Name: בידוד וכימות של נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למדו לבודד חלקיקי נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1 באמצעות הפעלת מחזור ליטי עם PMA. כימות הווירוס ב-PCR בזמן אמת מאפשר הכנת מלאי ויראלי אמין למחקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון לעבודה זו נתמך על ידי מענקים למיון מקרן המחקר אסמר, המועצה הלאומית הלבנונית למחקר מדעי (L-CNRS) ותוכנית הפרקטיקה הרפואית (MPP) באוניברסיטה האמריקאית בביירות.

הערה: EBV צריך להיחשב כחומר בעל פוטנציאל ביולוגי, ולכן יש לטפל בו תחת בלימת Biosafety רמה 2 ומעלה. יש ללבוש מעיל מעבדה כמו גם כפפות. אם קיים פוטנציאל לחשיפה להתזות, יש לשקול גם הגנה על העיניים. ההליך הבא צריך להתבצע בקבינט בטיחות ביולוגית.
1. ספירת תאי P3HR1
<ol><li>צנטריפוגה והחייאה של תאים<ol><li>העבר את מתלה התא מצלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ (או בקבוקון T-25) של תרבית תאים מתמשכת מסוג P3HR1 בטמפרטורה של 80% לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צפיפות הזריעה של תאי P3HR-1 היא 1 x 106 תאים למ"ל. יש לשמור על מדיום תרבית RPMI שלם (79% מדיום תרבית RPMI, סרום בקר עוברי 20%, אנטיביוטיקה Pen-Strep 1%) בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2, ולעבור כל 3-4 ימים.</li>
		<li>צנטריפוגה למשך 8 דקות ב 120 x גרם. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant, להשעות את כדור התא ב 1 מ"ל של מדיום תרבית RPMI מלאה, ומערבבים היטב (פתרון זה ייקרא השעיה A).</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תרחיף התאים לספירה<ol><li>הכן תרחיף תא מדולל B על ידי ערבוב 2 μL של תרחיף תא A עם 8 μL של מדיום תרבית. יש להוסיף 10 μL של 0.4% טריפן כחול לתרחיף B כדי לקבל את התרחיף C. מערבבים היטב את התכשיר על ידי פיפטציה עדינה.</li>
	</ol></li>
	<li>ספירת תאים באמצעות המוציטומטר<ol><li>הניחו כיסוי זכוכית על ההמוציטומטר והעמיסו 10 μL של תרחיף C. הניחו את ההמוציטומטר מתחת למיקרוסקופ אור וספרו את מספר התאים שאינם מוכתמים בכחול בכל אחד מארבעת הרבעים של תא ההמוציטומטר באמצעות מטרת המיקרוסקופ 40x (איור 1).</li>
		<li>טריפאן כחול מכתים תאים מתים בכחול; אל תספור תאים אלה, וגם לא תאים שנוגעים באף אחד מהגבולות העליונים, התחתונים, הימניים או השמאליים של כל רביע המוציטומטר.</li>
		<li>חשב את ריכוז התאים למ"ל באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq01.jpg" style="margin: auto;"> הערה: מספר הרבעים שנספרו הוא ארבעה, ו-10-4 מ"ל הוא נפח הריבועים בהמוציטומטר. ארבעת הרבעים שיש לספור מיוצגים בירוק באיור 1. סך כל התאים הנספרים בנוסחה הוא סכום מספר התאים ברבעים 1, 2, 3 ו- 4. יש לספור תאים המיוצגים בכחול באיור 1 , בעוד שאין לספור תאים באדום מאחר שהם נוגעים בגבולות העליונים, הימניים, התחתונים או השמאליים של הרבע.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64279/64279fig01.jpg"> איור 1: ספירת תאים באמצעות תא המוציטומטר. ארבעה רבעים נספרים באמצעות מיקרוסקופ אור; רבעים אלה מיוצגים בירוק. סך כל התאים שנספרו בנוסחה המצוינת בשלב 1.3.3 של הפרוטוקול המתואר כאן הוא סכום מספר התאים ברבעים 1, 2, 3 ו-4. יש לספור תאים המסומנים בכחול, בעוד שאין לספור תאים באדום מכיוון שהם נוגעים בגבולות העליונים, הימניים, התחתונים או השמאליים של הרביע <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64279/64279fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
2. הכנת הצלחת לתרבות
<ol><li>מניחים נפח של תרחיף תא A בצינור חרוטי של 15 מ"ל. אמצעי האחסון הנדרש תלוי בספירת התאים. התאם את עוצמת הקול כך שמספר התאים יהיה בערך 2.2 x 106 תאים עבור צלחת תרבית של 100 מ"מ.</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבות שלם לצינור ולאחר מכן להעביר את התוכן של הצינור לצלחת תרבית 100 מ"מ. הוסף 80 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לצלחת התרבית. הערה: DMSO רגיש לאור, ולכן יש לאחסן אותו במיכל עמיד לאור או לכסות אותו בחומר אטום כמו רדיד אלומיניום.</li>
