Name: קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: חקור את הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנתח אפיניות קשירה ללא צורך בסימון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר והפיתוח של Aptagen LLC.

הערה: איור 2 מציג את השלבים העיקריים של ניסוי ITC לקביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין.
1. הכנת דוגמאות
הערה: יש להכין דגימות עבור ITC באותו חיץ הן עבור האפטמר והן עבור הליגנד כדי למנוע שחרור חום הנגרם על ידי ערבוב מאגרים שונים מתא הדגימה והמזרק. זה מושג בדרך כלל באמצעות דיאליזה של כל החומרים לתוך אותו חיץ. המאגר מוחלף באמצעות פרוטוקול המותאם מהפרוטוקול של רכז חיתוך משקל מולקולרי של 3 kDa (MWC) עם כמה שינויים, כמפורט להלן:
<ol><li>הפעל את הממברנה של עמודת הדיאליזה (3 kDa MWC) עם 1x PBS, pH 7.4, שנרכש מהיצרן, באמצעות השלבים הבאים: מלא במאגר 1x (PBS), שיווי משקל למשך 10 דקות ב- RT, וצנטריפוגה ב- 5,000 x g למשך 15 דקות.</li>
	<li>הסר את המאגר וטען 500 μL של דגימות aptamer לתוך העמודה, צנטריפוגה ב 5,000 x גרם, ולחזור על זה 4x כדי להחליף את המאגר המקורי עבור 1x PBS. כאשר החיץ עובר דרך הממברנה, כל המולקולות עם מסה קטנה מ -3 kDa יעברו דרך הממברנה, והאפטמר יישאר בצד העליון של הממברנה.</li>
	<li>אסוף את ה-DNA aptamer שעבר דיאליזה באמצעות פיפט והעבר אותו לצינור(ים) החדשים של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>אסוף את מאגר הזרימה האחרון כדי להמיס טטרציקלין. אבקת טטרציקלין היא טהורה וקטנה, ולכן אין צורך בדיאליזה. עם זאת, השתמש במאגר הדיאליזה הקודם עבור דנ"א עבור המטרה כדי להבטיח שהמאגר לניסוי במזרק יתאים למאגר בתא הייחוס.</li>
	<li>קבע שוב את ריכוז האפטמר באמצעות ספקטרומטר הנראה לעין UV. השתמש במאגר החליפין האחרון כדי להתאים את הריכוז ל-40 μM טטרציקלין ו-2 μM aptamer.</li>
	<li>קפלו את ה-DNA aptamer על ידי חימום ב-90°C למשך 10 דקות, קירור ב-4°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן חזרו ל-RT למשך 20 דקות.</li>
	<li>דגה את האפטאמר המקופל והטטרציקלין המקופל באמצעות תחנת degassing או משאבת ואקום המוגדרת ל-600 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות כדי לחסל גזים מומסים.</li>
</ol>2. שטיפת המכשיר והפעלת ערכת הבדיקה
<ol><li>נקה את יציאות הממס כדי לוודא שכל נתיב הדגימה ברור. נקו על ידי השלכת תמיסת הפסולת והעמסתה במתנול טהור, מים וחוצץ. כל יציאה מכילה יותר מ -250 מ"ל כדי להבטיח פתרון מספיק לניקוי. הערה: תהליך הניקוי הושלם באופן אוטומטי על-ידי תוכנת בקרת ITC הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש.</li>
	<li>בדוק את ניקיון המחשב על-ידי הפעלת ITC באמצעות מאגר לתוך מאגר (כלומר, 1x PBS לתוך 1x PBS). הערה: קו בסיס רגיל של רעש נראה בין המאגר הזעיר לפסגות הזרקת חיץ. כאשר מזרק הטיטרציה והצינוריות מנוקים כראוי ויבשים לחלוטין, קו הבסיס יהיה יציב; עלייה או ירידה בנקודת ההתחלה משקפת מכשור מלוכלך או בועות בתוך המכשיר, שיש לתקן לפני הפעלת דגימות בפועל.</li>
	<li>בדוק את דיוק המכונה באמצעות ערכה סטנדרטית הכוללת EDTA ו- CaCl2 (איור 3), באמצעות תוכנית ברירת המחדל וביצוע הוראות היצרן.</li>
</ol>3. הרצת הדגימה לקביעת הקשירה בין אפטמר לטטרציקלין
<ol><li>הגדר את פרמטרי הריצה: קצב ערבוב של 200 סל"ד, ריצה ב 25 מעלות צלזיוס, 2 μM aptamer ו 40 μM טטרציקלין, 30 זריקות עם 2.0 μL כל אחד, זמן עיכוב של 180 שניות.</li>
	<li>בדוק את אמצעי האחסון הדרושים באמצעות מחשבון תוכנית פועלת. עם פרמטר ריצה זה, בצע מדידת ITC עם 230 μL של 40 μM טטרציקלין במזרק ITC ו 485 μL של 2 μM aptamer בתא הדגימה ITC באמצעות ITC.</li>
	<li>העמיסו את לוחות המזרק טטרציקלין המקופלים ואת האפטמר המקופל לתוך תא הדגימה, תוך הימנעות מבועות, באמצעות פיפטה.</li>
	<li>התחל להפעיל את מכשיר ה- ITC על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנה. הערה: תהליך ההפעלה של מכשיר ITC הוא אוטומטי לחלוטין לאחר מילוי ידני של תאי הייחוס ולוחות דגימת הטיטראנט.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה
<ol><li>פתח את תוכנת ניתוח הנתונים על ידי לחיצה כפולה כדי להתחיל לנתח את הנתונים.</li>
	<li>פתח את הנתיב של הנתונים הגולמיים שנשמרו כדי לדעת את הנטייה של כריכה.</li>
	<li>פתח את כרטיסיית המידול והשתמש במודלי איגוד שונים כדי למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לעקומת הנתונים. לאחר מכן, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את התרמוגרמה של ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה (ΔH), אנטרופיה (ΔS), אנרגיה חופשית (ΔG), קבוע קשירת שיווי משקל (Ka) וסטויכיומטריה.</li>
	<li>אסוף את הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו מהנתונים וממידע המודל המתאים.</li>
	<li>צור דוח, הכולל תמונות של התרמוגרמה ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כפי שמוצג באיור 4 ובטבלה 1.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Environmental+Science+%26+Health%22%5BJournal%5D)">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).</li>
<li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+Allostery%2C+inhibition%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li>
<li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li>
<li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li>
<li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272(2017).</li>
<li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+and+thermodynamics+of+2%27%2C5%27+RNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li>
<li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li>
<li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה המוצגת כאן שונתה בהתאם להוראת ת"א מכשירים והיא מספיקה כדי לקבוע את זיקת הקשירה והתרמודינמיקה של אפטאמרים ומטרות נבחרות רבות במרכזנו. שלבים מכריעים מהליך זה כוללים החלפת המאגר כך שיהיה לו יעד התואם את הליגנד, הרצת דגימות עם פרמטרים מתאימים ומציאת מודל התאמת המחייב המתאים לניתוח הנתונים. הקלטה רציפה של שחרור חום דורשת ביטול כל חום הרעש, כגון חוסר התאמה של החיץ, לכלוך של התא והמזרק, ובועות בתוך הדגימות. בשלב חילופי החיץ, עדיף להשתמש בחיץ הדיאליזה האחרון או במאגר הזרימה בקרום הדיאליזה או בעמודת הספין כדי להמיס את הליגנ...

