Name: שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: חקור מנגנוני תנועה תאית באמצעות שחזור תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להעריך ייצור כוח ביופיזיקלי וללמוד על דינמיקת חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בכנות לחברי הבית החדש שלנו ב- LPENS על קבלת הפנים החמה שלהם, ובמיוחד לצוות ABCDJ על כל עזרתם ותמיכתם. J.P. מאשרת תמיכה כספית מהקרן ARC (מענק PJA 20191209604), ו- C.S. מאשרת תמיכה כספית מארגון תוכנית המדע של גבולות האדם (מענק RGP0026/2020).

<ol><li>Campellone, K. G., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleator+arms+race%3A+cellular+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A nucleator arms race: cellular control of actin assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li>
<li>Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics%2C+architecture+and+mechanics+in+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility.</a> Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).</li>
<li>Tilney, L. G., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wily+ways+of+a+parasite%3A+induction+of+actin+assembly+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria.</a> Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).</li>
<li>Moore, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cables+and+comet+tails+organize+mitochondrial+networks+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis.</a> Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).</li>
<li>Taunton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+propulsion+of+endosomes+and+lysosomes+by+recruitment+of+N-WASP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP.</a> Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).</li>
<li>Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+roles+of+actin+in+C.+elegans+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis.</a> BMC Developmental Biology. 7, 142(2007).</li>
<li>Merrifield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+vesicles+move+at+the+tips+of+actin+tails+in+cultured+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells.</a> Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).</li>
<li>Samarin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+VASP+enhances+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How VASP enhances actin-based motility.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).</li>
<li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li>
<li>Boujemaa-Paterski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+heterogeneity+regulates+steering+in+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility.</a> Nature Communications. 8 (1), 655(2017).</li>
<li>Akin, O., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+protein+increases+the+rate+of+actin-based+motility+by+promoting+filament+nucleation+by+the+Arp2%2F3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex.</a> Cell. 133 (5), 841-851 (2008).</li>
<li>Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+PIP2%2C+ADP-actin+monomers%2C+and+capping+protein+regulate+the+activity+and+localization+of+yeast+twinfilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin.</a> Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).</li>
<li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+or+myosin+contraction%3A+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005(2013).</li>
<li>Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+generated+during+actin-based+propulsion%3A+a+direct+measurement+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).</li>
<li>Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%3A+protein+structure+and+filament+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin: protein structure and filament dynamics.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).</li>
<li>Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+actin-based+motility+of+Listeria+and+Shigella+using+pure+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins.</a> Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).</li>
<li>Reymann, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+branched+actin+filament+networks+by+stochastic+fragmentation+with+ADF%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variations+with+pH+of+Actin+Depolymerizing+Factor%2FCofilin%27s+multiple+actions+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin's multiple actions on actin filaments.</a> Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Plastino, J., Blanchoin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stability+of+the+actin+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic stability of the actin ecosystem.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 219832(2019).</li>
<li>Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+actin+filament+dynamics+in+nonmuscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).</li>
<li>Suarez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+regulates+F-actin+network+homeostasis+by+favoring+formin+over+Arp2%2F3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex.</a> Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).</li>
<li>Courtemanche, N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+profilin+with+the+barbed+end+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments.</a> Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).</li>
<li>Achard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bprimer%26%2334%3B-based+mechanism+underlies+branched+actin+filament+network+formation+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility.</a> Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).</li>
<li>Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+up+against+a+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin filaments up against a wall.</a> Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).</li>
<li>vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+release+drives+symmetry+breaking+for+actin-based+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).</li>
<li>McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -K., Simonetti, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelsolin+family+of+actin+regulatory+proteins%3A+modular+structures%2C+versatile+functions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions.</a> FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).</li>
<li>Abou-Ghali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+protein+is+not+necessary+for+polarized+actin+network+growth+and+actin+based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).</li>
<li>Yarar, D., D'Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+determinants+in+WASP+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Motility determinants in WASP family proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).</li>
<li>Padrick, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+regulation+of+WASP%2FWAVE+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins.</a> Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).</li>
<li>Bussonier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+detection+of+a+long-range+actin+network+emanating+from+a+biomimetic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex.</a> Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).</li>
<li>Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformations+in+actin+comets+from+rocketing+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Deformations in actin comets from rocketing beads.</a> Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים עם התוכן של מאמר זה.