	<li>יש להוסיף 350 μL של 1 מ"ג/מ"ל פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA) לצינור. הריכוז הסופי של PMA צריך להיות 35 ng/mL, וזה של DMSO צריך להיות 0.08%. אזהרה: PMA הוא רעיל, קורוזיבי ומסרטן, ולכן יש לטפל בו בזהירות רבה. PMA הוא רגיש לאור, ולכן יש לאחסן אותו במיכל עמיד לאור או לכסות אותו בחומר אטום כמו רדיד אלומיניום.</li>
	<li>הוסף 4.27 מ"ל של מדיום תרבות, כך נפח הכולל הוא 10 מ"ל. מערבבים את תוכן הצינור על ידי הטיה, ולאחר מכן מעבירים את התוכן לצלחת תרבית של 100 מ"מ. השאירו את הצלחת באינקובטור של תרבית תאים למשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
</ol>3. אינדוקציה ובידוד של חלקיקי נגיף אפשטיין-בר
<ol><li>לאחר 5 ימים באינקובטור, צנטריפוגה את התוכן של הצלחת ב 120 x גרם במשך 8 דקות כדי לזרוק את התאים. לאסוף את supernatant ללא תאים, המכיל וירוס, ולהשליך את כדור התא.</li>
	<li>צנטריפוגה של סופרנאטנט ב 16,000 x גרם במשך 90 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לזרוק את חלקיקי הנגיף. יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות את גלולת הנגיף ב-5 מ"ל של מדיום תרבית. הערה: ניתן להשתמש בתמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) כדי להשהות את גלולת הנגיף במקום במדיום תרבית.</li>
	<li>Aliquot את ההשעיה הנגיפית המתקבלת לתוך 20 צינורות, כל אחד מכיל 250 μL של ההשעיה הנגיפית. יש לאחסן את המתלים בטמפרטורה של -80°C.</li>
</ol>4. מיצוי דנ"א מחלקיקים נגיפיים
אזהרה: יש לנקוט משנה זהירות בעת טיפול בפנול, שכן הוא רעיל וקורוזיבי ובעל יכולת לגרום לכוויות קשות. פנול רגיש לאור ומתחמצן במגע עם אור או אוויר. אחסנו אותו במיכל עמיד לאור או לחילופין כסו את צינור הפנול בחומר אטום כמו רדיד אלומיניום.
<ol><li>הפרדת חלבונים מדנ"א<ol><li>הוסף 500 μL של פנול רווי TrisCl לאחד מצינורות 250 μL. מוסיפים 100 μL של מים (כדי להגדיל את נפח הפאזה המיימית) ומערבבים היטב כדי לקבל תחליב ורוד. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 9650 x גרם.</li>
	</ol></li>
	<li>משקעי דנ"א<ol><li>לאסוף את supernatant (שקוף, פאזה מימית) ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הוסיפו כמות שוות ערך ל-1/10 מנפח הנתרן אצטט הקר של הסופר-נטנט (3 M, pH 5.2) וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הוסיפו 1 מיקרון של 20 מ"ג/מ"ל גליקוגן וערבבו בפיפטציה. הערה: שלב זה הוא אופציונלי, אך תוספת הגליקוגן משפרת את משקעי הדנ"א ומקלה על הדמיית גלולת הדנ"א.</li>
		<li>הוסיפו פי שלושה מנפח ה-supernatant של 100% אתנול קר. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה. הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן כדי לחדש אותו במועד מאוחר יותר. ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך שעה, או לחילופין למשך הלילה. אחסון לילה משפר את משקעי הדנ"א ולכן מומלץ.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד הדנ"א הנגיפי<ol><li>למחרת, צנטריפוגה ב 9650 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant כדי לקבל גלולת DNA.</li>
		<li>לשטוף את הכדור שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קור 70% אתנול, צנטריפוגה ב 9650 x גרם במשך 15 דקות, ולהשליך את supernatant.</li>
		<li>יש לייבש את הכדור באוויר במשך כ-10 דקות. יש להשעות את הכדור ב-10-50 מיקרון של מים מזוקקים נטולי נוקלאז (תלוי בגודל גלולת הדנ"א).</li>
		<li>אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 °C לעיבוד מאוחר יותר או ב- 4 °C למשך הלילה כדי להבטיח פירוק DNA מרבי ואחריו אחסון ב- -20 °C. לחלופין, המשך ישירות לשלב 5.</li>
	</ol></li>
</ol>5. בדיקת ריכוז וטוהר הדנ"א
<ol><li>לאחר ניקוי הכן של מיקרוספקטרופוטומטר עם מגב משימה עדין, טען 1 μL של הכנת ה- DNA.</li>
