Name: הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: חקור הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג EdU לתאים דמויי גזע במדוזה Cladonema pacificum. שיטה זו מאפשרת זיהוי תאים מחלקים ושאינם מחלקים ברמת התא הבודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי AMED תחת מענק מספר JP22gm6110025 (ל- Y.N.) ועל ידי מענק JSPS KAKENHI מספר 22H02762 (ל- Y.N.).

<ol><li>Leclère, L., Röttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+cnidarian+muscles%3A+Function%2C+anatomy%2C+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).</li>
<li>Bosch, T. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+basics%3A+Cnidarians+start+to+fire%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Back to the basics: Cnidarians start to fire.</a> Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).</li>
<li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria%3A+Are+there+unifying+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles.</a> Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+Cnidaria%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria.</a> Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).</li>
<li>Leclère, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternally+localized+germ+plasm+mRNAs+and+germ+cell%2Fstem+cell+formation+in+the+cnidarian+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia.</a> Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).</li>
<li>Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+underlie+oral+vs+aboral+regeneration+in+the+cnidarian+Hydractinia+echinata%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata.</a> eLife. 4, 05506(2015).</li>
<li>Sinigaglia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+regulation+in+a+regenerating+jellyfish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pattern regulation in a regenerating jellyfish.</a> eLife. 9, 54868(2020).</li>
<li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+stem+cells+in+Hydra%3A+Multipotency+and+decision-making%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making.</a> The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).</li>
<li>Röttinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematostella+vectensis%2C+an+emerging+model+for+deciphering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+whole-body+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration.</a> Cells. 10 (10), 2692(2021).</li>
<li>Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clytia+hemisphaerica%3A+A+jellyfish+cousin+joins+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory.</a> Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).</li>
<li>Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeron%2C+S+%22Handbook+of+Marine+Model+Organisms+in+Experimental+Biology%22">Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology</a>. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).</li>
<li>Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+progression+of+nematogenesis+from+stem+cells+through+differentiation+stages+in+the+tentacle+bulb+of+Clytia+hemisphaerica+%28Hydrozoa%2C+Cnidaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).</li>
<li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+potential+of+jellyfish%3A+Cellular+mechanisms+and+molecular+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights.</a> Genes. 12 (5), 758(2021).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibly+deployed+Pax+genes+in+eye+development+at+the+early+evolution+of+animals+demonstrated+by+studies+on+a+hydrozoan+jellyfish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).</li>
<li>Fujiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+pattern+and+morphogenesis+of+medusa+tentacles+in+the+jellyfish+Cladonema+pacificum+%28Hydrozoa%2C+Cnidaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria).</a> Zoological Letters. 5 (12), 13(2019).</li>
<li>Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+controls+body+size+growth%2C+tentacle+morphogenesis%2C+and+regeneration+in+hydrozoan+jellyfish+Cladonema+pacificum%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum.</a> PeerJ. 7, 7579(2019).</li>
<li>Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+accumulation+of+interstitial+cells+generates+the+branched+structure+of+Cladonema+medusa+tentacles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles.</a> Development. 148 (23), (2021).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+poly+A+%2B+RNA+in+sea+urchin+eggs+and+embryos+by+quantitative+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).</li>
<li>Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+in+organotypic+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60353(2019).</li>
<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+for+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The cellular basis for animal regeneration.</a> Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).</li>
<li>Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-size+regulation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ-size regulation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240(2015).</li>
<li>Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+safer%2C+urea-based+in+situ+hybridization+method+improves+detection+of+gene+expression+in+diverse+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species.</a> Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 13 (1), 8(2013).</li>
<li>Flici, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+SoxB-Hdac2+crosstalk+regulates+neurogenesis+in+a+cnidarian%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian.</a> Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).</li>
<li>Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-cycling+stem+cells+in+hydra+contribute+to+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration.</a> Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).</li>
<li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Developmental Biology. 12 (1), 34(2012).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+developmental+disparity+in+the+tentacles+of+the+moon+jellyfish+Aurelia+sp.1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1.</a> PLoS One. 10 (8), 0134741(2015).</li>
<li>Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+supports+secondary+gastrulation+in+the+moon+jellyfish+Aurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia.</a> Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).</li>
<li>Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+BrdU+staining+with+fluorescence+in+situ+hybridization+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Planarian+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians.</a> Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תאים מתרבים ותאי גזע הם מקורות תאיים חשובים בתהליכים שונים כגון מורפוגנזה, גדילה והתחדשות21,22. מאמר זה מתאר שיטה להכתמה משותפת של סמן תאי הגזע Nanos1 על ידי תיוג FISH ו- EdU ב- Cladonema medusae. עבודות קודמות שהשתמשו בתיוג EdU או BrdU הציעו כי תאים מתרבים מתמקמים לנורות זרועות הציד16,17, אך המאפיינים המולקולריים שלהם לא היו ברורים. המחקר הנוכחי מראה את הקביעה הבו-זמנית של התפלגות התאים...