הפרוטוקול המפורט כאן מתאר כיצד להשיג גידול רשת אקטין על משטחי חרוזים, היווצרות כוכבי שביט ותנועתיות חרוזים באמצעות חלבונים זמינים מסחרית. עם זאת, לעתים שביטים אינם נצפים באופן משוחזר או שאינם הומוגניים בין המגלשה לכיסוי. הדיון הבא מדגיש כמה נקודות מפתח בפרוטוקול ומציע כמה פרמטרים שניתן להתאים. גורם אחד שיש לזכור הוא שהיווצרות השביט ומהירות החרוזים מושפעים מהטמפרטורה, כאשר הטמפרטורות הרבה מעל 25 מעלות צלזיוס או הרבה מתחת ל-23 מעלות צלזיוס משפיעות לרעה על היווצרות השביט ונותנות נתונים בלתי ניתנים לשחזור. מומלץ מאוד להשתמש במיקרוסקופ מבוקר טמפרטורה או במיקרוסקופ בחדר עם בקרת אקלים. אף על פי שאקטין המסומן באופן פלואורסצנטי נכלל לעתים קרובות בתערובת התנועתיות כדי לצפות בשביטים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ברגע שכוכבי שביט הם באורך של יותר מקוטר חרוז, הם נראים גם על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ככתם כהה ליד החרוז. הדמיה של ניגודיות פאזה מתאימה יותר להדמיה בהילוך מהיר מכיוון שחלק מהפוטוטוקסיות קשורה להדמיה פלואורסצנטית אפילו באמצעות דיסק מסתובב. מכיוון שחרוזים שוקעים עם הזמן, מיקרוסקופ הפוך מייצר פחות סחף חרוזים אופקי מאשר סחף חרוזים זקוף והוא מתאים יותר לסרטים. השימוש ב-VALAP מותך לאיטום מגלשות חשוב מכיוון שחומרים כמו לק מפריעים להיווצרות כוכב שביט. ניתן להכין כמויות גדולות של VALAP בכוס, ולאחר מכן להוציא אותן החוצה כדי למלא כוסות קטנות יותר המתאימות יותר להמסה מהירה. VALAP טוב לשנים בטמפרטורת החדר.
היבט טכני מרכזי נוסף הוא הכנת תערובת חציצה ותנועתיות מוקפדת. יש להיזהר בעת הכנת MB13, במיוחד בשלב התאמת ה- pH. יש לכוונן את ה-pH של MB13 במהירות לניטרלי עם NaOH כדי למנוע הידרוליזה של ATP, אך לא מהר מדי מכיוון שה-EGTA מתמוסס ככל שה-pH מתקרב לנייטרלי. EGTA הוא מרכיב מפתח מכיוון שהוא קומפלקס את הסידן הקשור לאקטין, ומעניק לתערובת התנועתיות את צורת המגנזיוםהפעילה יותר 16. MB13 שהוכן מהר מדי או לאט מדי נותן היווצרות שביט לא אופטימלית או אפילו בכלל לא. נקודת מפתח נוספת היא לעקוב בקפידה אחר ריכוז KCl בתמהיל התנועתיות כאשר משחקים עם תנאים. לדוגמה, כאשר משתמשים ב-1x MB13 בתמהיל התגובה ומדללים פרופילין, חלבון מכסה וקומפלקס Arp2/3 ב-MB13, ריכוז ה-KCl הסופי בתגובת התנועתיות הוא כ-40-50 mM עקב דילול על ידי G-buffer. ריכוז זה נותן את התוצאות הטובות ביותר בבדיקת השביט, וכל יותר מ-60 mM KCl מקטין את פעילות הגרעין המורכבת של Arp2/3.
בצד החלבונים של הדברים, היבט טכני קריטי בהשגת שביטים אקטין הוא טיפול נכון בחלבונים קושרי אקטין מסחריים, בפרט צנרת מדויקת של כמויות מיקרוליטר. הלינאריות של העקומה הסטנדרטית של ברדפורד היא מבחן טוב של פיפטינג ואז העקומה יכולה לשמש למדידות שגרתיות של ריכוזי חלבונים. ואכן, בעת שימוש בחלבונים מסחריים שעברו החייאה לצורך הליך השביט, חשוב תמיד לאמת את ריכוזי החלבונים, שכן השתנות אצווה וטעות משתמש במהלך ההדחה מחדש יכולות להוביל להבדלים בין ריכוזים אמיתיים וצפויים. לפעמים הבדלים קטנים בריכוזי החלבון יכולים להוביל להיעדר מוחלט של כוכבי שביט.
היבט חשוב נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש ב-G-actin המורכב מפרופילין כדלק לפילמור. מבחינה היסטורית, מערכות במבחנה השתמשו באקטין נימה טרום-פולימרית (F-actin) כמקור לאקטינים: דה-פולימריזציה בפולימריזציה בתפזורת על פני השטח10,17. זה היה היתרון של שליטה ברמות G-actin, אבל הוסיף שכבה של מורכבות הדורשת רכיבים נוספים כדי לזרז דה-פולימריזציה. מכיוון שתחלופה של רשת האקטין אינה הכרחית לייצור כוח ותנועתיות, המונעים על ידי נוקלאציה ופילמור על פני השטח של החרוז, בעוד שגורמי דה-פולימריזציה של אקטין כגון ADF/cofilin פועלים על הרשתות המיושנות הרחוקות מפני השטח18, רוב השיקום במבחנה של תנועתיות מבוססת אקטין נעשה כיום ללא תחלופה