Name: תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למד פרוטוקול מפורט ליצירת אובדן שמיעה מרעש בעכברים C57BL/6J באמצעות חשיפה למשתנים קוליים מכוילים. השיטה כוללת מדידת ABR, ניתוח היסטולוגי של תאי השערה החיצוניים והערכת שיקום השמיעה לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) של ממשלת טייוואן (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), ולמענקי מחקר פנימיים מהמכללה הרפואית Mackay (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

ניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של Mackay Medical College. עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות נרכשו ממרכז חיות המעבדה הלאומי (העיר טאיפיי החדשה, טייוואן). כל העכברים גודלו ושוכנו בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של בעלי חיים.
1. השראת NIHL בעכברים
<ol><li>הכינו את הכלוב לעכברי הניסוי<ol><li>לשם כך, השתמשו בכלוב מלכודת חולדות במידות של 14 ס"מ × 17 ס"מ ×-24 ס"מ. חתכו ארבע חתיכות של לוחות פלסטיק גלי לגדלים מתאימים, כך שיתאימו לכלוב (13 ס"מ × 23 ס"מ ו-13 ס"מ × 16 ס"מ).</li>
		<li>כדי למנוע מהעכברים לחתוך את רגליהם על ידי רשת הרשת, הניחו שתיים מהחתיכות בחלק התחתון ובצד האחורי, בהתאמה. הניחו את שני החלקים האחרים בניצב זה לזה, כדי לחלק את החלל בתוך הכלוב לרבעים.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע מחקר זה בתיבה אטומה לרעש. הניחו רמקול 8.5 ס"מ לפני הכלוב, והניחו גם את הרמקול וגם את הכלוב בקופסה אטומה לרעש.</li>
	<li>פתח את תוכנת היישום CLIO</li>
	<li>העבר את הסמן לסמל הרמקול ולאחר מכן לחץ על TwoSin. הזן ושנה את הערך של Freq 1 עד 1000 Hz, Freq 2 עד 6000 Hz, ולחץ על אישור כדי להתחיל להשמיע את הצליל.</li>
	<li>תחת הכרטיסיה Leq, שנה את dBV ל- dBSPL. לאחר הגדרת השעה בממשק התוכנה, לחץ על כפתור המשולש הירוק כדי להשמיע את הצליל.</li>
	<li>מקם מיקרופון מול הרמקול במרחק של 8.5 ס"מ כדי לכייל את עוצמת הרעש (ראה קובץ משלים 1). כוונן את רמת הרעש ל- 125 dB SPL-A ונטר ברציפות במשך לא פחות מ -3 דקות כדי להבטיח שרמת הרעש יציבה מספיק. השתמש בגנרטור, אנלייזר ומגבר כדי ליצור ולשלוט ברעש. (איור 1) הערה: בצע שלב זה בתיבה אטומה לרעש כדי למנוע נזק לשמיעה של המפעיל.</li>
	<li>הכניסו לכלוב ארבעה עכברי C57BL/6J זכרים (אחד לכל רבע) לחשיפה לרעש. הקצו באופן אקראי את העכברים בכל רבעון במהלך החשיפה לרעש. הניחו מיקרופון על החלק העליון של הכלוב כדי לנטר את רמת הרעש במהלך החשיפה לרעש (איור 2). הערה: בצע שלב זה בתיבה אטומה לרעש כדי למנוע נזק לשמיעה של המפעיל.</li>
	<li>חשוף את העכברים לרעש בתדרים של 1 קילוהרץ ו-6 קילוהרץ ברציפות במשך 6 שעות ביום, במשך 5 ימים רצופים.</li>