Aptamers הם מקטעי ssDNA או RNA שנבחרו בתהליך אבולוציה עם זיקה וספציפיות גבוהה ליעדים הרצויים 1,2, שיכולים לעבוד כיסודות זיהוי מתקדמים או נוגדנים כימיים 3,4,5. לפיכך, זיקתם וספציפיותם של האפטמרים למטרותיהם ממלאות תפקיד מכריע בבחירה וביישום של אפטאמר, וקלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) נמצאת בשימוש נרחב למטרות אפיון אלה. גישות רבות שימשו לקביעת הזיקה של אפטמרים, כולל ITC, תהודת פלסמון פני השטח (SPR), טיטרציה צבעונית, תרמופורזה בקנה מידה זעיר (MST) ואינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI). ביניהם, ITC היא אחת הטכניקות האחרונות כדי לקבוע את הקשר התרמודינמי והקינטי של שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה 6,7. בניגוד לשיטות אחרות, ITC יכול להציע זיקה מחייבת, מספר אתרי קשירה וקשר תרמודינמי וקינטי (איור 1A). מפרמטרים ראשוניים אלה, השינויים באנרגיה החופשית של גיבס ושינויי האנטרופיה נקבעים באמצעות הקשר הבא:
ΔG = ΔH-TΔS
משמעות הדבר היא ש-ITC מציע פרופיל תרמודינמי מלא של האינטראקציה המולקולרית כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה (איור 1B). קביעת זיקת הקשירה למולקולות קטנות עם אפטמר קשה בשל הגדלים השונים באופן דרסטי בין אפטמר למטרה. בינתיים, ITC יכול לספק מדידה רגישה ללא תיוג ושיתוק מולקולות, מה שמספק אמצעי לשמירה על המבנה הטבעי של האפטמר והמטרה במהלך המדידה. עם התכונות שהוזכרו, ITC יכול לשמש כשיטה סטנדרטית לאפיון קשירה בין aptamer לבין מטרות קטנות.
לאחר בחירה על ידי קבוצת Gu, אפטמר זה שולב עם פלטפורמות שונות, כולל ביוסנסורים מבוססי אפטמר אלקטרוכימיים, בדיקת אפטמר תחרותית הקשורה לאנזים, וצלחת מיקרוטיטר, שיכולה להשיג זיהוי תפוקה גבוהה של טטרציקלין 8,9,10. עם זאת, המאפיינים המחייבים שלה לא הובהרו מספיק טוב כדי לבחור את הפלטפורמה הנכונה8; כדאי לאפיין את הכריכה של aptamer לטטרציקלין באמצעות ITC.

