Name: בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למד לסנתז פפטידים מחזוריים חודרי תאים עם קשרים ארומטיים לשיפור חדירות מולקולות תרופה לתאי גידול. השיטה מאפשרת ציקליזציה ללא זרזי מתכות ומגבירה הידרופוביות לחדירה מוגברת דרך מחסומים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (21708031), הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (BX20180264, 2018M643519), וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (2682021ZTPY075).

1. הכנת ציוד
הערה: בצע את כל ההליכים במכסה אדים תפעולי עם ציוד מגן אישי מתאים.
<ol><li>הרכיבו את מנגנון סינתזת הפפטיד הידני במכסה האדים (איור 1). הניחו את הפקקים התלת-כיווניים (ראו טבלת חומרים) על סעפת הוואקום (ראו טבלת חומרים) והתחברו לחנקן (N2). הקפד לכסות את הפתחים שאינם בשימוש.</li>
	<li>חבר עמוד פוליפרופילן בנפח 10 מ"ל (ראה טבלת חומרים) על הסטופקוק התלת-כיווני. מסננים את תערובת התגובה או הממיסים מעמוד הפוליפרופילן באמצעות נורת פיפטה גומי או ואקום באמצעות מלכודת פסולת.</li>
</ol>2. סינתזה של פפטיד R8 ליניארי (FITC-R8) ושל פפטיד R8 מהודק (FITC-sR8-4)
הערה: הפפטידים סונתזו בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי של סינתזת פפטיד בשלב מוצק מבוסס FMOC (SPPS)25. 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA שרף (rink amide MBHA שרף, ראה טבלה של חומרים) שימש לאורך כל המחקר.
אזהרה: N, N-דימתילפורממיד (DMF), N, N-דיסופרופילאתילאמין (DIPEA), מורפולין ודיכלורומתאן (DCM) הם כולם חסרי צבע ומזיקים אם שואפים אותם או נספגים דרך העור. אתר הוא דליק מאוד. 1,2-Ethanedithiol (EDT) הוא חומר ריחני במיוחד. חומצה טריפלואורואצטית (TFA) היא קורוזיבי מאוד, והחומציות שלה היא פי 105 מזו של חומצה אצטית. כתוצאה מכך, כל הריאגנטים והכימיקלים אמורים להיות מטופלים באמצעות ציוד מגן במכסה אדים.
<ol><li>הכינו את השרף לסינתזה פפטידית.<ol><li>חישוב מסת השרף הדרושה לסינתזה:מסת שרף (מ"ג) = קנה מידה (mmol / כושר העמסת שרף (mmol / g) × 1,000 (מ"ג / גרם) הערה: לדוגמה, המסה של שרף MBHA אמיד (0.572 mmol / g) עבור 0.2 mmol = 0.2 mmol / 0.572 mmol / g × 1,000 mg/g = 350 mg.</li>
		<li>הוסף 4-5 מ"ל DMF לכמות הנדרשת של שרף והעבר לעמודת פוליפרופילן 10 מ"ל (שלב 1.2) עם N2 עדין מבעבע במשך 30 דקות כדי לנפח את השרף כראוי, ולאחר מכן לנקז את DMF.</li>
		<li>הוסף 4-5 מ"ל של 50% מורפולין/DMF (v/v) לשרף, בעבע בעדינות N2 למשך 30 דקות 2x כדי להסיר את קבוצת N-terminal Fmoc ולאחר מכן לנקז את התערובת. לאחר מכן, שטפו את השרף ביסודיות 3x על ידי הוספת 4-5 מ"ל DMF לעמוד ומבעבעים עם N2 למשך דקה לפחות בכל פעם. המשך לשטוף את השרף עם DCM (3x) ו- DMF (3x) באותו אופן.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע צימוד חומצות אמינו המוגנות באמצעות Fmoc כמתואר להלן. הערה: הצימוד של ארגינין בסינתזה ידנית בקנה מידה של 0.2 mmol מתואר כאן כדוגמה.<ol><li>להמיס Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 שווה ערך, 648.8 מ"ג) ו-2-(7-Azobenzotriazole)-N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU, 4.9 equiv., 372.6 mg) ב-5 מ"ל DMF בצינור צנטריפוגה.</li>