	<li>מדוד את ספי השמיעה של העכברים יום אחד לאחר החשיפה לרעש (כלומר, ביוםהשישי ) על ידי מדידת ABR. חזור על מדידות ABR אלה שוב שבוע לאחר החשיפה לרעש (כלומר, ביום ה- 13). לאחר מדידות ABR, הקריבו את כל העכברים המעורבים וקצרו את השבלול שלהם (איור 3).</li>
</ol>2. הערכה מבוססת תגובה שמיעתית בגזע המוח (ABR) של סף השמיעה
<ol><li>השתמש במערכת בדיקת ABR מסחרית שתוכננה במיוחד עבור בעלי חיים קטנים10.</li>
	<li>הזרקה תוך-צפקית תערובת של טילטמין וזולאזפאם (40 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (9.3 מ"ג/ק"ג) לעכברים להרדמה כללית. הערה: הערכת ABR אורכת ~ 2 שעות. הקפידו לספק תמיכה תרמית באמצעות כרית חימום ומרחו משחת עיניים למניעת יובש בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה.</li>
	<li>למדוד את ABR בעכבר תחת הרדמה כללית. הניחו אלקטרודות מחט תת-עורית (12 מ"מ) בקודקוד, מאחורי הפינה של האוזן השמאלית, ובחזרה ליד הזנב כדי למדוד את סף השמיעה.</li>
	<li>הציגו גירויים אקוסטיים באמצעות רמקול הממוקם במרחק של 1 ס"מ מאוזן שמאל של החיה.</li>
	<li>השתמש באוסילוסקופ כדי לשלוט בגירויים האקוסטיים. בחר Sine Wave עבור הגירויים ו- 10 k עבור קנה המידה של החלון. סובב את ידית התדר כדי לקבל את התדר הרצוי של הגירויים האקוסטיים.</li>
	<li>התאם את עוצמת הגירוי על ידי סיבוב ידית AMLP על מחולל הפונקציות. השג את עוצמת הגירוי הרצויה על ידי סיבוב ידית AMLP למתח מתאים, המחושב מכיול.</li>
	<li>אסוף את מדידות ABR תחת סדרה של עוצמות גירוי, מ 10 dB SPL ל 100 dB SPL, עם גודל צעד 10 dB. הערה: מדוד את סף השמיעה בתיבה אטומה לרעש. רמת עוצמת הגירוי המינימלית שיכולה ליצור גל V שניתן להבחין בו באות שנאסף הונחה כסף ABR10,11 (איור 4). לאחר הערכת ABR, עקוב אחר בעל החיים עד שהוא מתאושש מהרדמה (~ 1 שעות).</li>
</ol>3. בדיקה מיקרוסקופית
<ol><li>תיקון הרקמה שנקטפה<ol><li>לאחר מדידות ABR, להקריב את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית תערובת של tiletamine ו zolazepam (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (23.25 מ"ג / ק"ג) עבור הבדיקה המיקרוסקופית.</li>
		<li>קצרו את השבלול מהעכבר וטבלו אותו מיד בפורמלדהיד 10% (FA) לקיבוע (שני שבלול/מ"ל) למשך 8 שעות לפחות ב-4°C.</li>
		<li>לאחר הקיבוע, החלף את תמיסת FA בתמיסת חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) 10% להסתיידות למשך 3-4 ימים ב-4°C. לאחר מכן, בדקו כל שבלול בפינצטה כדי לוודא שהשבלול מרוכך מספיק.</li>
