שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

עם תערובת פשוטה של מרכיבים ומשטחים פונקציונליים, פרוטוקול זה משחזר פונקציה חיונית של תאים, תנועה המופעלת על ידי הרכבת אקטין. ניתן להעריך את המנגנונים הביוכימיים והביופיזיים של ייצור הכוח על ידי שינוי תערובת המרכיבים ותכונות המשטח הפונקציונלי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שניתן לרכוש את כל המרכיבים, ולכן אין צורך במומחיות בטיהור חלבונים.

זה מאפשר למי שאינו מומחה להשתמש במערכת זו ככלי במחקר שלהם. פרוטוקול זה מספק מודול הוראה ברמה של תואר ראשון, המעניק לסטודנטים התנסות מעשית במניפולציה של חלבונים והתבוננות במערכת ביולוגית מוכנה עצמית תחת המיקרוסקופ. הם יכולים לשלוט ולגוון פרמטרים של המערכת.

אנליזה פיזיקלית, כגון משוואת לאנגמיור, יכולה לרוץ על מסלולים. התחילו בהחייאת חלבונים ליופיליים. אספו את המוצק בתחתית הצינור על ידי פולסים של אבקות חלבון צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מוסיפים מים לפי הוראות היצרן ודוגרים על קרח למשך 15 דקות לפחות. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. שומרים על הקרח עוד 15 דקות ומערבבים שוב.

לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה. רמיקס, ואליקוט על הקרח. כדי לבצע דה-פולימריזציה של אוליגומרים של אקטין שנוצרו במהלך ליופיליזציה והקפאה, יש לדלל אליקוט של אקטין שעבר החייאה פי שמונה ב-G-buffer עם תוספת ATP, DTT ואקטין מסומן ב-10%.

אפשרו לו לבצע דה-פולימריזציה על הקרח עם ערבוב מזדמן במשך כמה ימים עד שבוע לפחות לפני מדידת ריכוז החלבון. כדי למדוד את ריכוזי החלבונים של חלבונים שעברו החייאה, הכינו תחילה סדרת דילול BSA. התחל על ידי הצבת שני צינורות מיליליטר ו 1.5 מיליליטר במדף כמתואר בכתב יד.

מלאו צינור חרוטי של 15 מיליליטר למעלה עם מגיב ברדפורד והניחו אותו על קרח. קח 200 מיקרוליטרים של מגיב ברדפורד ופלט אותו בחזרה לתוך הצינור החרוטי כדי להרטיב את קצה הפיפטה. מכיוון שהתמיסה צמיגה, פיפטה לאט כדי לאפשר לתמיסה להיכנס ולצאת מהקצה לחלוטין מבלי ליצור בועות.

לאחר מכן באמצעות הקצה הרטוב מראש, פיפטה 200 מיקרוליטר של Bradford Reagent לתוך כל אחד צינורות 1.5 מיליליטר במדף. ולהחזיר את התוכן הנותר של צינור חרוטי 15 מיליליטר לבקבוק. מדוד את המים לתוך שני צינורות מיליליטר של שורות אחת, שלוש, וחמש.

הכן את סדרת דילול BSA על-ידי דילול תמיסת מלאי BSA מכוילת כמתואר בכתב היד. לאחר מכן לבצע דילולים סדרתיים על ידי העברת 900 microliters של כל פתרון לתוך הצינור הבא. הוסף 800 מיקרוליטר של מים לצינור הריאגנט של ברדפורד עבור הריק והפעל את הטיימר.

מערבבים 800 מיקרוליטרים מכל תקן BSA עם 200 מיקרוליטרים של מגיב ברדפורד בצינורות המוכנים. תוך חמש דקות לאחר הערבוב עם הריאגנט של ברדפורד או כל תקן בקובט חד פעמי קראו את הספיגה ב-600 ננומטר. גרף את ערכי הספיגה המתקבלים כפונקציה של ריכוז BSA ידוע וקבל מתאם ליניארי עם ערך R של 0.99.

בצינורות המכילים 2000 מיקרוליטרים של מים, מדללים בעדינות חלבונים שעברו רזולובילציה כפי שמתואר בכתב היד. מיד להוסיף 800 microliters של כל פתרון ריאגנט ברדפורד מוכן לערבב. קרא את הספיגה בספקטרופוטומטר תוך חמש דקות.