Cnidaria נחשב לגוף מטזואני מסתעף בסיסי המכיל בעלי חיים עם עצבים ושרירים, מה שמציב אותם בעמדה ייחודית להבנת האבולוציה של התפתחות בעלי חייםופיזיולוגיה 1,2. קנידרים מסווגים לשתי קבוצות עיקריות: אנתוזואה (למשל, שושנות ים ואלמוגים) הם בעלי זחלי פלנולה בלבד ושלבי פוליפ ססיליים, בעוד שמדוסוזואה (חברי הידרוזואה, סטאורוזואה, סקיפוזואה וקובוזואה) לובשים בדרך כלל צורה של מדוזה בשחייה חופשית, או מדוזות, כמו גם זחלי פלנולה ופוליפים. קנידריאנים מפגינים בדרך כלל יכולת התחדשות גבוהה, והמנגנונים התאיים הבסיסיים שלהם, במיוחד החזקתם בתאי גזע בוגרים ובתאים מתרבים, משכו תשומת לב רבה 3,4. תאי גזע הידרוזואניים, שזוהו לראשונה בהידרה, ממוקמים בחללים הבין-תאיים שבין תאי אפיתל אקטודרמליים והם מכונים בדרך כלל תאים אינטרסטיציאליים או תאי i3.
תאי i הידרוזואניים חולקים מאפיינים משותפים הכוללים ריבוי פוטנציות, ביטוי של סמני תאי גזע שהשתמרו באופן נרחב (למשל, נאנוס, פיווי, ואסה), ופוטנציאל נדידה 3,5,6,7,8. כתאי גזע פונקציונליים, תאי i מעורבים באופן נרחב בהתפתחות, בפיזיולוגיה ובתגובות הסביבתיות של בעלי חיים הידרוזואניים, מה שמעיד על יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהםופלסטיותם 3. בעוד שתאי גזע, בדומה לתאי i, לא זוהו מחוץ להידרוזואנים, אפילו במין המודל המבוסס Nematostella, תאים מתרבים עדיין מעורבים בתחזוקה והתחדשות של רקמות סומטיות, כמו גם בקו הנבט9. מכיוון שמחקרים בהתפתחות והתחדשות של מדוזות נערכו בעיקר על בעלי חיים מסוג פוליפ כמו הידרה, הידרקטיניה ונמטוסטלה, הדינמיקה התאית והתפקודים של תאי גזע במיני מדוזות נותרו ברובם ללא שינוי.
המדוזה ההידרוזואנית Clytia hemisphaerica , מין מדוזה קוסמופוליטית עם בתי גידול שונים ברחבי העולם, כולל הים התיכון וצפון אמריקה, שימשה כחיית מודל ניסיונית במספר מחקרים התפתחותיים ואבולוציוניים10. עם גודלה הקטן, הטיפול הקל והביציות הגדולות שלה, Clytia מתאימה לתחזוקת מעבדה, כמו גם להכנסת כלים גנטיים כגון שיטות הטרנסגנזה והנוקאאוטשנקבעו לאחרונה 11, מה שפותח את ההזדמנות לניתוח מפורט של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס הביולוגיה של המדוזות. בזרועות הציד Clytia medusa , תאי i ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא הנורה, ואבות אבים כגון נמטובלסטים נודדים לקצה הדיסטלי תוך התמיינות לסוגי תאים שונים, כולל נמטוציטים12.
במהלך התחדשות של Clytia manubrium, איבר הפה של מדוזות, Nanos1 + i-תאים הנמצאים בגונדות נודדים לאזור שבו manubrium הוא איבד בתגובה לנזק ולהשתתף התחדשות של manubrium7. ממצאים אלה תומכים ברעיון שתאי i בקליטיה מתנהגים גם כתאי גזע פונקציונליים המעורבים במורפוגנזה ובהתחדשות. עם זאת, בהתחשב בכך המאפיינים של תאי i שונים בין בעלי חיים מייצגים מסוג פוליפ כגון הידרה ו Hydractinia3, ייתכן כי המאפיינים והפונקציות של תאי גזע מגוונים בין מיני מדוזות. יתר על כן, למעט קליטיה, טכניקות ניסיוניות הוגבלו עבור מדוזות אחרות, והדינמיקה המפורטת של תאים מתרבים ותאי גזע אינה ידועה13.
המדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum היא אורגניזם מודל מתפתח שניתן לשמור בסביבת מעבדה ללא משאבת מים או מערכת סינון. למדוזה Cladonema יש זרועות ציד מסועפות, מאפיין נפוץ במשפחת Cladonematidae, ואיבר פוטורצפטור הנקרא ocellus בשכבה האקטודרמלית ליד הנורה14. תהליך הסתעפות זרועות הציד מתרחש באתר הסתעפות חדש המופיע לאורך הצד האדאקסיאלי של זרוע הציד. עם הזמן, זרועות הציד ממשיכות להתארך ולהסתעף, כאשר הענפים הישנים נדחקים החוצה לכיוון קצה15. בנוסף, זרועות הקלדונמה יכולות להתחדש תוך מספר ימים לאחר קטיעה. מחקרים אחרונים הציעו את תפקידם של תאים מתרבים ותאים דמויי גזע בהסתעפות זרועות ציד והתחדשות בקלדונמה16,17. עם זאת, בעוד הכלאה קונבנציונלית באתרה (ISH) נוצלה כדי לדמיין ביטוי גנים בקלדונמה, בשל הרזולוציה הנמוכה שלה, כיום קשה לצפות בדינמיקה של תאי גזע ברמה התאית בפירוט.