		<li>הניחו את השבלול בצלחת פטרי מלאה במי מלח חוצצי פוספט (PBS), וחתכו את האיבר בצורת ספירלה של קורטי (OC) (כל שבלול מסויד) לשלושה חלקים - הסיבוב הבסיסי, הסיבוב האמצעי, והתור האפי - לצביעת רקמות.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה: 8x-35x), להסיר את המבנים הגרמיים (scala vestibuli, scala tympani, ו modiolus) של שבלול decalcified ולקבל את הרקמה הרכה, כולל OC (עובי: כ 40 מיקרומטר).</li>
	</ol></li>
	<li>צביעת שבלול אימונופלואורסנציה<ol><li>הכנת המאגר החוסם: הכינו תמיסות אלבומין 2% בסרום בקר (BSA) ו-0.2% טריטון X-100 ב-PBS.</li>
		<li>מעבירים את הרקמה המוכתמת מצלחת הפטרי לצינור מיקרוצנטריפוגה, וטובלים את הרקמה ב-0.1 מ"ל של החיץ החוסם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>הכנת מאגר הנוגדנים הראשוני Myo7A: יש לדלל את הנוגדן הראשוני Myo7A במאגר החוסם ביחס נפח של 1:200.</li>
		<li>טפל ברקמה בצינור המיקרוצנטריפוגה עם 100 μL של מאגר נוגדנים ראשוני Myo7A למשך שעתיים ב- RT.</li>
		<li>שטפו את הרקמה שלוש פעמים ב-PBS במשך 5 דקות כל אחת.</li>
		<li>הכנת נוגדן משני Myo7A (Myo7A-Rb-488) ונוגדן פאלואדין (phalloidin-594) חוצץ: נוגדן משני מדולל Myo7A (1:400) ונוגדן פאלואדין (1:200) במאגר החסימה.</li>
		<li>טפל ברקמה עם 100 μL של נוגדן משני Myo7A וחיץ נוגדנים phalloidin במשך 2 שעות ב RT.</li>
		<li>לאחר טיפול בנוגדנים + פלואדין יש לשטוף את הרקמה ב-PBS שלוש פעמים, למשך 5 דקות כל אחת.</li>
		<li>מעבירים את הרקמה שטופה מצינור המיקרוצנטריפוגה לצלחת פטרי מלאה PBS באמצעות פיפטת העברת פלסטיק 1 מ"ל עם קצה חתוך.</li>
		<li>כדי להתכונן לבדיקה המיקרוסקופית, פתחו את הרקמה, הניחו אותה על מגלשת זכוכית והוסיפו 15 μL של מדיום פלואורומאונט 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) על הרקמה כדי לכסות אותה במלואה. הניחו כיסוי זכוכית בעדינות על הרקמה. השאירו את המגלשה למשך הלילה ב-RT לפני שתאטמו אותה בלק.</li>
	</ol></li>
	<li>רכישת תמונות<ol><li>קבל תמונות דו-ממדיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף ותוכנה לרכישת תמונות.</li>
		<li>לפני ביצוע הבדיקה המיקרוסקופית יש לרכז את הרקמה בשדה הראייה ולהתאים את הרגישות ל-ISO 100. התאם את זמן החשיפה בתחילה על ידי לחיצה על כפתור המצב האוטומטי של התוכנה, ולאחר מכן כוונן ידנית על ידי לחיצה על כפתור התאם כדי למטב את יחס האות לרעש.</li>
		<li>התאם את אורך הגל של אור האירוע כדי לעורר את הפלואורופורים על ידי סיבוב קוביית הפלואורסצנטיות. צבעים מדומים שימשו לסימון הפליטה מתוויות פלואורסצנטיות שונות (אור כחול: DAPI; אור ירוק: Myo7A; אור אדום: phalloidin).</li>
		<li>על ידי סריקת דגימת הרקמה, צור ואסוף את נתוני ההדמיה כקבצי תמונה .tif ו- .jpg.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים לחשוף.

