מערכת ניתוח תאים היברידית להערכת שינויים מבניים והתכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי להערכת סיכון לבבי פרה-קליני

השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות הקשורות לבטיחות הלב והרעילות הפרה-קלינית באמצעות נתונים אמיתיים מבוססי אדם למעבר בטוח של מועמדים חדשים לתרופות לשלבים קליניים. במקום להשתמש במערך של טכניקות in-vitro ו- in-vivo שונות, היתרון העיקרי של מערכת היברידית זו הוא הערכה בו זמנית של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPC אנושי, פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים וכדאיות, וניתוח תכונות התכווצות בתנאים פיזיולוגיים. ניתן ליישם שיטה זו לגילוי תרופות מכיוון שהיא מכסה שינויים אלקטרופיזיולוגיים, מבניים והתכווצויים של קרדיומיוציטים ומערכת תפוקה גבוהה יותר המאפשרת בדיקה של 69 בארות בו זמנית.

כדי להתחיל בציפוי הצלחת, השאירו את תחתית לוחית הכיווץ מכוסה על ידי מגן הממברנה המסופק בנוסף עד למדידה במודול ההתכווצות. עבור זריעת קרדיומיוציטים, להכין פתרון ציפוי ג'ל EHS מדולל על ידי העברת 2.75 מיליליטר של ג'ל EHS מוכן לשימוש פתרון ו 8.25 מיליליטר של DPBS עם סידן ומגנזיום בצינור צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן מערבבים את הפתרון.

הסר את מגן הממברנה מצלחת הכיווץ. העבירו את תמיסת הציפוי המוכנה למאגר ריאגנטים סטרילי ברובוט האוטומציה של המעבדה. השתמש בתוכנית, הוסף 100 מיקרוליטרים עם רובוט האוטומציה של המעבדה והוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון הציפוי לכל באר.

לאחר מכן החזירו את המכסה לצלחת 96 הבארות ודגרו במשך שלוש שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה וספירת התאים, התאימו את התאים במדיום הציפוי המומלץ על פי הוראות יצרן התאים, והתוצאה היא 11 פעמים 10 לתאים השישיים לכל 11 מיליליטר לזריעת צלחת שלמה של 96 בארות. השתמש בתוכנית להסיר 100 microliters כדי להסיר את פתרון ג'ל EHS מן הבארות עם רובוט אוטומציה המעבדה.

לאחר מכן, העבירו את 11 מיליליטר תרחיף התאים למאגר ריאגנטים סטרילי הממוקם ברובוט האוטומציה של המעבדה, וזרעו את התאים עם 100 מיקרוליטרים של תרחיף לכל באר. באמצעות התוכנית, תאים להוסיף 100 microliters. מיד לאחר זריעת התאים, העבירו את צלחת 96 הבאר הגמישה לחממה מבוקרת לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ותנו לתאים לשקוע בן לילה.

חם 22 מיליליטר של אמצעי תחזוקה cardiomyocyte להתווסף לכל צלחת ל 37 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. 18 עד 24 שעות לאחר זריעת הצלחות, מעבירים את המדיום הטרי למאגר ריאגנטים סטרילי ומשאירים אותו ליד רובוט האוטומציה של המעבדה. לאחר מכן לבצע הסרה בינונית עם התוכנית, להסיר 100 microliters.

לאחר מכן למקם את מאגר הריאגנטים המכיל את המדיום הטרי לתוך רובוט האוטומציה של המעבדה ולחלק 200 מיקרוליטרים של המדיום הטרי לכל באר עם התוכנית, להוסיף 100 מיקרוליטר. בצע שלב זה פעמיים כדי להגיע ל-200 מיקרוליטר לבאר. מיד לאחר חילופי בינוני, להעביר את הצלחת לתוך האינקובטור.

יש לבצע החלפה בינונית אחת ליומיים עד להוספת התרכובת. ארבע עד שש שעות לפני הוספת התרכובת מבצעים שינוי בינוני סופי על ידי העברת 22 מיליליטר של חיץ בדיקה טרי וחם למאגר ריאגנטים סטרילי והשארתו ליד רובוט האוטומציה של המעבדה. מיד לאחר החלפה בינונית מעבירים את הצלחת הגמישה בחזרה לחממה.

שעה לפני המדידה הבסיסית מעבירים את הלוחית למכשיר המדידה המתאים. בתוכנת הבקרה פתח את ערוך פרוטוקול ובחר את מצב המדידה, אתר Flex או EFP העכבה המתאימים. הגדר את משך הזמן או האורך של מדידה אחת ל- 30 שניות ואת מרווח החזרה ל- 10 דקות לפני שמירת מספר הפרוטוקול.

לאחר מכן בחר התחל פרוטוקול והמשך למלא את השדות המבוקשים. לאחר הגדרת הפרמטרים, בחר התחל מדידה. בצע לפחות שלוש מדידות בסיסיות במרווחים של חמש דקות זמן קצר לפני הוספת התרכובת.

הסר 50 מיקרוליטרים של חיץ הבדיקה מכל באר מבלי להסיר את צלחת 96 הבאר הגמישה ממכשיר המדידה, ולאחר מכן תוספת של 50 מיקרוליטרים מתמיסת התרכובת המרוכזת פי ארבעה לכל באר של הצלחת בהתאם לתוכנית המדידה. לאחר הוספת התרכובת, בחר הוסף סמן ריאגנט כדי להגדיר את פריסת הלוח המורכב ואת נפח התמיסה המורכבת. לאחר מכן בחר המשך עם מדידה רגילה או המשך עם סדרת מדידות בהתאם לתוכנית הניסוי.

הניתוח המייצג מראה את ההשפעות של מעכב קינאז ארלוטיניב על התכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי. בריכוז הנמוך ביותר, ארלוטיניב גרם לירידה חסרת משמעות סטטיסטית באמפליטודה, בעוד שריכוזים מיקרומולריים של ארלוטיניב הראו השפעות קרדיוטוקסיות תלויות זמן ומינון. תחילת ההשפעה נצפתה מ-96 שעות עם מיקרומולר ארלוטיניב אחד, בעוד שטיפול ב-10 מיקרומולר ארלוטיניב הביא לירידה משמעותית 24 שעות לאחר הוספת התרכובת.

לאחר היישום של 10 micromolar Epirubicin, תאים הפסיקו להכות בתוך 24 שעות. עם יישום של מיקרומולר אחד Epirubicin, ירידה דרסטית משרעת לאחר 24 שעות היה ואחריו הפסקה פעימה מוחלטת עד 48 שעות. ב 100 ננו-מולר נצפתה ירידה תלוית זמן באמפליטודת הפעימה.

בריכוז הנמוך ביותר של 10 ננו-מולר, המשרעת השתנתה בהתמדה, ואישרה כי ההשפעה של אפירוביצין הייתה תלויה במינון בלבד. הטיפול בדוקסורוביצין וניפדיפין במשך 24 שעות מפחית את כדאיות התא באופן תלוי ריכוז וזמן. עם יישום של הגדלת ריכוזי Nifedipine, הקלטות פוטנציאליות של שדה על תאים חושפות קיצור תלוי ריכוז של משך השדה מנורמל.

הערכת Nifedipine לגבי התכווצות הלב הראתה גם ירידה משמעותית באמפליטודה התלויה בריכוז לאחר מדידה חריפה עם 10 ריכוזים ננומולריים ו-13 ננומולרים. חשוב לזכור שהתאים בדרך כלל רגישים לפרמטרים סביבתיים כמו שינויי טמפרטורה ו-pH וכן סימולציה מכנית הנתמכת במיוחד על לוחות הכיווץ.