מאמר זה מתאר שיטה להדמיית תאים דמויי גזע בקלדונמה על ידי FISH וצביעה משותפת עם EdU, סמן של התפשטות תאים18. אנו מדמיינים את תבנית הביטוי של Nanos1, סמן תאי גזע 5,17, על ידי FISH, המאפשרת זיהוי של התפלגות תאים דמויי גזע ברמת התא הבודד. בנוסף, הצביעה המשותפת של ביטוי Nanos1 עם תיוג EdU מאפשרת להבחין בין תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל. שיטה זו לניטור תאים דמויי גזע ותאים מתרבים יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של אזורי חקירה, כולל הסתעפות זרועות ציד, הומאוסטזיס רקמות והתחדשות איברים בקלדונמה, וגישה דומה יכולה להיות מיושמת על מיני מדוזות אחרים.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>Wako</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>3.1 מ"ל פיפטת העברה</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td> <td>Wako</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG-POD</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 פריימר</td><td></td><td></td> קדימה <td>5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 פריימר</td><td></td><td></td> הפוך <td>5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi פריימר</td><td></td><td></td> קדימה <td>5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi פריימר</td><td></td><td></td> הפוך <td>5'- GCGGGTCGCATTGTTGGTA CTGGC -3'</td></tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים Click-iT EdU להדמיה, צבע Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10337</td><td>ערכת EdU</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. Ltd</td><td>N/A</td><td>מנטרל כלור</td></tr><tr><td>DIG ערכת זיהוי חומצות גרעין חסימת ריאגנט</td><td>Roche</td><td>11175041910</td><td>חסימת מאגר&nbsp;</td></tr><tr><td>תערובת תוויות RNA של DIG&nbsp;</td><td>רוש</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>ECOS תא מוכשר DH5 ואלפא;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>תא מוכשר</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל/PCR גן מהיר</td> ערכת <td>מיצוי ג'ל</td><td>גן מהיר</td><td>FG-91302</td></tr><tr><td>ערכת מיני פלסמיד גן מהיר</td><td>גן מהיר</td><td>FG-90502</td><td>מיני-הכנה פלסמיד</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>Wako&nbsp;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין מחזיר</td><td>SIGMA-ALDRICH&nbsp;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל-&בטא;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Wako</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>צלחת אגר</td></tr><tr><td>LB מרק בסיס</td><td>Invitrogen</td><td>12780-052</td><td>LB</td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td> בינונית <td>Wako</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>מיני עמודות RNA סיבוב מהיר</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>טור ניקוי</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako&nbsp;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis עם ספקטרופוטומטר Wi-Fi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאטלן (20) סורביטן מונולאורט (Tween-20)</td> <td>Wako&nbsp;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>PowerMasher 2</td><td>nippi&nbsp;</td><td>891300</td><td>הומוגנייזר</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>נקראי טסק&nbsp;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td>ערכת <td>בידוד RNA כוללת</td> <td>74004</td></tr><tr><td>RQ1 ללא RNase Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>מאגר נתרן ציטראט מלוח 20x אבקה (20x SSC)</td> <td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A</td><td>תערובת של מלחים מינרליים</td></tr><tr><td>T3 RNA פולימראז&nbsp;</td><td>רוש</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>משלב הכלאה</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq DNA פולימראז</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1st ערכת סינתזת cDNA גדיל</td><td>TaKaRa</td><td>6210A</td><td></td></tr><tr><td>שיבוט יעד</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>TAK101</td><td>pTA2 וקטור</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine 5</td><td>AKOYA Biosciences</td><td>NEL745001KT</td><td>טכניקת הגברת אותות טירמיד (TSA)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר</td></tr></tbody></table>