ניתן לחלק את NIHL לשני סוגים: NIHL זמני, אשר מראה שינוי זמני של סף השמיעה, ו- NIHL קבוע, אשר מתבטא בשינוי סף שמיעה קבוע. ליקוי השמיעה שראינו ביוםהשישי (יום אחד לאחר החשיפה לרעש) הוא ככל הנראה שילוב של שני סוגים אלה. במקרה זה, סף השמיעה יראה התאוששות הדרגתית לאורך זמן בשל המרכיב הזמני של ליקוי שמיעה. במחקרים הניסיוניים הראשוניים שלנו, התוצאות שהתקבלו עם אותו מערך ובעלי חיים, ליקוי השמיעה שנוצר על ידי חשיפה לרעש של יומיים התאושש לחלוטין תוך שבועיים, מה שמצביע על כך ש- NIHL קבוע לא נוצר בפועל. להיפך, במחקר זה, לי...

כ-1.3 מיליארד אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה כתוצאה מחשיפה לרעש1. במחקר זה, שאפנו לבסס תהליך ברור שלב אחר שלב לגרימת ואישור אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). NIHL נובע מניוון/הרס של תאי השערה (HCs) ונוירוני גנגליון ספירליים (SGNs), נזק בסטריאוסיליה של HC ו/או אובדן סינפסות בין HCs פנימיים של השבלול לבין SGNs. חריגות כאלה עלולות לגרום גם לטינטון ולפגיעה בתפיסת הדיבור (במיוחד בסביבה אקוסטית מורכבת) מלבד NIHL. תפקודים חברתיים, פסיכולוגיים וקוגניטיביים עשויים להיות מושפעים ברצף מליקויים פיזיולוגיים אלה 2,3,4,5,6.
במחקרים פרה-קליניים הקשורים ל-NIHL המבוססים על עכברים, זני העכבר הפופולריים ביותר הם CBA/CaJ 2,3,6,7 ו-C57BL/6 4,5,8. יתר על כן, העכברים הזכרים 3,4,7 נפוצים יותר מהנקבות, שכן לאסטרוגן יש השפעה מגנה על השמיעה. לכן, במחקר הזה השתמשנו רק בעכברים זכרים9. לאחר התייחסות לספרות, בחרנו 1 קילוהרץ ו 6 קילוהרץ כתדרים של הרעש המופעל. עוצמת הרעש שהופעל הייתה 115 dB SPL-A (המקיף את הכלוב) עד 125 dB SPL-A (במרכז הכלוב). לאחר חשיפת עכברי הניסוי לרעש ברציפות במשך 6 שעות ביום, במשך 5 ימים רצופים, עלייה אופטימלית בסף השמיעה הצביעה על היקף אופטימלי של NIHL שנוצר בעכברי הניסוי. הפעולות לטיפול בבעלי החיים, בניית מערך הניסוי וגרימת רעש מתוארות בבירור שלב אחר שלב בפרוטוקול שסופק.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; סט מיקרופון סטנדרטי בשדה חופשי CCP 1/4 אינץ'</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>לחשיפה לרעש</td></tr><tr><td>מודול קלט מגבר, AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתי</td></tr><tr><td>מגבר ביו, BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתית</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>תוכנת צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Cellens</td><td>אולימפוס מדעי</td><td></td> החיים <td>רכישת תמונה</td></tr><tr><td>פלסטיק</td><td></td><td></td><td></td>גלי</tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td>הסרת אבדן</td></tr><tr><td>מגבר תגובה מעורר, ERS100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת</td></tr> <tr><td>גזע המוח השמיעתיתפורמלדהיד</td><td>APLHA</td><td>F030410</td><td>קיבוע של</td></tr><tr><td>מערכת שבלול לרכישת נתונים בעלי ביצועים גבוהים, MP160</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתי</td></tr><tr><td>כבל מאריך מודולרי, MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתית</td></tr><tr><td>Myo7A נוגדן ראשוני</td><td>פרוטאוס</td><td>25-6790</td><td>נוגדן משני צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Myo7A</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>711-545-152</td> אלקטרודת מחט <td>לצביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>, חד קוטבית 12 mmTp, EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתי</td></tr><tr><td>נוגדן פלואידין</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td><td>אימונופלואורסצנטי מכתים</td></tr><tr><td>מי מלח עם חוצץ פוספט</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>כלוב</td><td></td><td></td> מלכודת חולדות <td>14 ס"מ x 17 ס"מ x 24 ס"מ</td></tr><tr><td>ROMPUN- הזרקת קסילזין, תמיסה&nbsp;</td><td>מגבר סאונד Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>לחשיפה לרעש</td></tr><tr><td>מחולל סאונד/מנתח/שונות, FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>לחשיפה לרעש</td></tr><tr><td>תא אטום לרעש</td><td>IEA טכנולוגיה אלקטרו-אקוסטית</td><td>לחשיפה לרעש ורמקול ABR</td>&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td>טכנולוגיה <td></td><td>אלקטרו-אקוסטית של IEA</td> למודול ממריץ <td>חשיפה לרעש</td></tr><tr><td>, STM100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתית</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td> סט <td>צינוריות צביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>, OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>לתגובת גזע המוח השמיעתי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף, רכישת תמונה BX53</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זולטיל</td><td>וירבאק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

