טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין

ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין היא אחת ממערכות העברת ה-mRNA הריאתיות הפוטנציאליות. הפרוטוקול שלנו מייצר את הננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין עם פרודוקטיביות ויעילות גבוהות יותר, מה שמקל על פיתוח חיסון ה-mRNA הרירי. החומרים הנדרשים על ידי הטכניקה הם בעלות נמוכה, ואת הפרוטוקול ניתן להשלים בתוך זמן קצר.

לננו-חלקיקי הפפטיד-פולוקסאמין יש את היכולת לתווך העברה יעילה של mRNA. ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין הציגו טרנספקציה מוצלחת של mRNA בתאי אפיתל הסימפונות האנושיים, מה שמרמז על יישומים נוספים לחיסוני COVID-19 ברירית, טיפול בסרטן ריאות וטיפול גנטי בסיסטיק פיברוזיס. אני מצפה מהאדם להיות בעל ידע בסיסי בתחום קשור ועם הפרוטוקול והרבה מהטכניקות גם כן, לפני שהוא או היא מתחילים לבצע את הניסויים.

לאחר סינתזה של מסגרת הקריאה הפתוחה של Metridia luciferase ושיבוט שלה לווקטור pUC57, הכינו תבנית דנ"א ליניארית באמצעות BamHI ו-KpnI בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הכן תגובה של נפח של 20 מיקרוליטרים לסינתזת mRNA באמצעות ערכת שעתוק T7 ופסאודורידין כמתואר בכתב היד. מערבבים היטב את הרכיבים ודוגרים בחום של 37 מעלות במשך שלוש שעות.

לאחר מכן, הסר את המבנה המשני של 50 מיקרוגרם של mRNA IVT uncapped על ידי חימום אותו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השתמש במערכת המכסה Cap 1 עבור מכסה ה-mRNA של IVT, והכן את Cap 1 על-ידי שינוי מבנה המכסה של 7-מתילגואנוזין באמצעות S-אדנוזיל-מתיונין ו-2'O-מתיל-טרנספראזות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. מדוד את הריכוז של mRNA IVT מכוסה באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV.

באמצעות סמן RNA, נתחו את הגודל המולקולרי של ה-mRNA של IVT ב-1% פורמלדהיד דנטורינג אגרוז ג'ל המכיל 18% פורמלדהיד. הכינו תמיסת מלאי של 10 מיליגרם למיליליטר של פולוקסאמין 704 על ידי סילוק T704 במים נטולי נוקלאז. הכינו 2 מיליגרם לתמיסת מלאי מיליליטר של הפפטיד על ידי התזת הפפטיד במים נטולי נוקלאז.

לאחסן את הפתרון מוכן ב 4 מעלות צלזיוס. הפשרת ה-mRNA של IVT על קרח. לפני פתיחת הצינור, צנטריפוגה של הצינור ב 300 פעמים G במשך שלוש שניות בטמפרטורת החדר, ולדלל את תמיסת ה- IVT mRNA במים נטולי נוקלאז.

הכן תמיסת תערובת פפטידים סינתטית T704 וסינתטית על ידי דילול תמיסת T704 לריכוז של שמונה מיקרוגרם למיקרוליטר, ותמיסת פפטידים סינתטית לריכוז של 0.555 מיקרוגרם למיקרוליטר, עם מים נטולי נוקלאז, בהתאמה. יש לדגום את התמיסה המעורבת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני שימוש נוסף. שאבו את תמיסת ה-mRNA של IVT לתוך מזרק של מיליליטר אחד, תוך הימנעות מרווחי אוויר או בועות בקצה המזרק.

טען את המזרק לצד אחד של המחסנית ליד הבלוק המסתובב. לאחר מכן, מלא מזרק של מיליליטר אחד עם T704 ותמיסת תערובת פפטידים סינתטית, והסר את כל הבועות או מרווחי האוויר בקצה המזרק. מניחים את המזרק לתוך הכניסה השנייה של המשאבה, ולהגדיר את המשאבה עם קצב זרימה כולל של 4 עד 10 מיליליטר לדקה.