<table><tbody><tr><td>5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACCGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies, Inc</td><td></td><td>הרצף אומץ מהמחקר של גו, שלא זיהה Kd באמצעות ITC (עיין הפניות 8 ו-9)</td></tr> <tr><td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 ומיקרו; L) המערכת הושלמה; Gold Cells</td><td>TA Instruments</td><td>61000.901</td><td>מערכת קלורימטריית טיטרציה איזותרמית</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Avantor (VWR)</td><td>E506-100ML</td><td>סידן כלורי 1 M בתמיסה מימית, צנטריפוגה סטרילית בדרגת ביוטכנולוגיה</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>ה-Eppendorf 5417R הוא ללא תחרות בבטיחות, אמינות וקלות שימוש. קל מאוד לתחזוקה עם מנוע ללא פחמים שמסתובב עד 16,400 סל"ד עם RCF מקסימלי של עד 25,000 x גרם.</td></tr><tr><td>תחנת הסרת גז מלאה (110/230V)</td><td>TA Instruments</td><td>6326</td><td>מסיר גז זה מספק פלטפורמת ערבוב עצמאית, תא ואקום, יציאת ואקום, בקרת טמפרטורה וטיימר אלקטרוני להכנת דגימה נכונה.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TekNova</td><td>E0375</td><td>EDTA 500 מ"מ, pH 7.5</td></tr><tr><td>NanoDrop מיקרו-נפח אחד ספקטרופוטומטר UV-Vis</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>UV-Vis ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>Nanosep, Nanosep MF ו-NAB התקנים צנטריפוגליים</td><td>Pall Laboratory</td><td>OD030C34</td><td>רכז ניתוק משקל מולקולרי 3 kDa PBS</td></tr><tr><td>pH 7.4</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70165</td><td>בופר המכיל נתרן פוספט, נתרן כלורי, אשלגן פוספט ואשלגן כלורי סטרילי בדרגה טהורה במיוחד מסונן באמצעות 0.2 ומיקרו; מסנן M. חיטוי ב-121 מעלות; C למשך יותר מ-20 דקות.</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה במכסה גדול</td><td>labForce (מותג תומאס סיינטיפיק)</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין, הידרוכוריד</td><td>EMD Millipore Corperation</td><td>CAS64-75-5</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר dna וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