	<li>שימו לב לריכוז הדנ"א בדגימה. בדוק את יחסי הספיגה ב- וגם <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq03.jpg" style="margin: auto;">ב- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq02.jpg" style="margin: auto;"> . דנ"א ייספג ב-260 ננומטר, חלבונים ב-280 ננומטר, וחומרים אורגניים כמו פנול ייספגו ב-230 ננומטר. יחס של 1.8-2 נחשב מספיק עבור PCR בזמן אמת.</li>
</ol>6. כימות על ידי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת
<ol><li>הכנת תערובות תגובת PCR<ol><li>יש להניח 5 μL של תערובת PCR ירוקה בזמן אמת של SYBR בצינורות PCR של 0.2 מ"ל. הוסף לכל צינור 1 μL של 7.5 pmol/μL פריימר קדמי ו-1 μL של 7.5 pmol/μL פריימר הפוך. רצף פריימר קדימה: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; רצף פריימר הפוך: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGGGG-3'. הגן המוגבר כדי לקבוע את מספר עותק הגנום של EBV הוא הגן RNA 2 קטן (EBER-2) של נגיף אפשטיין-בר .</li>
		<li>לאחד הצינורות, הוסיפו 2 μL של מים נטולי נוקלאז ו-1 μL של דנ"א נגיפי משלב 4. הנפח הכולל של תערובת התגובה הוא 10 μL. הערה: בהתאם לריכוז הדנ"א בדגימה, ייתכן שיהיה צורך בשלב דילול. יש לציין את גורם הדילול F והוא ישולב בנוסחה בשלב 6.3.</li>
		<li>הכן צינורות אחרים שישמשו כתקנים עם מספרי העתקי גנום ידועים של EBV (1000, 2000, 5000, 10,000 ו- 54,000 עותקים).</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את תערובות ה-PCR החל משלב הפעלה ראשוני ב-95°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים ב-95°C ו-58°C (חישול) למשך 15 שניות ו-30 שניות, בהתאמה.</li>
	<li>צור עקומת תקן qPCR על ידי התוויית ערכי ה- Ct של התקנים כנגד היומן של מספר עותקי הגנום של EBV לכל צינור סטנדרטי. באמצעות משוואת העלילה העקומה הסטנדרטית, לגזור את מספר עותקי הגנום של EBV בצינור ה-PCR המכיל את הדנ"א הנגיפי המושרה. לאחר מכן, השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את הריכוז של הכנה ויראלית המושרה: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq04.jpg" style="margin: auto;"> כאשר X הוא מספר עותקי הגנום של EBV הנגזרים מהעקומה הסטנדרטית ו-F הוא גורם הדילול המשמש להגדרת הדנ"א המשמש לתגובת PCR.</li>
</ol>7. בדיקת פעילות ביולוגית/הדבקה של החלקיקים הנגיפיים
<ol><li>העבר תאי BC-3 מצלחת תרבית של 100 מ"מ בטמפרטורה של 80% לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צפיפות הזריעה של תאי P3HR-1 היא 1 x 106 תאים למ"ל. יש לשמור על מדיום תרבית RPMI שלם (79% מדיום תרבית RPMI, סרום בקר עוברי 20%, אנטיביוטיקה Pen-Strep 1%) בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2, ולעבור כל 3-4 ימים.</li>
	<li>ספירת תאי BC-3 באותו אופן שבו נספרו תאי P3HR-1 בשלב 1. לצלחת של 96 בארות, יש להוסיף 10 תאיםשל 5 BC-3 לכל באר. השתמש בשלוש, שש, תשע או 12 בארות כדי להבטיח את משמעות התוצאות ולמזער שגיאות.</li>
	<li>הוסף נפח של מלאי ויראלי לכל באר, בהתאם לריכוז התכשיר הנגיפי שנקבע בשלב 6.3. משרד הפנים יכול להשתנות, ואופטימיזציה של פרוטוקול זה תחשוף את MOI הטוב ביותר לזיהום (מומלץ טווח MOI של 2-50). ודא שהנפח הכולל של התערובת הקיימת בכל באר הוא 250 μL.<ol><li>כדי לקבוע את הנפח הנדרש, יש לדעת את ריכוז המניה הנגיפית, ולבחור MOI. לדוגמה, אם MOI הוא 2, אז מספר החלקיקים הנגיפיים שנוספו צריך להיות כפול ממספר התאים. חשב את נפח V של המניה הנגיפית הנדרשת באמצעות הנוסחה: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq05.jpg" style="margin: auto;">, כאשר n הוא מספר החלקיקים הנגיפיים הדרושים, ו- C הריכוז הידוע של המניה הנגיפית</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור את התוכן של צלחת 96 באר במשך 5 ימים. לאחר 5 ימים, להעביר את התוכן של כל באר לצינור 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה של הצינורות ב 120 x g במשך 8 דקות כדי להפריד את התאים מן המדיום תרבית המכיל וירוס. הכפיפו את כדורי התא, כמו גם את הסופרנאטים, למיצוי דנ"א ולאחר מכן לכימות PCR בזמן אמת כדי לבדוק את נוכחותם של גנומים נגיפיים בכל שבר, ובכך להעריך את ההדבקה של החלקיקים הנגיפיים.</li>
</ol>