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית cladonema pacificum

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

קנידריאנים, כולל שושנות ים, אלמוגים ומדוזות, מפגינים מורפולוגיה ואורחות חיים מגוונים המתבטאים בפוליפים ססיליים ובמדוזות שחייה חופשית. כפי שמודגם במודלים מבוססים כגון הידרה ונמטוסטלה, תאי גזע ו/או תאים מתרבים תורמים להתפתחות והתחדשות של פוליפים קנידריים. עם זאת, המנגנונים התאיים הבסיסיים ברוב המדוזות, במיוחד בשלב המדוזה, אינם ברורים במידה רבה, ולכן פיתוח שיטה איתנה לזיהוי סוגי תאים ספציפיים הוא קריטי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum. ל-Cladonema medusae יש זרועות ציד מסועפות שגדלות ללא הרף ושומרות על יכולת התחדשות לאורך כל שלב הבוגרים שלהן, ומספקות פלטפורמה ייחודית שבאמצעותה ניתן לחקור את המנגנונים התאיים המתוזמרים על ידי תאים מתרבים ו/או דמויי גזע. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה (FISH) באמצעות סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, בעוד תיוג פולסים עם 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), סמן שלב S, מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. בשילוב של תיוג FISH ו-EdU, אנו יכולים לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל על בעלי חיים קבועים, וטכניקה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על בעלי חיים אחרים, כולל מיני מדוזות שאינן דוגמניות.