קביעת זיקה והתנהגות מחייבת בין אפטמר לבין מטרתו היא השלב המכריע ביותר בבחירת אפטמר ליישום ובשימוש בו. בשל ההבדלים הדרסטיים בין האפטמר למולקולות קטנות, מדענים צריכים להשקיע מאמץ רב באפיון תכונות הקשירה שלהן. קלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) היא גישה רבת עוצמה למטרה זו. ITC חורג מקביעת קבועי ההתנתקות (Kd) ויכול לספק את השינויים האנתלפיים ואת הסטויכיומטריה המחייבת של האינטראקציה בין שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה, כך שהתהליך יכול למדוד ברגישות את הקשירה בין מקרומולקולות לבין המטרות הקטנות שלהן. כאן, המאמר מציג הליך שלב אחר שלב של מדידת ITC של אפטמר נבחר עם מטרה קטנה, טטרציקלין. דוגמה זו מוכיחה את הרבגוניות של הטכניקה ואת הפוטנציאל שלה ליישומים אחרים.

ITC מספק קבוע התנתקות מדויק (Kd), את הסטויכיומטריה המחייבת ואת הפרמטרים התרמודינמיים של אינטראקציות דו-מולקולות6. בדוגמה זו, האפטמר שנבחר על ידי Kim et al.9,11 נקשר לטטרציקלין עם זיקות קשירה של K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. מעניין לציין כי קשירה זו נקבעה באמצעות שיטת סינון שיווי המשקלודיווח על K d של 63.3 ננומטר, שאינו שונה בהרבה מאתר הקשירה החיובי (אתר 2). המוד...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבוע את זיקות הקשירה של אפטמרים כנגד מטרות חופשיות בתמיסה, תוך מתן תובנה לגבי מנגנון הקשירה. מכיוון ש- ITC מודד שינויים בחום עקב קשירה, לא aptamer ולא ligand צריך להיות מתויג או פונקציונלי, כפי שהיה במקרה של טכניקות כגון SPR. משתמשים חדשים צריכים לשים לב למאגרים תואמים בכל רכיבי הכריכה.בנוסף, שימו לב שלטכניקה יש דרישות דגימה גבוהות שעשויות להיות קשות לעמידה עבור ליגנדות גדולות יותר כגון חלבונים. כדי להתחיל, להפעיל את הממברנה של עמודת הדיאליזה, למלא עם מאגר PBS, שיווי משקל במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G במשך 15 דקות. הסר את המאגר וטען 500 מיקרוליטר של דגימות aptamer לתוך העמודה.צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G ולחזור על זה ארבע פעמים כדי להחליף את המאגר המקורי עבור PBS. לאסוף את ה- DNA aptamer dialyzed באמצעות פיפטה ולהעביר אותו לצינור החדש 1.5 מיליליטר. אסוף את מאגר הזרימה האחרון כדי להמיס טטרציקלין.ודא שהמאגר של הניסוי במזרק תואם למאגר בתא הייחוס. קבע שוב את ריכוז האפטמר באמצעות ספקטרומטר הנראה לעין UV. השתמש במאגר החליפין האחרון כדי להתאים את הריכוז לטטרציקלין 40-מיקרומולרי ואפטמר דו-מיקרומולרי.מקפלים את ה-DNA aptamer על ידי חימום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, קירור ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן חוזרים לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. דגה את האפטמר המקופל והטטרציקלין המקופל באמצעות תחנת degassing או משאבת ואקום למשך 25 דקות כדי לחסל גזים מומסים. לאחר ניקוי ואישור ניקיון המכונה, בדוק את דיוק המכונה עם ערכה סטנדרטית הכוללת EDTA וסידן כלורי באמצעות תוכנית ברירת המחדל ופעל לפי הוראות היצרן.הגדר את הפרמטרים הפועלים. בדוק את אמצעי האחסון הדרושים באמצעות מחשבון תוכנית פועלת. עם פרמטר ריצה זה, בצע מדידת ITC עם 230 מיקרוליטרים של טטרציקלין 40-micromolar במזרק ITC ו 485 מיקרוליטר של שני מיקרומולר aptamer בתא מדגם ITC באמצעות ITC.העמיסו את לוחות המזרק טטרציקלין המקופלים ואת האפטמר המקופל לתוך תא הדגימה, תוך הימנעות מבועות, באמצעות פיפטה. התחל להפעיל את מכשיר ה- ITC על ידי לחיצה על התחלה כפתור בתוכנה. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים על ידי לחיצה כפולה כדי להתחיל לנתח את הנתונים.פתח את הנתיב של הנתונים הגולמיים שנשמרו כדי לדעת את הנטייה של כריכה. פתח את הכרטיסיה מידול והשתמש במודלי איגוד שונים כדי למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לעקומת הנתונים. לאחר מכן, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את התרמוגרמה של ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה, אנטרופיה, אנרגיה חופשית, קבוע קשירה של שיווי משקל וסטויכיומטריה.אסוף את הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו מהנתונים וממידע המודל המתאים. צור דוח הכולל תמונות של התרמוגרמה ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים. האפטמר שנבחר על ידי קים, et al נקשר לטטרציקלין עם זיקות מחייבות של קבוע דיסוציאציה אחד שווה 13 מיקרומולר וקבוע דיסוציאציה שני שווה 53 ננו-מולר.המודל המתאים והסטויכיומטריה של ITC משקפים כי האפטמר נקשר לטטרציקלין באמצעות יחס קשירה של 2:1 עם מודל הקשירה הרציפה. הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו על ידי מדידת ITC עבור אתר שני הצביעו על כך שהתגברות על אנתלפיה משמעותית יחסית של אובדן אנטרופי מניעה את הקשירה החזקה. הקשירה מונעת האנתלפיה עם אובדן האנטרופיה מתייחסת לשינויים קונפורמיים של חומצות גרעין, שדווחו כהתנהגויות קשירה בין רנ"א למולקולה קטנה.האפטמר והליגנד חייבים להיות באותו חיץ. יש לקפל מחדש את האפטאמר אם פותח עם refolding, ודגימות חייבות להיות degassed. טיפול בשיקולים אלה יבטיח שרק אינטראקציות אפטמר-ליגנד יתרמו לאות הנמדד.בשל גודלו של יעד האפטמר, שיטת מעקב מתאימה יכולה להיות תרמופורזה בקנה מידה זעיר כדי לאשר את זיקת הקשירה הנמדדת ללא תמיסה.