		<li>הוסף DIPEA (10 שווה ערך, 348.4 μL) כדי להפעיל את תגובת הצימוד ולאחר מכן להעביר את תערובת התגובה לעמוד פוליפרופילן 10 מ"ל עם שרף (מוכן בשלב 2.1.3). לאחר מכן, להתסיס בעדינות את התערובת עם N 2 מבעבע במשך1-2 שעות.</li>
		<li>חזור על תגובת הצימוד (שלב 2.2.1 ושלב 2.2.2) פעם אחת.</li>
		<li>לאחר השלמת הצימוד, סננו את תערובת התגובה ושטפו את השרף ברצף עם DMF, DCM ו-DMF 3x כל אחד למשך דקה אחת לפחות בכל פעם.</li>
		<li>בצע צימוד של כל חומצת אמינו בשלבים מסודרים: הוסף 4-5 מ"ל של 50% מורפולין/DMF (v/v) לשרף, בעבע בעדינות עם N 2 למשך 30 דקות 2x כדי להסיר את קבוצת N α-Fmoc, ולאחר מכן שטוף את השרף (כפי שמוצג בשלב 2.2.4), והמשך לזוג חומצת האמינו הבאה (כפי שמוצג בשלב 2.2.1 ושלב 2.2.2). המשך עם מספר מחזורים של שלב זה כדי להשיג סינתזה של הפפטיד הרצוי. הערה: ניתן להשהות תהליך זה כאן. מעבים את השרף במתנול ומייבשים את השרף בזרימה רציפה של N2. מכסים את עמוד הפוליפרופילן ולאחר מכן מאחסנים את השרף בטמפרטורה של 4°C למשך מספר ימים (או בטמפרטורה של -20°C לאחסון ארוך יותר). לנפח את השרף עם 4-5 מ"ל של DMF במשך 0.5-1 שעות לפני תחילת סינתזה חדשה. אם ממשיכים ישירות לשלב הבא, אין צורך לעבות את השרף.</li>
	</ol></li>
	<li>תייג את הפפטידים עם פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) כמתואר להלן.<ol><li>שלבו את הבטא-אלנין כספייסר לסימון FITC באותו תהליך המשמש לצימוד חומצות אמינו בשלב 2.2.</li>
		<li>בצע תיוג FITC של פפטידים על השרף על ידי הוספת תערובת של FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.), ו- DMF לעמוד הפוליפרופילן ותגובה בחושך במשך 8 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>לסינתזה של FITC-sR8-4, בצע מחזוריות של הפפטיד הליניארי כמתואר להלן.<ol><li>הוסף תערובת של TFA/triisopropylsilane (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) לעמוד הפוליפרופילן למשך 2 דקות כדי להסיר באופן סלקטיבי את קבוצת ההגנה Cys (Trt) ולאחר מכן לנקז את התערובת. חזור על ההליך לעיל עד שהפתרון הצהבהב הופך לחסר צבע כדי להסיר לחלוטין את קבוצת ההגנה Trt.</li>