לצורך פשטות. עם זאת, ישנם כמה חסרונות לשימוש ב- G-actin. ראשית, בעת שימוש באקטין מסחרי, אשר עבר lyophilized, אוליגומרים נוכחים. שלבי הדה-פולימריזציה המתוארים כאן חשובים מאוד בהשגת תוצאות הניתנות לשחזור. בפרט, למרות ש-G-buffer מותאם באופן מסורתי ל-pH 8, נראה כי pH נמוך יותר (pH 7, למשל) פועל טוב יותר במבחנים המתוארים במאמר זה, אולי משום ש-pH נמוך משפר את הדה-פולימריזציה19. חסרון נוסף בשימוש ב- G-actin הוא שברגע שמניחים בתנאי מלח המתירים לפילמור, מתרחשת נוקלאציה ספונטנית וצורות F-אקטין בתפזורת כמו גם על פני החרוז. שילוב G-actin עם פרופילן מדכא נוקלאציה ספונטנית בפולימריזציה של הקצה בתפזורת ובקצה, ובכך ממקד הן את הנוקלאציה והן את פילמור הקצה על פני השטח20. פרופילין-G-אקטין רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, שכן חלק גדול מהאקטין בתא נמצא בצורה זו21. כאן, יחס של 1:1 של פרופילין:אקטין משמש; עם זאת, יחסים גבוהים יותר (לדוגמה 3:1) מעכבים באופן יסודי יותר פילמור בתפזורת, אם כי יחסים גבוהים יותר מעכבים גם את קומפלקס Arp2/3 ואת התארכות הקצה של התיל במידה מסוימת22,23.
פעילות ה-Capping היא גם המפתח להיווצרות כוכבי שביט, שכן היא מבטיחה החדרה של אקטין חדש לפני השטח באמצעות מחזורי נוקלאציה על ידי קומפלקס Arp2/3 המופעל על פני השטח24,25. ללא כיסוי, ענני אקטין אינם שוברים את הסימטריה כדי ליצור כוכבי שביט מכיוון שפילמור על פני השטח אינו בונה מספיק מתח כדי לשבור את הענן26. בעבר, השתמשנו בחלבון13 של עכברים רקומביננטיים מטוהרים בבית, אך בדיקות שבוצעו עבור מאמר זה מצביעות על כך שחלבון רקומביננטי זמין מסחרית של כמוסות אנושיות יעיל באותה מידה, כמו גם ג'לסולין זמין מסחרית, אם כי יש להשתמש בגלסולין פי 10 יותר, ועבור יישומים מסוימים, ייתכן שהוא אינו מתאים מכיוון שיש לו פעילות ניתוק אקטין כמו גם capping27.
לבסוף, החוסן של שיטה זו טמון בשימוש במפעיל קומפלקס Arp2/3 פעיל מאוד, סטרפטאבידין-pVCA (SpVCA)28. SpVCA כולל את תחום הקישור פרופילין-G-אקטין של WASP (תחום p) בנוסף לתחום הקישור המורכב Arp2/3 מכיוון שנמצא כי זה יעיל ביותר בתנאי פרופילין-G-אקטין29. חשוב מכך, לשימוש בתג סטרפטאווידין, שהוצג במקור כדי לאפשר פונקציונליזציה של פני השטח באמצעות קישור ביוטין-סטרפטאווידין, יש השפעה נוספת של הגדלת ההפעלה המורכבת של Arp2/3, ככל הנראה בשל העובדה שסטרפטווידין הוא טטרמר ובכך מקבץ את המפעיל, הידוע כמגביר את הפעילות המורכבת של Arp2/330 . SpVCA בייצור מסחרי נמצא כעת בפיתוח ובקרוב יהיה זמין לרכישה. עוד יש לציין כי למרות ש-40 μL של 2 μM SpVCA משמשים באופן שגרתי לציפוי 3 ס"מ2 של משטח חרוז, ריכוזי ציפוי אחרים (גבוהים ונמוכים יותר) פועלים גם הם, ומשחק בתנאים אלה נותן מהירויות גדילה ומורפולוגיות שונות של שביט. ואכן, כאשר שביטים אינם נוצרים או שגודל השביט אינו הומוגני בשקופית, יש לבדוק תנאי ציפוי שונים, כמו גם ריכוזי KCl ופרופילינים שונים בתערובת התנועתיות. ניתן גם לשנות את ריכוזי האקטין, קומפלקס Arp2/3 וחלבון המכסה בתערובת התנועתיות כדי לייעל את היווצרות השביט, אך בידינו, שינוי פרופורציות אלה נותן לעתים קרובות תוצאות מבלבלות.
לסיכום, השיטות המתוארות כאן מייצרות הרכבה של אקטין על משטחי חרוזים ותנועתיות, אך ניתן להשתמש בכל משטח שניתן לתפקד באמצעות SpVCA. במקרים בהם ספיחה כפי שמתואר כאן אינה פועלת, ניתן להשתמש ב-streptavidin moiety כדי להצמיד את SpVCA לפני השטח של העניין לאחר ביוטינילציה. מבני האקטין שנוצרו כך, שביטים או אחרים, יכולים לשמש לבדיקת היבטים ביוכימיים וביופיזיים שונים של רשתות אקטין, והם מתאימים במיוחד למניפולציות פיזיקליות עם מיקרופיפטים, פינצטה אופטית ואבלציות לייזר 15,26,31,32. בנוסף לשימושיה לקהילת המחקר, הגישה המתוארת כאן מתאימה ככלי הוראה לתלמידי תואר ראשון בביופיזיקה לחקור מושגים של חומר פעיל כגון שבירת סימטריה וארגון עצמי.