זרועות הציד של קלדונמה שימשו כמודל לחקר התהליכים התאיים של מורפוגנזה והתחדשות15,16,17. מבנה זרועות הציד מורכב מצינור אפיתל שבו תאים דמויי גזע, או תאי i, ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא נורת זרועות ציד, וענפים חדשים מתווספים ברצף לחלק האחורי של האזור הדיסטלי של הנורה לאורך הצד האדקסיאלי (איור 3A)15. דיווחים קודמים הצביעו על כך שהתפשטות התאים פעילה הן בנורת זרועות הציד...

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה Cladonema. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה עם סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. יחד, ניתן לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

צביעה משותפת של ביטוי Nanos1 עם תיוג EdU מאפשרת להבחין בין תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל. אנו יכולים לזהות התפלגות תאים דמויי גזע ברמת התא הבודד במדוזה Cladonema. אנו יכולים לדמיין תאים דמויי גזע ותאים מתרבים באותה דגימת מדוזות, המאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע מתרבים ולא מתרבים, מה שמוביל להבנת ההטרוגניות של תאי גזע.ביולוגיה התפתחותית ומחקרי התחדשות באמצעות מודלים של בעלי חיים הכוללים תאי גזע. המדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum היא אורגניזם מודל מתפתח שניתן לשמור בסביבת מעבדה ללא כל מערכת מיוחדת. ל-Cladonema medusae יש זרועות ציד מסועפות.ההסתעפות מתרחשת באתר חדש לאורך הצד האדאקסיאלי של זרועות הציד. עם הזמן, זרועות הציד ממשיכות להתארך ולהסתעף, כאשר ענפים ישנים יותר נדחקים החוצה לכיוון הקצה. זרועות הציד יכולות גם להתחדש תוך מספר ימים לאחר הקטיעה.גודל קטן, טיפול קל ונוכחות של תאי גזע בוגרים או תאים דמויי גזע הופכים את Cladonema למערכת טובה לחקור את תפקידם של תאי גזע בתהליכים שונים. כדי להתחיל, מקם את Cladonema medusae לתוך צינורות 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה העברה של 3.5 מיליליטר והוסף ASW עד לנפח כולל של 500 מיקרוליטר. הוסיפו 7.5 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי EdU של 10 מילימולר ודגרו את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס.המתן שעה והסר כמה שיותר ASW המכיל EdU. לאחר הרדמת המדוזה, לדגור במשך חמש דקות. תקן את המדוזה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם 4% פרפורמלדהיד ב- ASW.לטיפול בפרוטאינאז ולאחר קיבוע, הסר את הפרפורמלדהיד ושטוף את הדגימות עם PBS המכיל 0.1% Tween 20 thrice במשך 10 דקות כל אחת. הסר את ה- PBST והוסף את מאגר ההכלאה. דגירה של הדגימות במאגר ההכלאה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.הסר את מאגר ההכלאה והוסף את מאגר ההכלאה החדש. טרום הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות באינקובטור הכלאה. הסר את מאגר ההכלאה ודגירה עם מאגר ההכלאה המכיל את הבדיקות.הכלאה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות באינקובטור הכלאה. לאחר מכן, המשך בהסרת בדיקה. התחל עם הסרת מאגר ההכלאה המכיל בדיקות ולאחר מכן הוסף מאגר שטיפה אחד.לשטוף את הדגימות עם מאגר לשטוף פעמיים במשך 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. הסר את מאגר הכביסה אחד והוסף את מאגר הכביסה שניים. שטפו את הדגימות במאגר פעמיים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.