חשב את ריכוזי החלבונים באמצעות העקומה הסטנדרטית שנבנתה בעבר. לציפוי חרוזים, מצננים מראש את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס. פיפטה 50 מיקרוליטר של חיץ Xb לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.

ערבבו היטב מתלי חרוזים בקוטר 4.5 מיקרומטר על ידי מערבולות והוסיפו תשעה מיקרוליטרים של המתלה לצינור המכיל חיץ Xb. צנטריפוגה דגימות ב 20, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לצפות את החרוזים, הסר בזהירות את הסופר-נאטנט מבלי להפריע לחרוזים ושלח מחדש את כדור החרוזים ב-40 מיקרוליטרים של שני מיקרומולרים SpVCA במאגר Xb על ידי פיפטינג עדין.

עכשיו להתסיס את החרוזים בבלוק יבש ב 1000 סל"ד במשך 20 דקות ב 18 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את החרוזים המצופים על ידי צנטריפוגה. הסרת הסופר-נאטנט והחייאת החרוזים ב-50 מיקרוליטרים של Xb קר עם 1% BSA.

לאחר שטיפת החרוזים, יש למרוח את גלולת החרוזים המצופה ב-120 מיקרוליטר של Xb קר, 1% BSA. יש לאחסן על קרח במקרר או בחדר קר. הכינו את תערובת תגובת התנועתיות כמתואר בכתב היד.

ערבבו במהירות את התגובה והפעילו את הטיימר. זהה את כל תערובת תגובת התנועתיות בשקופית. כסו אותו בכיסוי של 18 מילימטר על 18 מילימטר ואטמו את הכיסוי עם VALAP מומס באמצעות מכחול קטן.

כדי להשיג מהירויות תזוזה ממוצעות עבור אוכלוסייה שלמה של חרוזים, תעד ניגודיות פאזה או תמונות סטילס פלואורסצנטיות לאורך זמן על-ידי סריקת השקופית כולה. מדוד את אורך השביט ביד ורשום את הערכים. התווה את אורך השביט לעומת הזמן.

השיפוע של ההתאמה הליניארית הוא מהירות הצמיחה הממוצעת. בחר סרטים עם קיטועי זמן במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי להעריך מהירויות חרוזים בודדות. בהתאם למהירות החרוז ולרזולוציה הנדרשת, צלם פריימים כל 1 עד 10 שניות.

השתמש בכלי המעקב של כל תוכנית עיבוד תמונה כדי להשיג מהירויות חרוזים ומסלולים. ערבוב תקני BSA עם מגיב ברדפורד נותן פתרון עם גוונים כחולים מדורגים. ערכי הספיגה משורטטים לעומת ריכוזי החלבון הסטנדרטיים, והמתאם הליניארי משמש לקביעת ריכוזי החלבון המחודשים.

ערבוב חרוזים מקודדים על ידי SPVCA ומדיום תנועתיות המכיל חלבון מכסה מוביל להיווצרות ענן אקטין תוך דקות. קיטוב עננים מתרחש בערך חמש דקות וייצור כוכבי שביט ב-15 עד 20 דקות. כוכבי השביט אקטין ממשיכים להתארך במשך שעות רבות אך מהירות עקבית אינה נשמרת.

אז תנועתיות החרוזים מוערכת תוך שעה. תערובת תנועתיות עם חלבון מכסה או gelsolin נותן שביטים באופן דומה. ענני אקטין מקוטבים ליצירת כוכבי שביט ב-20 הדקות הראשונות של התגובה, וכוכבי שביט מתארכים עם הזמן.

הערכה של אורכי השביט הנמדדים לאורך זמן משמשת לחישוב מהירות התזוזה. בהיעדר פעילות capping, ענני אקטין נוצרים סביב חרוזים, אך היווצרות שביט אינה מתרחשת. טיפול זהיר וצנרת של חלבונים חיוניים להצלחת הליך זה, לא רק בעת ביצוע תערובת התנועתיות, אלא גם בעת מדידת ריכוזי חלבונים באמצעות מבחן ברדפורד.

היווצרות שביט ומסלולי חרוזים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה מאפשרים להבין את המנגנון הפיזיקלי של התנועה באמצעות ניתוח חומר רך ופיזיקה סטטיסטית וניסויים ביופיזיקליים, כולל מדידות כוח ומיקרומניפולציה.