מודל בעל חיים של ליקוי שמיעה הנגרם מרעש (NIHL) שימושי עבור פתולוגים, מטפלים, פרמקולוגים וחוקרי שמיעה כדי להבין לעומק את המנגנון של NIHL, ולאחר מכן לייעל את אסטרטגיות הטיפול המתאימות. מחקר זה נועד ליצור פרוטוקול משופר לפיתוח מודל עכבר של NIHL. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים. עכברים לא מורדמים נחשפו לרעשים חזקים (1 ו -6 קילוהרץ, שהוצגו בו זמנית ב 115-125 dB SPL-A) ברציפות במשך 6 שעות ביום במשך 5 ימים רצופים. תפקוד השמיעה הוערך יום ושבוע לאחר החשיפה לרעש, באמצעות תגובת גזע המוח השמיעתית (ABR). לאחר מדידת ABR, העכברים הוקרבו, ואיבריהם של קורטי נאספו עבור צביעה immunofluorescence. ממדידות התגובה השמיעתית של גזע המוח (ABR), נצפה ליקוי שמיעה משמעותי יום אחד לאחר החשיפה לרעש. לאחר שבוע אחד, סף השמיעה של עכברי הניסוי ירד ל~80 dB SPL, שעדיין היה רמה גבוהה משמעותית מעכברי הביקורת (~ 40 dB SPL). מתוצאות ההדמיה האימונופלואורסצנטית, תאי השערה החיצוניים (OHC) הוכחו כפגומים. לסיכום, יצרנו מודל של NIHL באמצעות עכברי C57BL/6J זכרים. מכשיר חדש ופשוט ליצירה והעברה של רעש צליל טהור פותח ולאחר מכן נעשה בו שימוש. מדידות כמותיות של ספי שמיעה ואישור מורפולוגי של נזקי OHC הראו שניהם כי הרעש המופעל גרם בהצלחה לאובדן שמיעה צפוי.

שינוי בסף השמיעה של ABR סף השמיעה של העכברים נמדד באמצעות ABR מתפרץ טון יום אחד או שבוע לאחר החשיפה לרעש. נצפתה עלייה משמעותית בסף השמיעה בכל שלושת התדרים שנבדקו (12 קילוהרץ: 84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 קילוהרץ: 91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 קילוהרץ: 98.57 ± 1.43 dB SPL) יום אחד לאחר החשיפה לרעש (כלומר, היום השישי). התאוששות שמיעה חלקית התרחשה שבוע לאחר החשיפה לרעש (כלומר, היום ה-13), אך ספי השמיעה עדיין היו גבוהים ביותרמ-30 dB בכל התדרים (12 kHz: 72.86 ± 2.86 dB SPL; 24 kHz: 84.29 ± 2.77 ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מודל עכבר של ליקוי שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). כדי ליצור את NIHL, פיתחנו מכשיר חדש ופשוט העשוי מפלסטיק גלי, כלוב מלכודת חולדות ורמקול. תגובת גזע המוח השמיעתי והדמיית אימונופלואורסצנטיות שימשו להערכת תפקוד השמיעה והנזק לתאי השערה החיצוניים, בהתאמה.