הסר את מאגר הכביסה 2 ולאחר מכן הוסף 2X SSC. לשטוף את הדגימות עם 2X SSC פעמיים במשך 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. הסר 2X SSC ולאחר מכן הוסף PBST שחומם מראש.שטפו את הדגימות במשך 15 דקות עם PBST בטמפרטורת החדר. עבור דגירה של נוגדנים נגד DIG, התחל על ידי הסרת PBST ולאחר מכן הוסף מאגר חוסם 1%. דגרו את הדגימות למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור איטי על נדנדה.לאחר החסימה, הסר את המאגר החוסם 1%. הוסיפו תמיסת אנטי-DIG-POD ודגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי לזהות את הבדיקה המסומנת ב- DIG, הסר את התמיסה נגד DIG-POD והוסף חיץ Tween של טריס נתרן כלורי.שטפו את הדגימות עם חיץ Tween של טריס נתרן כלורי שלוש פעמים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. דילול תמיסת מלאי טירמיד מצומדת בצבע פלואורסצנטי במאגר המדולל של ההגברה כדי ליצור את תמיסת הטירמיד הפעילה Cy5. הסר כמה שיותר חיץ טריס נתרן כלורי Tween ולאחר מכן הוסף את תמיסת הטירמיד הפעילה Cy5.לדגור את הדגימות במשך 10 דקות בחושך. לשטוף את הדגימות עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות בחושך. כדי להכין את קוקטייל זיהוי EdU, מערבבים את הרכיבים.הסר PBST ולאחר מכן הוסף את קוקטייל זיהוי EdU. לדגור את הדגימה בחושך במשך 30 דקות. יש לשטוף עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות בחושך.לצביעת DNA, יש לדלל את Hoechst ב-PBST כדי להכין את תמיסת Hoechst. הסר את ה- PBST ולאחר מכן הוסף את פתרון Hoechst. דגירה של הדגימות במשך 30 דקות בחושך.שטפו את הדגימות עם PBST שלוש עד ארבע פעמים למשך 10 דקות בחושך. הבא להרכבה, להעביר את medusae לבנק על זכוכית שקופית באמצעות פיפטה העברה עם קצה מנותק. יש להניח בעדינות כיסוי על המדוזה בעזרת מלקחיים ולאטום את צד הכיסוי עם לק שקוף.התיוג המשותף של ביטוי Nanos1 ותאים חיוביים של EdU חשף את התבנית המרחבית של תאים דמויי גזע ותאים מתרבים בזרוע. תאים חיוביים של EdU הופצו באופן נרחב יותר בכל נורת זרועות הציד, בעוד שתאים חיוביים של Nanos1 שהצטברו באופן מקומי יותר בנורת זרועות הציד ובאתר ההסתעפות החדש, מצביעים על כך שהתפלגויות שונות של תאים דמויי גזע ותאים מתרבים מזוהות בהתאם לתזמון ההתפתחותי ולשלבים שונים. התיוג המשותף של EdU ו-Nanos1 נצפה ב-19.79% מהתאים, מה שמרמז על כך שתאים אלה הם אוכלוסיית תאי גזע המתרבה באופן פעיל.באופן מסקרן, 14.46% מהתאים נמצאו כחיוביים ל-EdU Nanos1 שליליים במרכז הנורה ובאתר ההסתעפות החדש, מה שמרמז על נוכחותם של תאים מתרבים שאינם דמויי גזע. לעומת זאת, 26.32% מהתאים נצפו כחיוביים ל-EdU שלילי Nanos1 בבסיס הנורה ובאתר ההסתעפות החדש, מה שמעיד על נוכחות של אוכלוסיית תאי גזע שהיא מחזורית איטית או שקטה, שאף אחד מהם לא זוהה על ידי תיוג דופק EdU. תיוג דופק EdU עם זמן דגירה קצר מאפשר זיהוי של תאים מתרבים בלבד בקרב תאים דמויי גזע ותאים שאינם דמויי גזע.כאשר משנים את זמן הדגירה עבור EdU ומשלבים ניסויי מרדף ארוכי שנים, ניתן לסמן תאי גזע בעלי מחזור איטי או סוגי תאים אחרים כולל צאצאים ותאים ממוינים.

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

חקור הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג EdU לתאים דמויי גזע במדוזה Cladonema pacificum. שיטה זו מאפשרת זיהוי תאים מחלקים ושאינם מחלקים ברמת התא הבודד.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum

גלה סרטונים נוספים