פילמור אקטין בתאים נשלט מרחבית וזמנית על ידי ויסות הדוק של נוקלאציה של חוטי אקטין במורד הזרם של איתות תאי1. נוקלאציה מתרחשת באמצעות היווצרות של טרימר אקטין, ואז שני הקצוות של הנימה המתהווה מתפלמרים באופן ספונטני, אם כי קצה אחד הוא דינמי יותר (הקצה התורן) מאשר השני (הקצה המחודד)2. כאשר נוקלאציה ופולימריזציה של קצה תיל מכוונות אל פני השטח, הן מייצרות מספיק כוח (בתחום פיקו-לננו-ניוטון) כדי לדחוף החוצה את קרום התא לתנועה ולהזיז עצמים בגודל מיקרון בתוך התא עם הידרוליזה ATP כמקור האנרגיה3. כמה דוגמאות כוללות חיידקי ליסטריה מונוציטוגנים המשתמשים בשביטים אקטין כדי להתפשט מתאים לתא, ומיטוכונדריה, שבה תנועה מבוססת שביט אקטין חשובה לתורשה אקראית במהלך מיטוזה 4,5. שביטים של אקטין על אנדוזומים ושלפוחיות תוך-תאיות אחרות מעורבים בניתוק מהממברנות התורמות 6,7,8.
בשיטה המוצגת כאן, עוקפים את היבטי האיתות של פילמור אקטין תאי, ופולימריזציה של אקטין מיוצרת על חרוזי פוליסטירן מיקרומטריים על ידי ציפוים במפעילים של גרעין אקטין מסועף, במיוחד התחום הפעיל של חלבון ה-WASP האנושי, VCA (המכונה גם WA או WCA)1. החרוזים המצופים מודגרים לאחר מכן בתערובת המכילה את המרכיבים הדרושים לפולימריזציה של אקטין, כולל גרעין הפילמור העיקרי של אקטין בתאים, קומפלקס Arp2/3, המופעל על ידי VCA במשטח החרוזים ליצירת חוטים חדשים כענפים מדפנות חוטי הבת1. אקטין בתחילה מתפלמר באופן אחיד סביב החרוז, אך לאחר מכן שובר באופן ספונטני את הסימטריה כדי ליצור שביט אקטין שדוחף את החרוז קדימה, ובכך יוצר מחדש רשתות בליטות דמויות תאים ושביטים באופן מבוקר. גישות דומות עם חרוזים ומשטחים מצופים אחרים שימשו בעבר על ידינו ועל ידי אחרים כדי לחקור את הביוכימיה והביופיזיקה של פולימריזציה של אקטין 9,10,11,12, אך מומחיות נרחבת בחלבונים קושרי אקטין נדרשה לניסויים אלה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ליצור באופן יציב כוכבי שביט אקטין ותנועתיות לחלוטין עם ריאגנטים זמינים מסחרית (או בקרוב יהיו זמינים), מה שהופך גישה זו לנגישה לכל אחד, כולל במסגרת חינוכית להוראת מושגים ביופיזיים. התכונות העיקריות כוללות את החשיבות של פיפטינג עדין ואמין, השימוש במונומר מורכב פרופילין כמקור אקטין, ואת החיוניות של שימוש פעיל מאוד Apr2/3 קומפלקס activator כמו ריאגנט ציפוי חרוזים.