הנח צינור חרוטי ללא RNase של עשרה מיליליטר כדי לאסוף את תמיסת ה- IVT mRNA / PP-sNp המעורבת בסוף נתיב הזרימה של התקן הערבוב. הפעל את המשאבה כדי להתחיל את הערבוב, תוך הקפדה על קלט נכון של הפרמטרים. לאחר הפעלת המשאבה במשך שש שניות, אסוף את דגימת ה-MRNA/PP-SNp של IVT מהצינור החרוטי.

צלחת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים וקו תאים דנדריטיים בלוחות 96-well 24 שעות לפני הטרנספקציה. לגדל את התאים במדיום תרבית בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-1% פניצילין סטרפטומיצין. לאחר הסרת מדיום הצמיחה, לשטוף את התאים מצופים עם 0.2 מיליליטר לכל PBS היטב.

הוסף 170 מיקרוליטרים של מדיום תרבית ללא סרום לכל באר המכילה את תרביות התאים המצופות. לאחר מכן, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של נוסחת IVT mRNA/PP-sNp המכילה 0.4 מיקרוגרם של Metridia luciferase mRNA טיפה חכמה לתוך כל באר. דגרו על התאים עם נוסחת ה-IVT mRNA/PP-sNp באטמוספרה מועשרת ב-5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

שאפו את מדיום ההעברה והוסיפו 0.2 מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-1% פניצילין סטרפטומיצין. לדגור על התאים הטרנספקטיביים למשך 24 שעות כפי שהוכח קודם לכן ולאסוף את הסופרנטנטים שיזוהו מכל באר. הכן פתרון בדיקה טרי על ידי הוספת PBS למצע coelenterazine.

ערבבו היטב את התמיסה על ידי מערבולת במשך 10 שניות. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הסופרנטנט שנאסף לצלחת של 96 בארות. הגדר את קורא microplate עם זמן קריאה של 1, 000 אלפיות השנייה ולהוסיף 30 microliters של פתרון coelenterazine לכל באר באופן ידני או על ידי הזרקה אוטומטית.

מיד לאחר הוספת תמיסת coelenterazine לסופרנטנט, לחץ על התחל כדי למדוד את אות הזוהר. הפלסמיד הרקומביננטי בודד ועוכל כדי לייצר את תבנית הדנ"א הליניארית. השעתוק במבחנה הפיק mRNA של MetLuc.

תאים שעברו טרנספקציה עם Metridia luciferase mRNA/PP-sNp הציגו ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של לוציפראז בהשוואה לאלה שעברו טרנספקציה עם מגיב טרנספקציה מבוסס שומנים זמין מסחרית, mRNA של Metridia luciferase עירום, PBS או T7044 פפטידים סינתטיים, תמיסה מעורבת בתאי אפיתל הסימפונות האנושיים, 16 HBE, וקו תאים דנדריטיים DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp הראה ביטוי לוציפראז גבוה יותר מאשר LP.מה שמרמז על כך שמערכת האספקה של PP-sNp חשובה עבור הגנה על ה-mRNA של MetLuc מפני השפלה ולקידום יעילות ההעברה של ה-mRNA האקסוגני Metridia luciferase. אנא ודא כי המבנה הסינתטי של Met-mRNA uncapped הוסר בהצלחה. חשב והורד את תרכובת Met-mRNA T704 והפפטיד בקפידה כדי להכין ולדחוס את חלקיקי הפולוקסאמין.

ניתן לבצע מיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לבחון את המורפולוגיה של ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין. טכניקה זו מסייעת לחוקרים לפתח חיסוני mRNA ברירית ולאפשר סריקה בתפוקה גבוהה של פורמולציות של ריפוי גנטי עבור כל התאים הקשורים.