<ol><li>Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+particles+in+cultured+lymphoblasts+from+Burkitt%27s+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma.</a> Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).</li>
<li>Sample, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+types+1+and+2+differ+in+their+EBNA-3A%2C+EBNA-3B%2C+and+EBNA-3C+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes.</a> Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).</li>
<li>Chang, M. S., Kim, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+in+human+malignancy%3A+a+special+reference+to+Epstein-Barr+virus+associated+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma.</a> Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).</li>
<li>Manet, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManet%2C+E+%22Encyclopedia+of+Cancer%22">Encyclopedia of Cancer</a>. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).</li>
<li>Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBV+persistence+in+memory+B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">EBV persistence in memory B cells in vivo.</a> Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).</li>
<li>Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+EBV+persistence+in+vivo+a+model+for+B+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis.</a> Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).</li>
<li>Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+gammaherpesviruses+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis.</a> Pathogens. 5 (1), 18(2016).</li>
<li>El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+malignancies%3A+roles+of+viral+oncoproteins+in+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis.</a> Frontiers in Oncology. 8, 265(2018).</li>
<li>Vereide, D., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+evolution+of+lymphomas+induced+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus.</a> Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).</li>
<li>Vereide, D. T., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomas+differ+in+their+dependence+on+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus.</a> Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).</li>
<li>Houen, G., Trier, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+and+systemic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases.</a> Frontiers in Immunology. 11, 587380(2020).</li>
<li>Ortiz, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Epstein-Barr+virus+infection+on+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espanola+de+Enfermedades+Digestivas%22%5BJournal%5D)">Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes.</a> Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).</li>
<li>Caplazi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of rheumatoid arthritis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).</li>
<li>Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental models of inflammatory bowel diseases.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).</li>
<li>Warde, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+arthritis%3A+EBV+induces+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683(2011).</li>
<li>Jog, N. R., James, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein+Barr+virus+and+autoimmune+responses+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 623944(2020).</li>
<li>Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+propagation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+recombinants+in+EBV-negative+Akata+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells.</a> Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).</li>
<li>Hsu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+reactivation+in+Raji+cells+by+doxorubicin+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin.</a> Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).</li>
<li>Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+virus+enzymes+by+phorbol+esters+and+n-butyrate+in+Epstein-Barr+virus+genome-carrying+Raji+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells.</a> Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).</li>
<li>Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+transforming+EBV+from+non-producer+cells+after+superinfection+with+non-transforming+P3HR-1+EBV%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV.</a> International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).</li>
<li>Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+prototype+of+Epstein-Barr+virus+%28B95-8%29+is+also+a+lytic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus.</a> International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).</li>
<li>Sairenji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+release+from+P3HR-1+and+B95-8+cell+lines+by+monoclonal+antibodies+to+EBV+membrane+antigen+gp350%2F220%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220.</a> Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).</li>
<li>Savage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+the+population+of+cotton-top+tamarins+%28Saguinus+oedipus%29+and+their+habitat+in+Colombia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia.</a> PLoS one. 11 (12), 0168324(2016).</li>
<li>Kallin, B., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+carried+by+raji+cells%3A+a+mutant+in+early+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions.</a> Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).</li>
<li>Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+transforming+EBV+from+non-producer+cells+after+superinfection+with+non-transforming+P3HR-1+EBV%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV.</a> International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).</li>
<li>Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Epstein-Barr+virus%2C+human+herpesvirus+6+%28HHV-6%29%2C+and+HHV-8+antiviral+drug+susceptibilities+by+use+of+real-time-PCR-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).</li>
<li>Buelow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+four+real-time+PCR+methods+for+the+quantitative+detection+of+Epstein-Barr+virus+from+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).</li>
<li>Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+nuclear+protein+2+%28EBNA2%29+binds+to+a+component+of+the+human+SNF-SWI+complex%2C+hSNF5%2FIni1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1.</a> Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBNA2-deleted+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+isolate%2C+P3HR1%2C+causes+Hodgkin-like+lymphomas+and+diffuse+large+B+cell+lymphomas+with+type+II+and+Wp-restricted+latency+types+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice.</a> PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