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

למרות שהיו מחקרים על אובדן שמיעה כתוצאה מרעש, אף אחד מהם לא תיעד את השיטה בפירוט כזה, מה שהופך את זה להליך חשוב. שיטה זו גרמה למעשה לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים, וצופה בשינויים בפועל בסף השמיעה על ידי ABR. מודל בבעלי חיים של ליקוי שמיעה הנגרם כתוצאה מרעש שימושי עבור מדענים כדי להבין לעומק את המנגנון של אובדן שמיעה הנגרם כתוצאה מרעש, ולאחר מכן לייעל את אסטרטגיות הטיפול המתאימות.מי שתדגים את ההליך תהיה דיאן-שיו לי, סטודנטית מוכשרת מאוד מהמעבדה שלי. כדי להכין את הכלוב לעכברי הניסוי, השתמשו בכלוב מלכודת חולדות וחתכו ארבע חתיכות של לוחות פלסטיק גלי לגדלים מתאימים, כדי להתאים אותם לכלוב. כדי למנוע מהעכברים לחתוך את רגליהם על ידי רשת הרשת, הניחו שתיים מהחתיכות בחלק התחתון ובצד האחורי, בהתאמה.מניחים את שני החלקים האחרים בניצב זה לזה, כדי לחלק את החלל בתוך הכלוב לרבעים פתח את תוכנת היישום CLIO. העבר את הסמן לסמל הרמקול ולחץ על TwoSin. הזן ושנה את הערך של תדר 1 עד 1, 000 הרץ, תדר 2 עד 6, 000 הרץ ולחץ על אישור כדי להתחיל להשמיע את הצליל.תחת הכרטיסיה Leq, שנה את dBV ל- dBSPL. לאחר הגדרת השעה בממשק התוכנה, לחץ על כפתור המשולש הירוק כדי להשמיע את הצליל. מקם מיקרופון מול הרמקול במרחק של 8.5 ס"מ כדי לכייל את רמת הרעש.כוונן את רמת הרעש ל- SPL-A של 125 דציבלים, ונטר ברציפות במשך שלוש דקות לפחות כדי לוודא שרמת הרעש מיוצבת מספיק. השתמש בגנרטור, אנלייזר ומגבר כדי ליצור ולשלוט ברעש. הכניסו לכלוב ארבעה עכברי C57 שחורים 6J זכרים, אחד לכל רבע, לחשיפה לרעש.הקצו באופן אקראי את העכברים לכל רבעון במהלך החשיפה לרעש. הניחו מיקרופון בחלק העליון של הכלוב כדי לנטר את רמת הרעש במהלך החשיפה לרעש. הניחו את הכלוב לפני הרמקול בתוך קופסה אטומה לרעש, וודאו שהרמקול ממוקם במרחק של 8.5 סנטימטרים מהכלוב.חשוף את העכברים לרעש בתדרים של קילוהרץ אחד ושישה קילוהרץ ברציפות במשך שש שעות ביום, במשך חמישה ימים רצופים. מדוד את ספי השמיעה של העכברים ביום השישי וה -13 על ידי מדידת ABR. השתמש במערכת בדיקת ABR מסחרית, שתוכננה במיוחד עבור בעלי חיים קטנים למדידות ABR, ותחזק את בעל החיים בהרדמה כללית.הניחו אלקטרודות מחט תת-עורית בקוטר 12 מ"מ בקודקוד מאחורי הפינה של האוזן השמאלית, ובחזרה ליד הזנב, כדי למדוד את סף השמיעה. לאחר הנחת הרמקול במרחק של סנטימטר אחד מאוזן שמאל של החיה, הציגו גירויים אקוסטיים באמצעות הרמקול. בחר גל סינוס עבור הגירויים, ו- 10 k עבור קנה המידה של החלון.סובב את ידית התדר כדי לקבל את התדר הרצוי של הגירויים האקוסטיים. התאם את עוצמת הגירוי על ידי סיבוב ידית AMLP על מחולל הפונקציות. השג את עוצמת הגירוי הרצויה על ידי סיבוב ידית AMLP למתח מתאים המחושב מכיול.אספו את מדידות ה-ABR תחת סדרה של עוצמות גירוי מ-10 עד 100 דציבלים SPL, עם גודל צעד של 10 דציבלים. סמן את רמת עוצמת הגירוי המינימלית שיכולה ליצור גל V שניתן להבחין בו כסף ABR. הקריבו את העכברים לאחר מדידות ABR, וקצרו את השבלול מהעכברים שעברו המתת חסד.מיד לאחר קצירת הרקמות, לטבול אותם 10% פורמלין לקיבוע, ולתת להם לנוח לפחות שמונה שעות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש ב- EDTA להסתיידות, כמתואר בטקסט. מניחים את השבלול בצלחת פטרי מלאה PBS.עבור צביעת רקמות, חתכו את האיבר בצורת ספירלה של קורטי, או OC, לשלושה חלקים: הסיבוב הבסיסי, הסיבוב האמצעי והסיבוב האפיקאלי. תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של 8x עד 35x, להסיר את המבנים הגרמיים הכוללים scala vestibuli, scala tympani, ו modiolus של שבלול decalcified, ולקבל את הרקמות הרכות, כולל OC. עלייה משמעותית בסף השמיעה נצפתה ב-12 קילוהרץ, 24 קילוהרץ ו-32 קילוהרץ יום לאחר החשיפה לרעש. התאוששות שמיעה חלקית התרחשה שבוע לאחר החשיפה לרעש, אך ספי השמיעה עדיין היו גבוהים ביותר מ-30 דציבלים בכל התדרים בהשוואה לקבוצות הביקורת.במחקר זה, השמיעה נפגעה יותר בתדרים גבוהים. הבדל משמעותי נצפה בסף השמיעה בין קבוצת הביקורת לבין קבוצת הניסוי ביום השישי וה-13, 12 קילוהרץ ו-32 קילוהרץ. אובדן תאי השערה החיצוניים נצפה באופן עקבי בתמונות המיקרוסקופיות שהתקבלו מעכברי NIHL, בהשוואה לאלה של עכברי הביקורת.בעוד תאי השערה הפנימיים נותרו שלמים בכל התמונות, תאי השערה החיצוניים בסיבובי הבסיס והאמצע של OC ניזוקו קשות. לעומת זאת, תאי השערה החיצוניים בסיבוב האפי היו כמעט שלמים. השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה כולל חשיפה לרעש, מדידת ABI, קצירת השבלול.הליך זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה לרעש בתדרים שונים על אובדן שמיעה באמצעות סוגים שונים של קול.