<table><tbody><tr><td>אקטין, שריר ארנב, מצומד Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>A12373 (הופסק לאחרונה)</td><td>ניתן להחליף מוצר זה ב-ATTO-488 אקטין מבית Hypermol.</td></tr><tr><td>אקטין, שריר ארנב, ATTO-488</td><td>Hypermol</td><td>8153</td><td></td></tr><tr><td>אקטין, שריר השלד של ארנב</td><td>שלד ציטולוגי</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Arp2/3 קומפלקס</td><td>שלד ציטו</td><td>RP01P</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>ביוספקטרומטר, בסיסי</td><td>Eppendorf</td><td>035739</td><td></td></tr><tr><td>ברדפורד ריאגנט</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>BSA, איכות גבוהה</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>BSA סטנדרטי 2 מ"ג/מ"ל (פירס)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מכסה (a1b2, רקומביננטי לעכבר)</td><td>מטוהר ביתי (התייחסות 13)</td><td></td><td>מוצר זה יהיה זמין בקרוב מסחרית מ-Cytoskeleton.</td></tr><tr><td>חלבון מכסה (a1b2, רקומביננט אנושי)</td><td>קוביית Hypermol</td><td>8322</td><td></td></tr>, <tr><td>GFP: U-MNIBA3 או U-MWB2</td><td>Olympus</td><td>הופסק</td><td>ניתן להשתמש בכל קוביית GFP, המותאמת למיקרוסקופ בו נעשה שימוש.</td></tr><tr><td>בלוק יבש, מעורר: ThermoMixer C (מקורר)</td><td>Eppendorf</td><td>035963</td><td></td></tr><tr><td>** עם SmartBlock, 24 מיקרו-צינורות 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>035969</td><td></td></tr><tr><td>Gelsolin (רקומביננט אנושי, His-tagged)</td><td>שלד תא</td><td>HPG6</td><td></td></tr><tr><td>לנולין</td><td>סיגמא</td><td>49909</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 5427R + רוטור</td><td>Eppendorf</td><td>934126</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ, זקוף: BX51</td><td>Olympus</td><td>הופסק</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ זקוף אפיפלואורסצנטי המצויד באופטיקה של ניגודיות פאזה.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ, הפוך: IX70</td><td>Olympus</td><td>הופסק</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי המצויד באופטיקה של ניגודיות פאזה.</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>סיגמא</td><td>76244</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי נפט: וזלין</td><td>סיגמא</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות מחקר פלוס</td><td>פיפטות אפנדורף</td><td></td><td>גילסון לא עובדות טוב למשלוח של נפחים קטנים מאוד (0.5 ומיקרו; L למשל).</td></tr><tr><td>**10 ומיקרו; L</td><td></td><td>933954</td><td></td></tr><tr><td>**2.5 ומיקרו; L</td><td></td><td>933953</td><td>שני הגדלים הללו חיוניים, אך מומלץ להשתמש בפיפטות איכותיות (סט מלא של Research Plus למשל).</td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן קרבוקסילאט</td><td>Polysciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>**כ-1 ומיקרו; קוטר</td><td></td><td>מ' 08226</td><td></td></tr><tr><td>**כ. 4.5 ומיקרו; קוטר</td><td></td><td>m 17140-5</td><td></td></tr><tr><td>פרופילין 1 (רקומביננטי אנושי, לא מתויג)</td><td>שלד ציטו</td><td>PR02</td><td></td></tr><tr><td>SpVCA (תחום WASP pVCA אנושי, N-ter His-tag, תג סטרפטווידין C)</td><td>מטוהר ביתי (התייחסות 14)</td><td></td><td>מוצר זה יהיה זמין בקרוב מסחרית מ-Cytoskeleton.</td></tr><tr><td>VCA (תחום VCA אנושי של WASP, מתויג GST)</td><td>שלד ציטו</td><td>VCG03</td><td></td></tr></tbody></table>