ייצור חלקיקי EBV נחוץ להבנת הביולוגיה של נגיף זה, כמו גם המחלות הקשורות אליו. כאן תיארנו את הייצור של חלקיקים אלה מקו התאים P3HR-1. קו תאים זה אינו הקו היחיד של יצרני EBV; למעשה, חלקיקי EBV בודדו גם מתאי B95-821,22 וכן מקו תאי ראג'י18,19. מחזור הליטית EBV הושרה בתאים אלה עם n-בוטיראט. לחלופין, ניתן להשתמש באסטרים של פורבול כגון 12-O-tetradecanoylphorbol-13-אצטט (TPA), הידוע גם בשם phorbol 12-myristate-13-...

נגיף אפשטיין-בר (EBV) הוא נגיף הגידול האנושי הראשון שבודד1. EBV, המכונה באופן רשמי וירוס ההרפס האנושי 4 (HHV-4)2, הוא חלק מתת-משפחת נגיפי ההרפס גמא של משפחת נגיפי ההרפס והוא אב הטיפוס של הסוג לימפוקריפטווירוס לימפוקריפטווירוס. כמעט 90-95% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם נגועה בנגיף3. ברוב המקרים, זיהום ראשוני מתרחש בתוך 3 השנים הראשונות של החיים והוא אסימפטומטי, עם זאת, אם זיהום מתרחשת מאוחר יותר במהלך גיל ההתבגרות, זה עלול לעורר מחלה המכונה mononucleosis זיהומיות4. EBV מסוגל להדביק תאי B במנוחה ולגרום להם להפוך ללימפובלסטים מסוג B מתרבים שבהם הנגיף מבסס ומתחזק מצב נגוע סמוי5. EBV יכול לפעול מחדש בכל עת ובכך להוביל לזיהומים חוזרים6.
במהלך 50 השנים האחרונות, הקשר בין וירוסים מסוימים לבין התפתחות של ממאירויות אנושיות הפך ברור יותר ויותר, וכיום ההערכה היא כי 15% עד 20% מכלל סוגי הסרטן האנושיים קשורים לזיהומים ויראליים7. נגיפי ההרפס, כולל EBV, הם חלק מהדוגמאות הנחקרות ביותר לסוגים אלה של וירוסים סרטניים8. למעשה, EBV יכול לגרום לסוגים רבים של ממאירויות אנושיות, כגון לימפומה Burkitt (BL), לימפומה הודג'קין (HL), לימפומה מפוזרת של תאי B גדולים, ומחלות לימפופרוליפרטיביות אצל מארחים מדוכאי חיסון 9,10. EBV הוכח גם כקשור להתפתחות מחלות אוטואימוניות מערכתיות. כמה דוגמאות להפרעות אוטואימוניות אלה הן דלקת מפרקים שגרונית (RA), פולימיוסיטיס-דרמטומיוסיטיס (PM-DM), זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מחלת רקמת חיבור מעורבת (MCTD) ותסמונת סיוגרן (SS)11. EBV קשור גם להתפתחות מחלות מעי דלקתיות (IBD)12.
רבות מהמחלות האלה ניתנות למחקר או למודל באמצעות תרבית תאים, עכברים או אורגניזמים אחרים הנגועים ב-EBV. לכן יש צורך בחלקיקי EBV כדי להדביק תאים או אורגניזמים, בין אם במבחנה או במודלים in vivo 13,14,15,16, ומכאן הצורך לפתח טכניקה המאפשרת בידוד של חלקיקים נגיפיים בעלות נמוכה. הפרוטוקול המתואר כאן מספק קווים מנחים לדרך קלה לבודד באופן אמין חלקיקי EBV מקו תאים נגיש יחסית ולכמת את החלקיקים באמצעות PCR בזמן אמת, שהוא חסכוני וזמין לרוב המעבדות. זאת בהשוואה למספר שיטות אחרות שתוארו לבודד EBV מקווי תאים שונים17,18,19,20.
P3HR-1 הוא קו תאי BL שגדל בתרחיף ונגוע באופן סמוי בזן EBV מסוג 2. קו תאים זה הוא יצרן EBV וניתן לגרום לו לייצר חלקיקים נגיפיים. מטרתו של כתב יד זה היא להציג שיטה המאפשרת בידוד של חלקיקי EBV מקו התאים P3HR-1, ולאחר מכן כימות של המלאי הנגיפי שיכול לשמש מאוחר יותר הן למודלים ניסיוניים במבחנה והן ב- in vivo EBV.

