קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה
23 באוגוסט 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבוע את זיקות הקשירה של אפטמרים כנגד מטרות חופשיות בתמיסה, תוך מתן תובנה לגבי מנגנון הקשירה. מכיוון ש- ITC מודד שינויים בחום עקב קשירה, לא aptamer ולא ligand צריך להיות מתויג או פונקציונלי, כפי שהיה במקרה של טכניקות כגון SPR. משתמשים חדשים צריכים לשים לב למאגרים תואמים בכל רכיבי הכריכה.
בנוסף, שימו לב שלטכניקה יש דרישות דגימה גבוהות שעשויות להיות קשות לעמידה עבור ליגנדות גדולות יותר כגון חלבונים. כדי להתחיל, להפעיל את הממברנה של עמודת הדיאליזה, למלא עם מאגר PBS, שיווי משקל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך 15 דקות. הסר את המאגר וטען 500 מיקרוליטר של דגימות aptamer לתוך העמודה.
צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G ולחזור על זה ארבע פעמים כדי להחליף את המאגר המקורי עבור PBS. לאסוף את ה- DNA aptamer dialyzed באמצעות פיפטה ולהעביר אותו לצינור החדש 1.5 מיליליטר. אסוף את מאגר הזרימה האחרון כדי להמיס טטרציקלין.
ודא שהמאגר של הניסוי במזרק תואם למאגר בתא הייחוס. קבע שוב את ריכוז האפטמר באמצעות ספקטרומטר הנראה לעין UV. השתמש במאגר החליפין האחרון כדי להתאים את הריכוז לטטרציקלין 40-מיקרומולרי ואפטמר דו-מיקרומולרי.
מקפלים את ה-DNA aptamer על ידי חימום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, קירור ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן חוזרים לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. דגה את האפטמר המקופל והטטרציקלין המקופל באמצעות תחנת degassing או משאבת ואקום למשך 25 דקות כדי לחסל גזים מומסים. לאחר ניקוי ואישור ניקיון המכונה, בדוק את דיוק המכונה עם ערכה סטנדרטית הכוללת EDTA וסידן כלורי באמצעות תוכנית ברירת המחדל ופעל לפי הוראות היצרן.
הגדר את הפרמטרים הפועלים. בדוק את אמצעי האחסון הדרושים באמצעות מחשבון תוכנית פועלת. עם פרמטר ריצה זה, בצע מדידת ITC עם 230 מיקרוליטרים של טטרציקלין 40-micromolar במזרק ITC ו 485 מיקרוליטר של שני מיקרומולר aptamer בתא מדגם ITC באמצעות ITC.
העמיסו את לוחות המזרק טטרציקלין המקופלים ואת האפטמר המקופל לתוך תא הדגימה, תוך הימנעות מבועות, באמצעות פיפטה. התחל להפעיל את מכשיר ה- ITC על ידי לחיצה על התחלה כפתור בתוכנה. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים על ידי לחיצה כפולה כדי להתחיל לנתח את הנתונים.
פתח את הנתיב של הנתונים הגולמיים שנשמרו כדי לדעת את הנטייה של כריכה. פתח את הכרטיסיה מידול והשתמש במודלי איגוד שונים כדי למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לעקומת הנתונים. לאחר מכן, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את התרמוגרמה של ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה, אנטרופיה, אנרגיה חופשית, קבוע קשירה של שיווי משקל וסטויכיומטריה.
אסוף את הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו מהנתונים וממידע המודל המתאים. צור דוח הכולל תמונות של התרמוגרמה ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים. האפטמר שנבחר על ידי קים, et al נקשר לטטרציקלין עם זיקות מחייבות של קבוע דיסוציאציה אחד שווה 13 מיקרומולר וקבוע דיסוציאציה שני שווה 53 ננו-מולר.
המודל המתאים והסטויכיומטריה של ITC משקפים כי האפטמר נקשר לטטרציקלין באמצעות יחס קשירה של 2:1 עם מודל הקשירה הרציפה. הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו על ידי מדידת ITC עבור אתר שני הצביעו על כך שהתגברות על אנתלפיה משמעותית יחסית של אובדן אנטרופי מניעה את הקשירה החזקה. הקשירה מונעת האנתלפיה עם אובדן האנטרופיה מתייחסת לשינויים קונפורמיים של חומצות גרעין, שדווחו כהתנהגויות קשירה בין רנ"א למולקולה קטנה.
האפטמר והליגנד חייבים להיות באותו חיץ. יש לקפל מחדש את האפטאמר אם פותח עם refolding, ודגימות חייבות להיות degassed. טיפול בשיקולים אלה יבטיח שרק אינטראקציות אפטמר-ליגנד יתרמו לאות הנמדד.
