בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה

בפרוטוקול זה נבנה מלח סולפוניום שיכול לשמש כיד חדשה שהגיבה עם החלבון ציסטאין על הקרבה המיוחדת. היתרון של טכניקה זו היה שתגובה זו הייתה מהירה ויעילה, ו-Met-catalyst free ופיתחה שיטה פשוטה ויעילה לייצוב פפטידים. כדי להתחיל, הכן את תמיסת ההגנה N-terminal 9-fluorinyl-methyloxycarbonyl של 20% פיפרידין או 50% מורפולין ו- DMF בכוס או בקבוקון של 500 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת deprotection לעמודה וחנקן מבעבע לתוך התמיסה במשך 30 דקות או פעמיים במשך חמש דקות. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף במשך חמש פעמים עם דיכלורומתאן ו- N, N-דימתילפורמיד. כדי לזהות את השרף כתמיסת צבע צהובה כהה, הוסיפו מיליליטר אחד של N, N-דימתילפורמיד לכמות קטנה של שרף והוסיפו 200 מיקרוליטר של 5% נינהידרין לצינור זכוכית.

מחממים אותו ב 130 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי להעריך את השינויים בצבע השרף. עבור צימוד של פפטידים, להכין תמיסת תערובת כמתואר בכתב היד בצינור פוליפרופילן ולהמיס אותו בשלושה מיליליטר של N, N-dimethylformamide. לאחר מכן, להוסיף 173 microliters של N, N-diisopropylethylamine או 154 microliters של N, N'diisopropylcarbodiimide לפתרון כדי להשבית את חומצת האמינו.

לאחר מכן, מוסיפים את התערובת לעמודה עם שרף ומבעבעים אותו עם חנקן במשך שעתיים. לאחר הצימוד, הוסיפו מיליליטר אחד של N, N-דימתילפורמיד לכמות קטנה של שרף והוסיפו 200 מיקרוליטרים של 5% נינהידרין לצינור זכוכית. מחממים אותו בטמפרטורה של 130 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות בזמן שהשרף השתנה לחסר צבע מה שמאשר את היעדרה של קבוצת אמינו חופשית לפני שלב ההגנה.

לאחר ניקוז התמיסה, לשטוף את השרף כפי שהודגם קודם לכן ולהוסיף 10 מיליליטר של תמיסת deprotection לעמודה. לאחר מכן, בועה עם חנקן במשך 30 דקות או פעמיים במשך חמש דקות. ושוב, להוסיף פתרון טרי.

הוסף 10 מיליליטר של מתנול נטול מים לעמודה עם שרף להתייבשות ויבש עם חנקן לשימוש הבא. שוקלים 100 מיליגרם של שרף לתוך עמודה ולשטוף את השרף עם dichloromethane ו- N, N-dimethylformamide לפני שלב הצימוד. הכן תמיסה להסרת קבוצת ההגנה טריטיל-L-ציסטאין על ידי הוספת חומצה טריפלואורואצטית, טריאיזופרופילסילאן ותערובת דיכלורומתאן בכוס של 100 מיליליטר או בקבוק להסרת קבוצת המגן.

הוסף 5 עד 10 מיליליטר של הפתרון מוכן לעמודה כדי להסיר את קבוצת ההגנה במשך 10 דקות. חזרו על הפעולה שש פעמים עם חנקן מבעבע עד שהצבע הצהוב ייעלם לחלוטין. לאחר ניקוז התמיסה על ידי משאבת ואקום, יש לשטוף את השרף כפי שהוכח קודם לכן.

לאחר מכן, הכן פתרון לתגובה עם ציסטאין מוגן על ידי הוספת מקשר דיהלוגני ו- N, N-diisopropylethylamine בכוס 50 מיליליטר או בקבוק עם N, N-dimethylformamide. הוסף חמישה עד 10 מיליליטר של תמיסת התגובה לעמודה כדי להגיב עם ציסטאין מוגן במשך שלוש שעות לפחות עם חנקן מבעבע. שוב, לנקז את התמיסה על ידי משאבת ואקום ולשטוף את השרף ברצף כפי שהוכח קודם לכן.

כדי להכין את תמיסת מחזוריות הפפטידים, הוסיפו תערובת חומצה טריפלואורואצטית בכוס של 20 מיליליטר או בקבוקון במכסה האדים למחזוריות פפטידים. לאחר מכן, מוסיפים חמישה עד 10 מיליליטר של תמיסת התערובת לצינור הפוליפרופילן ומבקעים את השרף מתחת לקוקטייל החומצה הטריפלואורואצטית במשך שלוש שעות. לאחר התייבשות ושטיפת השרף לפני שלב הצימוד הודגם קודם לכן, הכינו תמיסה מימית של 1% חומצה פורמית ומילימולר אחד פרופרגיל ברומיד והוסיפו לתמיסת הפפטיד מתיונין.

לאחר מכן, לנער את תגובת הצימוד של מתיונין ופרופרגיל ברומיד בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות. לאחר התגובה, להמיס את המוצר בצינור פוליפרופילן ואצטוניטריל ולסנן אותו דרך קרום מסנן 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, טהרו את התמיסה על ידי HPLC בפאזה הפוכה באופן מיידי והקפיאו את ייבוש האבקה לשימוש הבא.

הפפטידים המחזוריים המסונתזים באמצעות ביס-אלקילציה בין ציסטאין למתיונין אופיינו בספקטרום HPLC ו-LCMS, מה שמראה כי האפימרים הפגינו זמני שמירה שונים ומשקלים מולקולריים זהים. עקבות HPLC של האפימרים והמוצר המצומד שלהם הדגימו את ההמרה תלוית הזמן בין הפפטיד המחזורי לבין המוצר שלו. המשקל המולקולרי של פפטידים מחזוריים המסונתזים באמצעות תגובה מסוג תיול-יין נקבע על ידי LCMS והפפטיד בודד וטוהר על ידי HPLC.

הפפטידים אופיינו עוד יותר על ידי פרוטון NMR וספקטרום קוהרנטי קוונטי יחיד הטרונוקלי, וחשפו את התזוזה הכימית. ספקטרום פרוטון NMR של ההמרה תלוית הזמן בין פפטיד מחזורי לבין דיתיותרייטול ותחמוצת דאוטריום הושג כדי לחקור את יציבות הפפטיד עקב פתיחת טבעת הסולפוניום. התוצאות הראו כי לאחר 24 שעות לא נוצרו מוצרים נוספים או פתיחת טבעת.

הליך זה קבע אסטרטגיה יעילה לסינתזה של פפטידים מחזוריים. התגובה אומרת שהסלקטיביות משופרת גם על ידי יצירת אישור שמייצב את פפטיד המחזוריות, מה שמצביע על כך שפפטידים מחזוריים היו זרז תרופה מבטיח.