<table><tbody><tr><td>0.2 מ"ל צינורות PCR בעלי קירות דקים</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0620</td><td>יש לבצע חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>0.2-10 ומיקרו; L טיפים מסנן מיקרונפיום</td><td>קורנינג</td><td>4807</td><td>יש לבצע חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>0.5-10 ומיקרו; L</td><td>פיפטה BrandTech</td><td>704770</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית חד פעמית</td><td>קורנינג</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; L קצות פיפטות מסוננות</td><td>QSP</td><td>TF-112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 ומיקרו; L פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>100x20 מ"מ צלחות חיתוך</td><td>Sarstedt</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>10-100 ומיקרו; L</td><td>פיפטה BrandTech</td><td>704774</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; L קצות פיפטה מסוננות</td><td>QSP</td><td>TF-108-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>20-200 ומיקרו; L פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 בזמן אמת C-1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>184-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Amresco</td><td>0231</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase Free Water</td><td>Zymo Research</td><td>W1001-1</td><td></td></tr><tr><td>EBER פריימרים</td><td>Macrogen</td><td>N/A</td><td>פריימרים בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>בקרת DNA של EBV (תקנים)</td><td>Vircell</td><td>MBC065</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (דרגת ריאגנט מעבדה)</td><td>Fischer Chemical</td><td>E/0600DF/17</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Fresco 21 MicroCentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>10651805</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גליקוגן</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>BOECO</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td></td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקס</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Costar (Corning)</td><td>3621</td><td>יש לבצע חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>P3HR-1 Cell Line</td><td>ATCC</td><td>HTB-62</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין פתרון</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>פנול</td><td>VWR</td><td>20599.297</td><td></td></tr><tr><td>פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>מילוי פיפטות</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>מגבונים מדויקים</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 תרבית בינונית</td><td>סיגמא</td><td>R7388</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה SL 16R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Riedel-de Ha&euml; n (Honeywell)</td><td>25022</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומר</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2 מצופה מים</td><td>Thermo Scientific</td><td>4121</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד וכימות של נגיף אפשטיין-בר מקו תאי p3hr1

Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line

נגיף אפשטיין-בר (באנגלית: Epstein-Barr virus או EBV), המוגדר רשמית כנגיף ההרפס האנושי 4 (HHV-4), הוא נגיף הגידול האנושי המבודד הראשון. כמעט 90-95% מהאוכלוסייה הבוגרת בעולם נגועה ב-EBV. עם ההתקדמות האחרונה בביולוגיה מולקולרית ואימונולוגיה, היישום של מודלים ניסיוניים במבחנה וב- in vivo סיפק תובנה עמוקה ומשמעותית על הפתוגנזה של EBV במחלות רבות, כמו גם על גידולים הקשורים ל- EBV. מטרת מאמר ניסוי חזותי זה היא לספק סקירה כללית של בידוד חלקיקים נגיפיים EBV מתאים של קו התאים P3HR1, ולאחר מכן כימות של ההכנה הנגיפית. תאי P3HR1, שבודדו במקור מלימפומה של בורקיט אנושי, יכולים לייצר נגיף P3HR1, שהוא זן EBV מסוג 2. ניתן לשרות את המחזור הליטי של EBV בתאי P3HR1 אלה על ידי טיפול בפורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA), המניב חלקיקים נגיפיים EBV.
באמצעות פרוטוקול זה לבידוד חלקיקי EBV, תאי P3HR1 עוברים תרבית במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בתווך RPMI-1640 שלם המכיל 35 ננוגרם/מ"ל PMA. לאחר מכן, מדיום התרבית הוא צנטריפוגה במהירות של 120 x g במשך 8 דקות כדי לזרוק את התאים. לאחר מכן, הסופר-נאטנט המכיל את הנגיף נאסף ומסתובב מטה במהירות של 16,000 x g למשך 90 דקות כדי לזרוק את חלקיקי ה-EBV. לאחר מכן הכדור הנגיפי עובר החייאה במדיום RPMI-1640 שלם. לאחר מכן מתבצע מיצוי דנ"א ו-PCR כמותי בזמן אמת כדי להעריך את ריכוז חלקיקי ה-EBV בתכשיר.

מטרת הליך זה היא לבודד חלקיקי EBV בתרחיף עם טיטר ויראלי ידוע, שיכול לשמש לאחר מכן למודל זיהום EBV. לכן, יש חשיבות עליונה להשתמש בריכוזים אופטימליים של הריאגנטים השונים כדי להשיג את תפוקת ה- EBV הגבוהה ביותר מתוך ההליך.
ניסוי אופטימיזציה נערך כדי לקבוע את הריכוזים של PMA ו-DMSO שיניבו את המספר הגבוה ביותר של חלקיקי EBV (איור 2). ריכוז DMSO של 0.8% וריכוז PMA של 35 ng/μL היו אופטימליים והביאו לריכוזי EBV גבוהים. ריכוז החלקיקים הנגיפיים שהתקבלו מפרוטוקול האופטימיזציה...