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

תנועות תאים רבות ושינויי צורה וסוגים מסוימים של תנועתיות חיידקית ואברונית תוך-תאית מונעים על ידי אקטין ביופולימרי היוצר רשת דינמית על פני התא, האברון או החיידק. הבסיס הביוכימי והמכני של ייצור כוח בתהליך זה ניתן לחקור על ידי שכפול תנועה מבוססת אקטין באופן תאי על משטחים אינרטיים כגון חרוזים פונקציונליים ודגירה עם קבוצה מבוקרת של רכיבים. בתנאים המתאימים, רשת אקטין אלסטית מתכנסת על פני החרוזים ונפתחת עקב הלחץ שנוצר על ידי צמיחת הרשת, ויוצרת "שביט אקטין" המניע את החרוז קדימה. עם זאת, ניסויים כאלה דורשים טיהור של שורה של חלבונים קושרי אקטין שונים, לעתים קרובות לשים אותם מעבר להישג ידם של שאינם מומחים. מאמר זה מפרט פרוטוקול להשגת שביטים אקטין ותנועתיות של חרוזים באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית. ניתן לשנות את ציפוי החרוזים, גודל החרוזים ותערובת התנועתיות כדי לבחון את ההשפעה על מהירות החרוזים, מסלולים ופרמטרים אחרים. בדיקה זו יכולה לשמש לבדיקת הפעילות הביוכימית של חלבונים קושרי אקטין שונים, ולביצוע מדידות פיזיקליות כמותיות השופכות אור על תכונות החומר הפעיל של רשתות אקטין. זה יהיה כלי שימושי עבור הקהילה, המאפשר לחקור תנועתיות מבוססת אקטין במבחנה ללא ידע מקצועי בטיהור חלבונים קושרי אקטין.

