טיהור פוליזום מגושים סימביוטיים של פולי סויה

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא, למיטב ידיעתנו, הראשון שמתאר מתכת חדשה המבוססת על צנטריפוגות לטיהור פוליזום קינטי מגושים סימביוטיים של פולי סויה. היתרון הגדול של טכניקה זו הוא כי בשילוב עם RNA-Seq, מאפשר את המחקר של הקשר מאורגן ברקמה מורכבת כגון גולם סימביוטי. כדי להתחיל, לשקול כ 0.2 גרם של גושים שלמים בכלי שקילה, ולהעביר אותם צינור מקורר מראש שני מיליליטר.

לאחר מכן מוסיפים 1.2 מיליליטר של מאגר מיצוי פוליזום, נותנים לדגימה להפשיר במשך שתי דקות, והומוגניות עם מטחנת רקמות עד לשיבוש מוחלט והומוגניות של הגושים. לאחר מכן, לדגור את הדגימות על קרח עם תסיסה עדינה במשך 10 דקות או עד שכל הדגימות עובדו צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרוק את הפסולת. לאחר מכן, לשחזר את supernatant, ולחזור על שלב צנטריפוגה.

לאחר שחזור זהיר של תמצית הציטוזולית המזוהרת, העבר 200 מיקרוליטר אליקוט לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר לבידוד מוחלט. לאחר מכן, יוצקים 4.5 מיליליטר של שכבת 33.5% סוכרוז לתוך צינורות צנטריפוגה, ולהוסיף 4.5 מיליליטר של שכבת 12% בזהירות ובאיטיות עם P-1000 micropipette. לאחר מכן, לשים את הצינורות על הקרח עד תוספת של תמצית cytosolic הבהיר.

העמיסו מיליליטר אחד של תמצית ציטוזולית מזוקקת על גבי כרית הסוכרוז על ידי ניפוח בזהירות על הדופן הצדדית של הצינור. לאחר מכן, העבירו את צינורות האולטרה-צנטריפוגה לדליים מקוררים מראש, ואת הצנטריפוגה ב-217, 874 G למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת התמצית הציטוזולית הנותרת וכרית סוכרוז, השהה מחדש את הכדור הפוליסומלי עם 200 מיקרוליטר של חיץ השעיה מחדש מקורר מראש.

לאחר מכן, לדגור במשך 30 דקות על קרח, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה מחדש polysomal ל 1.5 מיליליטר צינורות מקורר מראש להמשיך עם מיצוי RNA. לאחר הומוגניזציה של הדגימות עם 750 מיקרוליטרים של ריאגנט בידוד RNA דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של כלורופורם קר, ולנער את הצינורות במרץ במשך 15 שניות.

לאחר מכן, לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס להפרדת פאזה, ולהעביר 500 microliters של הפאזה המימית העליונה לצינור נקי מבלי להפריע את השלב האורגני ורוד. לאחר מכן, הוסף 375 מיקרוליטר של איזופרופנול קר ו -0.5 מיקרוליטר של גליקוגן חופשי RNAs.

לאחר מכן, ערבבו היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה. לדגום את התערובת במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולשטוף את משקע RNA עם מיליליטר אחד של קור, 75% אתנול.

מערבבים על ידי מערבולת קצרה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 7, 500 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נטנט, ולייבש באוויר את גלולת ה-RNA.

לאחר מכן, ממיסים את הכדור ב-50 מיקרוליטרים של מים חופשיים מ-RNAs, ודוגרים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הערך את ריכוז ה-RNA ואת שלמותו באמצעות אלקטרופורזה נימית רגישה ביותר, או אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז נטול RNAs של 2%. לאחר הערכת נפח הדגימה, הוסף 0.1 כרכים של שלושה נתרן אצטט טוחן, שלושה נפחים של אתנול קר, ו 0.5 מיקרוליטר של RNAs, גליקוגן חופשי.

לאחר מכן, מערבבים אותם היטב. אלקטרופורזה נימית בוצעה עבור מספר שברי דגימת RNA כוללים ופוליסומליים, אשר הדגימו רצועות RNA ריבוזומליות חדות, ללא כל מראה מרוח. עם זאת, זה לא בא לידי ביטוי בערכי RIN, כפי שהם נעים בין 5.9 ל 7.5, אשר מתאים דגימות שאינן שלמות.

הביואנליזה לא הצליחה לזהות את פסגות ה-18S וה-25S כפי שהן נראות באלקטרופרוגרמות, הן עבור דגימות RNA כוללות והן עבור דגימות RNA הקשורות לפוליזום. לא היה שום סימן חזותי של השפלה במדגם. עם זאת, מדגם נותח כדי לדמיין את התוצאה של מדגם מושפל כמעט לחלוטין, לשם השוואה.

הדבר החשוב ביותר הוא לעבוד בתנאים משמרים פוליזום ורנ"א במהלך כל הפרוטוקול. לאחר ריצוף שברי ה-RNA הכוללים והנקובים ניתן להשתמש בתבניות סטנדרטיות לביטוי הגנים שנותחו כדי לזהות גנים מבטאים דיפרנציאליים ברמת השעתוק והתרגום.