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של חלקיקי נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1 אנושיים עם גרימת מחזור ליטי נגיפי עם פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט. דנ"א מופק לאחר מכן מהתכשיר הנגיפי ונתון ל-PCR בזמן אמת כדי לכמת את ריכוז החלקיקים הנגיפיים.

בידוד וכימות של נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1

The Epstein-Barr virus (EBV), formally designated as Human herpesvirus 4 (HHV-4), is the first isolated human tumor virus. Nearly 90-95% of the ...

שיטה זו תאפשר לנו לבודד חלקיקי נגיף אפשטיין בר מקו התאים P3HR1 ולכמת את מלאי הנגיף כך שניתן יהיה להשתמש בו למטרות מחקר שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה קלה יחסית, זולה, מהירה ואמינה להכנת מלאי ויראלי EB. החלקיקים החיוניים המיוצרים בטכניקה זו יכולים לשמש במודלים ניסיוניים רבים במבחנה או in vivo לאבחון EB.To מתחילים, מכינים נפח של תרחיף תאים A בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, מתאימים את הנפח כך שמספר התאים הוא בערך 2.2 מיליון תאים לצלחת תרבית של 100 מילימטר.הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבות שלם לצינור. הוסף 80 מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד לצינור. לאחר מכן הוסף 350 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר PMA לצינור.הריכוז הסופי של PMA צריך להיות 35 ננוגרם למיליליטר, וזה של DMSO צריך להיות 0.08% הוסף 4.27 מיליליטר של מדיום תרבית, כך שהנפח הכולל הוא 10 מיליליטר. מערבבים את תכולת הצינור על ידי הטיה, ואז מעבירים את התוכן לצלחת תרבית של 100 מילימטר. השאירו את הצלחת באינקובטור של תרבית תאים למשך חמישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני.לאחר חמישה ימים באינקובטור צנטריפוגה את תוכן הצלחת ב 120 G במשך שמונה דקות כדי לזרוק את התאים לאסוף את הנגיף ללא תאים המכיל supernatant ולהשליך את כדור התא. שוב צנטריפוגה supernatant ב 16, 000 G במשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרוק את חלקיקי הנגיף. יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות את גלולת הנגיף בחמישה מיליליטרים של מדיום תרבית, Aliquot את ההשעיה הנגיפית לתוך 20 צינורות שכל אחד מהם מכיל 250 מיקרוליטר של התרחיף הנגיפי, ולאחסן את ההשעיה במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי להפריד את החלבונים מהדנ"א מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פנול רווי טריס לאחד הצינורות המכילים את ההכנה הנגיפית. הוסף 100 microliters של מים מערבולת היטב כדי להשיג תחליב ורוד. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 9, 650 גרם, לאסוף את supernatant ולהעביר אותו חדש 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה צינור.הוסיפו כמות שוות ערך לעשירית מנפח הנתרן אצטט הקר וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן מוסיפים מיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר גליקוגן, ומערבבים על ידי פיפטינג. הוסיפו פי שלושה מנפח הקור של הסופר-נטנט 100% אתנול ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.לבודד את צנטריפוגת הדנ"א הנגיפית ב-9, 650 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כדי לקבל גלולת DNA ושטפו את הכדור שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 70% אתנול קר. שוב צנטריפוגה ב 9, 650 G במשך 15 דקות ולהשליך את supernatant.לאחר ייבוש האוויר של הכדור במשך כ-10 דקות, יש להשעות את הכדור ב-10 עד 50 מיקרוליטרים של מים מזוקקים נטולי נוקלאז. אחסנו את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להבטיח פירוק מרבי של הדנ"א, ולאחר מכן אחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר ניקוי הכן של מיקרו ספקטרופוטומטר עם מגב משימה עדין לטעון מיקרוליטר אחד של דגימת הדנ"א מוכן ולשים לב לריכוז הדנ"א בדגימה.בדוק את יחסי הספיגה הן ב-260 עד 280 ננומטר, והן ב-260 עד 230 ננומטר. דנ"א ייספג ב-260 ננומטר, חלבונים ב-280 ננומטר, וחומרים אורגניים כמו פנול ייספגו ב-230 ננומטר. יחס של 1.8 ל -2 נחשב מספיק עבור PCR בזמן אמת.כדי להכין את תערובות התגובה של PCR, הניחו חמישה מיקרוליטרים של תערובת PCR בזמן אמת בצבע ירוק סייבר בצינורות PCR של 0.2 מיליליטר. הוסף מיקרוליטר אחד של 7.5 שומות פיקו לכל מיקרוליטר פריימר קדמי ומיקרוליטר אחד של 7.5 שומות פיקו לכל מיקרוליטר של פריימר הפוך לכל צינור. כאן, גן RNA 2 קטן EBV מוגבר.כדי לקבוע את מספר עותק הגנום של EBV. לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז ומיקרוליטר אחד של דנ"א נגיפי לאחד הצינורות. הנפח הכולל של תערובת התגובה הוא 10 microliters.הכן צינורות אחרים שישמשו כתקנים עם מספרי העתקי גנום ידועים של EBV. הפעל את תערובות ה- PCR החל משלב הפעלה ראשוני ב- 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. ואז 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות, וב 58 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.ייצא את כל גיליונות הנתונים כקבצי CSV וחשב את היומן של מספר עותקי הגנום של EBV לכל שפופרת סטנדרטית וערכי CQ ממוצעים. צור עקומת תקן qPCR על ידי התוויית ערכי ה- CT של התקנים כנגד היומן של מספר עותקי הגנום. באמצעות משוואת העלילה העקומה הסטנדרטית, לגזור את מספר עותקי הגנום של EBV בצינור ה-PCR המכיל את הדנ"א הנגיפי המושרה.לבסוף, השתמש בנוסחה המוצגת על המסך כדי לחשב את הריכוז של הכנה ויראלית המושרה. כאן X הוא מספר עותקי הגנום של EBV הנגזרים מהעקומה הסטנדרטית, ו-F הוא גורם הדילול המשמש להגדרת הדנ"א לתגובת PCR. ספירת תאים באמצעות תא המוציטומטר מוצגת כאן.ארבעה רבעים נספרים באמצעות מיקרוסקופ אור. כאן יש לספור תאים המסומנים בכחול, בעוד שאין לספור תאים באדום, מכיוון שהם נוגעים בגבולות העליונים, הימניים, התחתונים או השמאליים של הרבע. ניסוי אופטימיזציה בוצע כדי לקבוע את הריכוזים של PMA ודימתיל סולפוקסיד שיניבו את המספר הגבוה ביותר של חלקיקי EBV.ריכוז DMSO של 0.8% וריכוז PMA של 35 ננוגרם למיקרוליטר היו אופטימליים והביאו לריכוזי EBV גבוהים. המעבדה שלנו השתמשה בחלקיקים החיוניים המיוצרים בטכניקה זו כדי לבחון תגובות אוטואימוניות או דלקתיות פרו-דלקתיות לנגיף זה. כמו גם לפתח סוכני אנטי EBV חדשים.