אחד ההיבטים המרכזיים של יצירת שביטים אקטין על חרוזים הוא פיפטינג עדין ומדויק של חלבונים עדינים הקושרים אקטין. יצירת עקומה סטנדרטית של ברדפורד היא דרך טובה להעריך מיומנויות פיפטינג. איור 1A,B מראה את הצינורות עבור העקומה הסטנדרטית ודוגמה לאופן שבו שני הדילולים הסדרתיים של BSA נראים פעם מעורבבים עם מגיב ברדפורד. שימו לב לגוון הכחול המדורג (ריכוז חלבון גבוה יותר נותן פתרון כחול יותר). כאשר קוראים אותם בספקטרופוטומטר ומתווים אותם, הפתרונות האלה נותנים עקומה סטנדרטית כפי שמוצג באיור 1C. כדי לתרגל פיפטציה זהירה, יש לחזור על הבדיקה עד שגורם המתאם הליניארי הוא 0.999, כפי שמוצג.
לאחר שהריכוזים של חלבונים מסחריים שעברו החייאה הוערכו בקפידה באמצעות מבחן ברדפורד, חרוזים מצופים ותערובת תנועתיות מוכנים ומעורבבים יחד. איור 2A מציג תמונות מייצגות של השלבים השונים של היווצרות כוכבי שביט: ענני אקטין נוצרים תוך דקות מרגע ערבוב חרוזים מצופים SpVCA ומדיום תנועתיות; קיטוב עננים מתרחש ב~5 דקות וייצור כוכבי שביט ב-15-20 דקות. כוכבי השביט של אקטין, הנראים הן באמצעות אפיפלואורסצנציה והן באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (איור 2A), ממשיכים להתארך במשך שעות רבות, אך מהירות עקבית אינה נשמרת ולכן תנועתיות החרוזים מוערכת בדרך כלל תוך שעה. מצד שני, נדרשות 30 דקות עם חרוזים מצופים VCA כדי לקבל ענני אקטין בהירים (איור 2B), ולא נוצרים כוכבי שביט, למרות שהסימטריה מתחילה להישבר בשעה 1-2 שעות (חץ באיור 2B) ועננים מראים קיטוב לאחר דגירה במהלך הלילה.
איור 3 מראה דוגמה להערכת מהירות חרוזים בנוכחות חלבון מכסה. מאחר שכל החרוזים שוברים את הסימטריה בערך באותו הזמן, מתבצעות הקלטות "פסאודו-קיטועי זמן" שבהן השקופית נסרקת ותמונות של כל אוכלוסיית השביטים נלקחות לאורך זמן (איור 3A). כוכבי שביט אינם מתפרקים; לכן, ניתן להשתמש בעלייה באורכי השביט שנמדדה לאורך זמן כדי לחשב את מהירות התזוזה (איור 3B). ניתן להשתמש בגלסולין במקום חלבון מכסה ליצירת שביט אם מוסיפים פי 10 יותר ג'לסולין כדי לפצות על פעילות המכסה המופחתת שלו. כוכבי שביט הנוצרים בנוכחות ג'לסולין זהים מבחינה איכותית ונעים בערך באותן מהירויות כמו חרוזים עם חלבון מכסה (איור 3C). פעילות ה-Capping היא המפתח לריכוז הפילמור על פני השטח של החרוז, וכאשר לא חלבון מכסה ולא ג'לסולין נכללים בתערובת התנועתיות, ענני אקטין לעולם אינם מקטבים ויוצרים כוכבי שביט, למרות שענני אקטין בהירים נוצרים סביב החרוזים (איור 3D). שביטים על חרוזים יכולים לשמש למדידת ייצור כוח מבוסס אקטין בהקשרים ביוכימיים שונים על ידי שינוי תמהיל התנועתיות והתבוננות בתוצאה על תנועתיות באמצעות טכניקות מיקרומניפולציה שונות, למשל15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig01.jpg"> איור 1: עקומה סטנדרטית של ברדפורד. (A) תמונה של אופן הגדרת הצינורות ליצירת עקומת תקן ברדפורד. צינורות דגימה אינם מוצגים. (B) תמונה של שני דילולים סדרתיים חופפים של BSA שפעם התערבבו עם מגיב ברדפורד. (C) הספיגה ב-600 ננומטר של התמיסות המוצגות ב-(B) נמדדת בספקטרופוטומטר ומשורטטת כפונקציה של ריכוזי החלבונים של תמיסות ה-BSA. ההתאמה הליניארית משמשת לחישוב ריכוז הדגימה. גורם המתאם, R, של ההתאמה הליניארית הוא 0.999. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig02.jpg"> איור 2: היווצרות שביט על חרוזים מצופים SpVCA בניגוד לחרוזים מצופים VCA. (A) חרוזים מייצגים מצופים SpVCA (חרוזים שונים בכל תמונה) המוצגים לאורך זמן. זמן מרגע הערבוב מצוין. ענני אקטין נוצרים מיד, וקיטוב עננים נותן כוכבי שביט, שממשיכים להתארך במשך שעות. (B) חרוזים מייצגים מצופים VCA (חרוזים שונים בכל תמונה) המוצגים לאורך זמן. יותר משעה יש צורך לראות את התחלות הקיטוב של ענן אקטין (חץ) ואפילו דגירה ארוכה אינה מייצרת כוכבי שביט. כל התמונות הן של חרוזים בקוטר 4.5 מיקרומטר, הדמיה אפיפלואורסצנטית של אקטין פלואורסצנטי בשילוב עם הדמיית ניגודיות פאזה עבור נקודות זמן של 15 ו-20 דקות ב-(A), פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig03.jpg"> איור 3: ניתוח מהירות שביטים וחרוזים . (A) ו-(C) בנוכחות חלבון מכסה (CP) או גלסולין, ענני אקטין מקוטבים ליצירת כוכבי שביט ב-20 הדקות הראשונות של התגובה, ושביטים מתארכים עם הזמן. זמן מערבוב המצוין עבור כל תמונה; כל תמונה היא חרוז אחר. קיימת שונות מסוימת בין החרוזים וההכנה, אך בממוצע חרוזים נעים במהירויות של מיקרון/תת-מיקרון לדקה (0.2-1 מיקרומטר/דקה) בתנאים הסטנדרטיים שתוארו כאן. (B) גרף מייצג המציג הערכה של אורך השביט (כל אוכלוסיית החרוזים) לאורך זמן. השיפוע של המתאם הליניארי מתאים למהירות התזוזה הממוצעת, במקרה זה 0.24 מיקרומטר לדקה. (D) בהיעדר פעילות מכסה (ללא חלבון מכסה או ג'לסולין), ענני אקטין נוצרים סביב חרוזים, אך כוכבי שביט אינם נוצרים. כל התמונות הן של חרוזים בקוטר 4.5 מיקרומטר, הדמיה אפיפלואורסצנטית של אקטין פלואורסצנטי, פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