בשל גודלו של יעד האפטמר, שיטת מעקב מתאימה יכולה להיות תרמופורזה בקנה מידה זעיר כדי לאשר את זיקת הקשירה הנמדדת ללא תמיסה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בקלורימטריית תיתור איזותרמית (ITC) לניתוח קינטיקת הקשירה של אפטמר DNA וטטרציקלין. הוא מספק הנחיות מפורטות להכנת דגימות, הרצת סטנדרטים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- כימיה אנליטית
רקע
- ITC מודד שינויים בחום במהלך אינטראקציות קישור.
- הוא מאפשר ניתוח של זיקות קישור ללא סימון של האפטמר או הליגנד.
- התאמה של באפרים בין כל הרכיבים היא קריטית לקבלת תוצאות מדויקות.
- לטכניקה זו דרישות דגימה גבוהות, במיוחד עבור ליגנדים גדולים יותר.
מטרת המחקר
- לקביעת זיקויות הקשירה (binding affinities) של אפטמרים כנגד מטרות בתמיסה.
- להשגת תובנות לגבי מנגנון הקשירה של אינטראקציות בין אפטמר לליגנד.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים המשתמשים ב-ITC.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלה של ממבנה עמוד הדיאליזה.
- השגת שיווי משקל באמצעות בופר PBS.
- צנטריפוגציה להכנת הדגימות.
- טעינת דגימות אפטמר לעמוד לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של קינטיקת הקשירה בין האפטמר לטטרהציקלין.
- תובנות לגבי התרמודינמיקה של תהליך הקשירה.
- ביסוס של פרוטוקול מהימן לניסויי ITC.
מסקנות
- ITC היא שיטה יעילה לחקר אינטראקציות בין אפטמר לליגנד.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות שונות של אפטמר ומטרה.
- הבנת קינטיקת הקישור חיונית ליישומים בפיתוח תרופות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
אפיון כמותי של קישור בין אפטמר למולקולה קטנה הוא קריטי לתיקוף המטרה ולהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. קלורימטריה של טיטול איזותרמי (ITC) מאפשרת מדידה נטולת סמנים במוף תמיסתי של זיקת קישור, סטויכיומטריה ופרמטרים תרמודינמיים, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בבחירת האפטמר. יכולת זו מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ותיעדוף תיקי פיתוח עבור תוכניות טיפוליות ואבחנתיות מבוססות חומצות גרעין.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של זיקת קישור ומנגנון הקישור של אפטמר למטרה בתמיסה.
- מספק פרופילים תרמודינמיים (אנטלפיה, אנтроפיה, אנרגיה חופשית) לצורך הפחתת סיכונים מכנית.
- תומך בתיקוף תפקודי של המטרה על ידי אישור אינטראקציות מולקולריות ספציפיות.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת האפטמר עבור יישומים שלבים מאוחרים יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קבועי קישור כמותיים וסטוכיומטריה לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- תומך בשחזור וב khả năng השוואה בין אפטמרים מועמדים למטרות שונות.
- מאפשר מוכנות לסריקה על ידי תיקוף אינטראקציות בין אפטמר למטרה ללא סימון.
- מספק נתונים לשימוש חוזר בפלטפורמה וליכולת הרחבה בתהליכי פיתוח בדיקות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את תכונות קישור האפטמר למולקולות קטנות המהוות מטרות רלוונטיות למחלה.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אישור קישור בשלב התמיסה.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב עמימות מכניסטית בזיהוי מולקולרי.
- תומך בפיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים כאשר אפטמרים משמשים כריאגנטים לזיהוי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
ניתוח קישור המבוסס על ITC ממוקם בנקודת המפגש בין הגילוי המוקדם, זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ופיתוח הבדיקות, ומספק נתונים בסיסיים עבור מערכות של אפטמר-מטרה לפני המעבר לשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: מכמתת את זיקת הקישור והתרמודינמיקה כדי לתמוך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים.
- סריקה: מאשרת את מוכנות הבדיקה ואת השחזוריות שלה באמצעות מדידות ישירות ללא סימון.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים כמותיים (Kd, ΔH, ΔS, סטוכיומטריה) להשוואה איתנה של מועמדים לאפטמרים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים על ידי תיקוף של אינטראקציות בין אפטמר למטרה בתמיסה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר עבור זוגות מגוונים של אפטמר-מטרה בתוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של aptamer-target.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידות קישור ותמיכה בחזרתיות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים של מועמדים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של נכסים מבוססי aptamer.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בקלורימטריה ובניתוח נתונים כמותי להתאמת מודלים.
- דורש גישה למכשור ITC ותוכנה אנליטית תואמת.
- מחייב התאמה קפדנית של התמיסות החיצאיות (buffers) והכנת דגימות כדי למנוע ארטיפקטים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור ליגנדים גדולים יותר או במקרים של זמינות דגימות מוגבלת.
- ניקוי גזים מהדגימה וקיפול מחדש של האפטמר הם קריטיים למדידות מדויקות.