modified-experimental-conditions-for-noise-induced-hearing-loss-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה מהירה וזולה לקביעת ההתנהגות של שמיעת פרמטרים כמו סף שמיעה, שמיעת ליקויים או תפיסות פנטום (טינטון סובייקטיבי) הוא תאר. הוא משתמש בעיכוב דופק מראש של התגובה בלה אקוסטית וניתן ליישם בקלות במחשב אישי באמצעות ספירה לתכנות / DA-ממיר וחיישן piezo.

הגדרת עלות נמוכה לaudiometry התנהגות במכרסמים

סרטון וידאו זה מדגים שיטה להערכת סינפסות רצועת הכלים באזורים ספציפיים של שבלול העכבר. הוא משתמש בטכניקות דימות חיסוני וקונפוקלי כדי לזהות סינפסות תפקודיות על פני אזורי תדר שונים בכל סיבוב שבלול.

הערכה של סינפסות ברצועת הכלים באזורי תדר ספציפיים של שבלול העכבר

מקור: Lee, D. et. al., תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי שיער חיצוניים. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את ההליך של אובדן שמיעה הנגרם מרעש בעכברים. צליל בעוצמה גבוהה פוגע בתאי השיער באוזן הפנימית ומשבש את מסלולי השמיעה, וכתוצאה מכך לפגיעה בשמיעה.

גרימת אובדן שמיעה בעכברים באמצעות חשיפה ממושכת לקול בעוצמה גבוהה 

מקור: Lee, D., et. al. תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה הנגרם מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השיער החיצוניים. J. Vis. exp. (2023)הסרטון הזה מדגים את מדידת תגובת גזע המוח השמיעתית (ABR) בעכבר. אלקטרודות מונחות על הראש, מאחורי האוזן וליד זנבו של עכבר מורדם. גירויים אקוסטיים בעוצמות שונות מועברים ואותות חשמליים הנוצרים נרשמים כצורות גל.

מדידת תגובת גזע המוח השמיעתי בעכברים

הגישה הכירורגית הפוסט-אפרכסת המתוארת מאפשרת אספקה מהירה וישירה לשבלול העכבר scala tympani תוך מזעור אובדן דם ותמותת בעלי חיים. ניתן להשתמש בשיטה זו לטיפול בשבלול באמצעות העברה מולקולרית, פרמקולוגית וויראלית לעכברים לאחר לידה דרך קרום החלון העגול.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

שתי גישות מיקרו-כירורגיות להעברת תרופות מקומיות לאוזן הפנימית מתוארות כאן ומושוות במונחים של השפעה על פרמטרי שמיעה, ציטוארכיטקטורה של השבלול וביטוי סמנים דלקתיים.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy Versus הזרקת Transtympanic

מודלים חייתיים של שתלי שבלול יכול לקדם את הידע בסיסי טכנולוגיים לטיפול אובדן שמיעה sensorineural קבוע עם גירוי חשמלי. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה עכברים, כמו גם את הערכת תפקודי עם גזע המוח השמיעתית תגובה.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

גזע המוח מעורר תגובה audiometry הוא כלי חשוב נוירופיזיולוגיה קלינית. כיום, גזע המוח התגובה עורר מאומטריה הוא גם מיושם במדע הבסיסי מחקרים טרום קלינית מעורבים הן מודלים תרופתי וגנטי בעלי חיים. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של איך התגובות שמיעתי גזע המוח ניתן להקליט וניתח בהצלחה בעכברים.

רכישת נתונים וניתוח בברטומטריה תגובה מעורר בעכברים

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

למד פרוטוקול מפורט ליצירת אובדן שמיעה מרעש בעכברים C57BL/6J באמצעות חשיפה למשתנים קוליים מכוילים. השיטה כוללת מדידת ABR, ניתוח היסטולוגי של תאי השערה החיצוניים והערכת שיקום השמיעה לאורך זמן.

תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים

גלה סרטונים נוספים