isolation-quantification-epstein-barr-virus-from-p3hr1-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה להפקת הפך תא B באמצעות קווי Epstein-Barr הוירוס. אנחנו גם להמחיש assay רומן שיכולה לזהות תאים B עתידה לעבור שינוי מוקדם ככל שלושה ימים לאחר ההדבקה.

הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

אפיון של T-cell epitopes של פתוגנים הגורמים לזיהומים מקומיים, כגון נגיף הפפילומה האנושי, מהווה אתגר בשל מספרם המוגבל של תאי T במחזור הדם. בשיטה המתוארת, תאי T נדירים בודדו ואופיינו החל ממספר קטן מאוד של תאים.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

אנו מספקים אסטרטגיה חדשה לבידוד תאי שכפול ויראלי (RC) מתאים אנושיים נגועים באדנו-וירוס (Ad). גישה זו מייצגת מערכת נטולת תאים שיכולה לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את שכפול הגנום הנגיפי וביטויו, כמו גם ויסות האינטראקציות הוויראליות-מארח שהוקמו ב-RC.

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

שיטה פשוטה להשגת שיבוטים NK ו T תאים מחולים CAEBV פותחה עם יעילות גבוהה, כמות קטנה של דם היקפיים במינון נמוך של il-2.

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

מתוארים כאן היא שיטה יעילה כיצד לייצר מניות סיכוייו גבוהה ויראלי של וירוס הפטיטיס E (האוהב) כדי להדביק ביעילות תאים hepatoma. עם השיטה המוצגת, הן לא מעטפת, כמו גם חלקיקים ויראלי מעטוף ניתן לקצור ומשמש לצורך הצגת קווי תאים שונים.

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

למדו לבודד חלקיקי נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1 באמצעות הפעלת מחזור ליטי עם PMA. כימות הווירוס ב-PCR בזמן אמת מאפשר הכנת מלאי ויראלי אמין למחקר.

בידוד וכימות של נגיף אפשטיין-בר מקו תאי P3HR1

גלה סרטונים נוספים