הדגימות במיליליטר אחד של מאגר אנזימי הגבלת הצטננות. צנטריפוגה במשך שלוש דקות ומניחים את הדגימות על קרח. יש לחזור על הכביסה פעם אחת.יש להשעות את הדגימות במיליליטר אחד של מאגר אנזים הגבלה קר 1x. חלקו את המדגם באופן שווה לשניים. צנטריפוגה דגימות במשך שלוש דקות ב 16, 000 G בארבע מעלות צלזיוס.יש לתלות שפופרת אחת מכל דגימה ב-180 מיקרוליטרים של מאגר אנזימי הגבלה פי 1.4 עם אוליגוס היברידיים וצינור נוסף ב-180 מיקרוליטרים של מאגר אנזימי הגבלה פי 1.4 ללא הכלאה של אוליגוס. הצמד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי. הפשירו את הדגימות על הקרח.מחממים אמבטיה יבשה אחת ל-65 ואחרת ל-37 מעלות צלזיוס. Aliquot 36 מיקרוליטרים של הדגימה לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו חדש וארבעה מיקרוליטרים של 1% SDS ומעורבבים על ידי הקשה עדינה על הצד של הצינור. יש לדגור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בהקשה עדינה כל חמש דקות.הניחו דגימות על קרח מיד לאחר הדגירה. מוסיפים 4.5 מיקרוליטרים של 10% טריטון X-100 ומערבבים על ידי פיפט. הוסף 20 עד 50 יחידות של אנזים הגבלה EcoR1 או HindIII בנאמנות גבוהה לכל דגימה.ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם תסיסה עדינה כל 20 עד 30 דקות. במהלך תקופה זו, אמבטיה יבשה מחוממת מראש ל 55 מעלות צלזיוס ואמבט מים ל 16 מעלות צלזיוס. הוסיפו 8.6 מיקרוליטרים של 10% SDS לכל דגימה וערבבו על ידי פיפטינג והקשה.דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הוסיפו 80 מיקרוליטרים של 10% טריטון X-100 לכל דגימה וערבבו בפיפט. הוסיפו 660 מיקרוליטרים של חיץ קשירה 1x ללא ATP, ATP מילימולרי אחד ב-pH 8.0 ושמונה יחידות של ליגאז DNA T4 לכל דגימה, וערבבו בעדינות על ידי היפוך.דגירה 16 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות עם היפוך כל 30 דקות. מניחים את הדגימות על קרח מיד לאחר הדגירה. לאחר טיהור הדנ"א כמתואר בפרוטוקול, השתמש בשני מיקרוליטרים של דנ"א מטוהר כדי ליצור תגובת qPCR של 20 מיקרוליטר בהתאם להוראות היצרן.עבור כל דגימה, הגדר חמש תגובות בקרה ותגובת כימות אחת והפעל אותן בשכפול. ניתוח בדיקת DLC שעתיים לאחר הפסקה דו-גדילית או אינדוקציה של DSB הראה כי קישור צולב של פסורלן הוא קריטי והיעילות תלויה בזמן שבין איסוף הדגימה ל-qPCR. ערכי ערכי ARG4 Cp היו דומים בין הדגימות המקושרות אך נמוכים יותר עבור הדגימה ללא קישור צולב מכיוון שדנ"א ללא קישורים צולבים מגביר בצורה יעילה יותר.עבור כל הדגימות, בקרת qPCR של קשירה בין-מולקולרית הייתה בטווח. אינדוקציה חזקה של DSB הוכחה על ידי אות qPCR נמוך לבקרה שמגבירה את אתר זיהוי האנדונוקלאז של HO. תוצאות דומות נצפו עבור בקרת EcoR1 qPCR.אות DLC עם אוליגו היברידי חושב על ידי נרמול לבקרת הקשירה הבין-מולקולרית. ניתוח בדיקת DLE שבוצע בשש שעות לאחר אינדוקציה של DSB הראה כי ערכי ARG4 CP היו דומים בין דגימת אוליגוס עם ובלי הכלאה. בקרת qPCR של קשירה בין-מולקולרית גילתה אות קביל עבור דגימת אוליגוס עם ובלי הכלאה, אך אות נמוך יותר עבור הדגימה הכושלת.בכל שלוש הדגימות הייתה אינדוקציה חזקה של DSB. מכיוון שביקוע HindIII תלוי בשיקום אתר אנזים ההגבלה על ידי אוליגו הכלאה. היה הבדל משמעותי בהגברה על פני אתר המחשוף HindIII על החוט שנכרת בין הרוחב וללא דגימות אוליגו.הבדל קטן יותר בהגברה על פני האתר על הגדיל המורחב נצפה מכיוון שכאן המחשוף של HindIII תלוי גם בהרחבה. הדגימות והחיץ צריכים להישמר קרים בכל עת. דגימות חייבות להיות מוקפאות לאחר חידוש במאגר אנזים הגבלת קור פי 1.4 עם או בלי הכלאה של אוליגו.ניתן לחקור את ההשפעות במורד הזרם של היווצרות לולאת D והרחבה על היווצרות מוצרים באמצעות כתמים דרומיים או מבחני נקודות קצה גנטיות. השפעות על חיפוש הומולוגי עשויות להיחקר באמצעות CP גבוה. כרומטין-מיצוי חיסוני יכול לספק מידע על גיוס של חלבון מעניין.

detection-homologous-recombination-intermediates-via-proximity

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Assay HO-מגורה טרנסלוקציה מפקחת גדיל יחיד חישול בעקבות הקמתה של גדיל הדנ"א הכפול הפסקות בבית לוקוסים מספר...

Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae</em

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת הכתם הדרומי לזיהוי אירועי רקומבינציה הומולוגיים בגנום של תאי גזע עובריים של עכברים באמצעות בדיקות רדיואקטיביות. אזורי דנ"א המכילים אירועי רקומבינציה הומולוגיים מופיעים כפסים נפרדים כאשר הממברנה המכילה את הדנ"א הקשור לגשושית נחשפת לקרני רנטגן.

כתם דרומי לזיהוי רקומבינציה הומולוגית בגנום תאי גזע עובריים של עכבר

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

למדו לכמת את שלבי יצירת ופירוש ה-D-loop ברקומבינציה הומולוגית ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי. שיטה זו מאפשרת חקר חלבונים במטבוליזם של D-loop ללא תלות בחיוניות התא.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

גלה סרטונים נוספים