עם תערובת פשוטה של מרכיבים ומשטחים פונקציונליים, פרוטוקול זה משחזר פונקציה חיונית של תאים, תנועה המופעלת על ידי הרכבת אקטין. ניתן להעריך את המנגנונים הביוכימיים והביופיזיים של ייצור הכוח על ידי שינוי תערובת המרכיבים ותכונות המשטח הפונקציונלי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שניתן לרכוש את כל המרכיבים, ולכן אין צורך במומחיות בטיהור חלבונים.זה מאפשר למי שאינו מומחה להשתמש במערכת זו ככלי במחקר שלהם. פרוטוקול זה מספק מודול הוראה ברמה של תואר ראשון, המעניק לסטודנטים התנסות מעשית במניפולציה של חלבונים והתבוננות במערכת ביולוגית מוכנה עצמית תחת המיקרוסקופ. הם יכולים לשלוט ולגוון פרמטרים של המערכת.אנליזה פיזיקלית, כגון משוואת לאנגמיור, יכולה לרוץ על מסלולים. התחילו בהחייאת חלבונים ליופיליים. אספו את המוצק בתחתית הצינור על ידי פולסים של אבקות חלבון צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן מוסיפים מים לפי הוראות היצרן ודוגרים על קרח למשך 15 דקות לפחות. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. שומרים על הקרח עוד 15 דקות ומערבבים שוב.לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה. רמיקס, ואליקוט על הקרח. כדי לבצע דה-פולימריזציה של אוליגומרים של אקטין שנוצרו במהלך ליופיליזציה והקפאה, יש לדלל אליקוט של אקטין שעבר החייאה פי שמונה ב-G-buffer עם תוספת ATP, DTT ואקטין מסומן ב-10%.אפשרו לו לבצע דה-פולימריזציה על הקרח עם ערבוב מזדמן במשך כמה ימים עד שבוע לפחות לפני מדידת ריכוז החלבון. כדי למדוד את ריכוזי החלבונים של חלבונים שעברו החייאה, הכינו תחילה סדרת דילול BSA. התחל על ידי הצבת שני צינורות מיליליטר ו 1.5 מיליליטר במדף כמתואר בכתב יד.מלאו צינור חרוטי של 15 מיליליטר למעלה עם מגיב ברדפורד והניחו אותו על קרח. קח 200 מיקרוליטרים של מגיב ברדפורד ופלט אותו בחזרה לתוך הצינור החרוטי כדי להרטיב את קצה הפיפטה. מכיוון שהתמיסה צמיגה, פיפטה לאט כדי לאפשר לתמיסה להיכנס ולצאת מהקצה לחלוטין מבלי ליצור בועות.לאחר מכן באמצעות הקצה הרטוב מראש, פיפטה 200 מיקרוליטר של Bradford Reagent לתוך כל אחד צינורות 1.5 מיליליטר במדף. ולהחזיר את התוכן הנותר של צינור חרוטי 15 מיליליטר לבקבוק. מדוד את המים לתוך שני צינורות מיליליטר של שורות אחת, שלוש, וחמש.הכן את סדרת דילול BSA על-ידי דילול תמיסת מלאי BSA מכוילת כמתואר בכתב היד. לאחר מכן לבצע דילולים סדרתיים על ידי העברת 900 microliters של כל פתרון לתוך הצינור הבא. הוסף 800 מיקרוליטר של מים לצינור הריאגנט של ברדפורד עבור הריק והפעל את הטיימר.מערבבים 800 מיקרוליטרים מכל תקן BSA עם 200 מיקרוליטרים של מגיב ברדפורד בצינורות המוכנים. תוך חמש דקות לאחר הערבוב עם הריאגנט של ברדפורד או כל תקן בקובט חד פעמי קראו את הספיגה ב-600 ננומטר. גרף את ערכי הספיגה המתקבלים כפונקציה של ריכוז BSA ידוע וקבל מתאם ליניארי עם ערך R של 0.99.בצינורות המכילים 2000 מיקרוליטרים של מים, מדללים בעדינות חלבונים שעברו רזולובילציה כפי שמתואר בכתב היד. מיד להוסיף 800 microliters של כל פתרון ריאגנט ברדפורד מוכן לערבב. קרא את הספיגה בספקטרופוטומטר תוך חמש דקות.חשב את ריכוזי החלבונים באמצעות העקומה הסטנדרטית שנבנתה בעבר. לציפוי חרוזים, מצננים מראש את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס. פיפטה 50 מיקרוליטר של חיץ Xb לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.ערבבו היטב מתלי חרוזים בקוטר 4.5 מיקרומטר על ידי מערבולות והוסיפו תשעה מיקרוליטרים של המתלה לצינור המכיל חיץ Xb. צנטריפוגה דגימות ב 20, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לצפות את החרוזים, הסר בזהירות את הסופר-נאטנט מבלי להפריע לחרוזים ושלח מחדש את כדור החרוזים ב-40 מיקרוליטרים של שני מיקרומולרים SpVCA במאגר Xb על ידי פיפטינג עדין.עכשיו להתסיס את החרוזים בבלוק יבש ב 1000 סל"ד במשך 20 דקות ב 18 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את החרוזים המצופים על ידי צנטריפוגה. הסרת הסופר-נאטנט והחייאת החרוזים ב-50 מיקרוליטרים של Xb קר עם 1% BSA.לאחר שטיפת החרוזים, יש למרוח את גלולת החרוזים המצופה ב-120 מיקרוליטר של Xb קר, 1% BSA. יש לאחסן על קרח במקרר או בחדר קר. הכינו את תערובת תגובת התנועתיות כמתואר בכתב היד.ערבבו במהירות את התגובה והפעילו את הטיימר. זהה את כל תערובת תגובת התנועתיות בשקופית. כסו אותו בכיסוי של 18 מילימטר על 18 מילימטר ואטמו את הכיסוי עם VALAP מומס באמצעות מכחול קטן.כדי להשיג מהירויות תזוזה ממוצעות עבור אוכלוסייה שלמה של חרוזים, תעד ניגודיות פאזה או תמונות סטילס פלואורסצנטיות לאורך זמן על-ידי סריקת השקופית כולה. מדוד את אורך השביט ביד ורשום את הערכים. התווה את אורך השביט לעומת הזמן.השיפוע של ההתאמה הליניארית הוא מהירות הצמיחה הממוצעת. בחר סרטים עם קיטועי זמן במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי להעריך מהירויות חרוזים בודדות. בהתאם למהירות החרוז ולרזולוציה הנדרשת, צלם פריימים כל 1 עד 10 שניות.השתמש בכלי המעקב של כל תוכנית עיבוד תמונה כדי להשיג מהירויות חרוזים ומסלולים. ערבוב תקני BSA עם מגיב ברדפורד נותן פתרון עם גוונים כחולים מדורגים. ערכי הספיגה משורטטים לעומת ריכוזי החלבון הסטנדרטיים, והמתאם הליניארי משמש לקביעת ריכוזי החלבון המחודשים.ערבוב חרוזים מקודדים על ידי SPVCA ומדיום תנועתיות המכיל חלבון מכסה מוביל להיווצרות ענן אקטין תוך דקות. קיטוב עננים מתרחש בערך חמש דקות וייצור כוכבי שביט ב-15 עד 20 דקות. כוכבי השביט אקטין ממשיכים להתארך במשך שעות רבות אך מהירות עקבית אינה נשמרת.אז תנועתיות החרוזים מוערכת תוך שעה. תערובת תנועתיות עם חלבון מכסה או gelsolin נותן שביטים באופן דומה. ענני אקטין מקוטבים ליצירת כוכבי שביט ב-20 הדקות הראשונות של התגובה, וכוכבי שביט מתארכים עם הזמן.הערכה של אורכי השביט הנמדדים לאורך זמן משמשת לחישוב מהירות התזוזה. בהיעדר פעילות capping, ענני אקטין נוצרים סביב חרוזים, אך היווצרות שביט אינה מתרחשת. טיפול זהיר וצנרת של חלבונים חיוניים להצלחת הליך זה, לא רק בעת ביצוע תערובת התנועתיות, אלא גם בעת מדידת ריכוזי חלבונים באמצעות מבחן ברדפורד.היווצרות שביט ומסלולי חרוזים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה מאפשרים להבין את המנגנון הפיזיקלי של התנועה באמצעות ניתוח חומר רך ופיזיקה סטטיסטית וניסויים ביופיזיקליים, כולל מדידות כוח ומיקרומניפולציה.

reconstitution-actin-based-motility-with-commercially-available

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת תנועתיות חוץ גופית כדי לנתח את אינטראקציות אקטין מיוזין. תנועת הגלישה של חוטי אקטין על מולקולות מיוזין משותקות מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

The Gliding Actin Filament Assay: An In Vitro Motility Assay to Study Translocation of Actin Filaments on Immobilized Myosins

בדיקת תנועתיות הפוכה: טכניקה במבחנה לדמיין תנועת מיוזין על חוטי אקטין משותקים

סרטון זה מתאר את TIRF, טכניקה מבוססת מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת להמחשת דינמיקת פילמור אקטין ומיקרוטובול. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול בזמן אמת, החיונית להבנת שיחות צולבות תאיות.

מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

היווצרות של צרורות actomyosin במבחנה ומדידת ייצור כוח אנסמבל מיוזין באמצעות פינצטה אופטית מוצג ונדון.

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

חקור מנגנוני תנועה תאית באמצעות שחזור תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להעריך ייצור כוח ביופיזיקלי וללמוד על דינמיקת חלבונים.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

גלה סרטונים נוספים