determining-thermodynamic-kinetic-association-dna-aptamer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

סרטון זה מתאר אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית בעלת ביצועים גבוהים המסייעת לנטר את האינטראקציה בין גורמי שעתוק לדנ"א. הבדיקה מנטרת את האינטראקציות של מולקולת DNA עם תווית פלואורופור עם גורם השעתוק הספציפי שלה על ידי מדידת מידת הקיטוב עקב סיבוב מולקולרי או אנאיזוטרופיה של ה- DNA המסומן פלואורופור.

אנאיזוטרופיה פלואורסצנטית לקביעת גורם שעתוק-זיקה לקשירת DNA

סרטון זה מדגים קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית — טכניקה לחקר האינטראקציה בין ביומולקולה לליגנד. הקישור של אפטמר DNA וליגנד תרמולבילי נחקר על ידי החלת מחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים על הדגימה וקבלת סריקות לאנליזה תרמודינמית.

סריקה דיפרנציאלית קלורימטריה לחקר DNA Aptamer-Thermolabile Ligand אינטראקציה

זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטית של urease שעועית שקע.

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

MicroScale Thermophoresis (MST) היא טכנולוגיה רגישה לאפיון אינטראקציות aptamer-מטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול MST לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולות קטנות.

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

כאן אנו מציגים שיטה לקביעת הזיקות מחייב שיווי משקל ועל בתמיסה עם רגישות גבוהה בקנה מידה גדול. זה משפר את ניתוח כמותי של שעתוק מקדם-DNA מחייב. השיטה מבוססת על מידות חיזקו פלורסצנטיות אוטומטי מערכת מבוקרת.

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.

זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

הפרוטוקול מציג שתי שיטות לקביעת הקינטיקה של הרנ"א הפלואורוגני אפטאמרים תרד2 וברוקולי. השיטה הראשונה מתארת כיצד למדוד קינטיקה פלואורוגנית של אפטמר במבחנה באמצעות קורא צלחת, ואילו השיטה השנייה מפרטת את מדידת הקינטיקה הפלואורוגנית של אפטמר בתאים על ידי ציטומטריה של זרימה.

קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים

חקור את הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לנתח אפיניות קשירה ללא צורך בסימון.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

גלה סרטונים נוספים