		<li>לאחר מכן, בצע שטיפות רציפות של השרף עם DMF ו- DCM לפחות 3x. לאחר מכן, יש להמיס 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl (2 equiv.) ב-DMF עם DIPEA (4 equiv.), להוסיף אותו לעמודה, ולהגיב במשך 4 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>לבקע את הפפטידים כמתואר: לאחר השלמת סינתזת הפפטידים, לשטוף את השרף עם 4-5 מ"ל של מתנול פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ולייבש אותו עם זרימה רציפה של N2. טפלו בשרף עם קוקטייל מחשוף יעיל TFA/TIS/H 2 O (95/2.5/2.5, v/v/v), או TFA/TIS/EDT/H 2 O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) לפפטידים המכילים ציסטאין, תוך שימוש בכ-1 מ"ל קוקטייל מחשוף לכל 100 מ"ג שרף. טפל בשרף הקשור לפפטיד במשך 2-3 שעות כדי לבקע את הפפטיד ולאחר מכן הסר את ה- TFA בזהירות עם זרם של N2.</li>
	<li>כדי לקבל את הפפטידים הגולמיים, הוסף 4-5 מ"ל של אתר דיאתיל להכנת הפפטיד השסוע כדי לזרז את הפפטידים הגולמיים והצנטריפוגה ב -10,000 × גרם למשך 4 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ולייבש את הפפטיד באוויר למשך 3 דקות במכסה אדים יעיל.</li>
	<li>ניתוח הפפטידים: המסת פפטיד גולמי בקנה מידה קטן (שנותק מכ-10 מ"ג של שרף הקשור לפפטידים) ב-800 מיקרוליטר של אצטוניטריל (ACN)/H2O (1/1, v/v) ולאחר מכן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בפאזה הפוכה (RP-HPLC) וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לטהר את הפפטידים באמצעות RP-HPLC ו-LC-MS.<ol><li>יש להמיס 50 מ"ג של מוצר פפטיד גולמי ב-4 מ"ל ACN/H2O (1/1, v/v), ולהזריק את התמיסה למערכת RP-HPLC המצוידת בטור C18 (4.6 מ"מ x 150 מ"מ, גודל נקבוביות: 120 Å, גודל חלקיקים: 4 מיקרומטר; ראו טבלת חומרים). יש להקפיד את הפפטיד באמצעות פאזה ניידת המכילה 0.1% TFA/H2O (v/v) ו-ACN, עם שיפוע של 10% עד 90% ACN במשך 30 דקות. פפטידים קונבנציונליים התגלו ב-220 ננומטר ופפטידים מסומנים ב-FITC ב-494 ננומטר.</li>
		<li>אסוף את השברים המתאימים לשיא הפפטיד העיקרי כפי שזוהה על ידי טרשת נפוצה, ולאחר מכן בצע ליופיליזציה של שברי הפפטיד הרצויים. אחסנו את הפפטיד המטוהר בטמפרטורה של -20°C. הערה: m/z שנמצא של FITC-R8 מטוהר הוא כדלקמן: [M + 3 H]3+: 576.63; [ז + 4 שעות] 4+: 432.72; [ז + 5 שעות] 5+: 346.39; [ז + 6 שעות] 6+: 288.85. m/z שנמצא של FITC-sR8-4 מטוהר הם כדלקמן: [M + 3 H]3+: 704.74; [ז + 4 שעות] 4+: 528.77; [ז + 5 שעות] 5+: 423.34; [ז + 6 שעות] 6+: 352.91. תנאים אנליטיים של MS: מכשיר: ESI (הטיית בדיקה: +4.5 kV; גלאי: 1.2 kV); זרימת גז נבולייזר: 1.5 ליטר לדקה; קו התמוססות מעוקל (CDL): −20 V; טמפרטורת CDL: 250 °C; טמפרטורת בלוק: 400 °C; ספיקה: 0.2 מ"ל/דקה; שלב נייד: 50% H2O / 50% ACN.</li>
	</ol></li>
</ol>3. כימות הפפטידים המסומנים ב-FITC
<ol><li>להמיס כמות קטנה של פפטיד מטוהר ב-DMSO כתמיסת מלאי (למשל, 40 μmol/mL).</li>
	<li>מדוד את הספיגה ב-494 ננומטר (A 494) של 2 מיקרוליטר של תמיסת המלאיב-498 מיקרומטר של 10 מילימטר פוספט חוצץ מלוחים (1x PBS, pH 7.4) עם צלחת מיקרוטיטר (ראה טבלת חומרים) באמצעות קורא מיקרו-צלחות רב-טכנולוגי (ראה טבלת חומרים). מקדם הדילול הוא 500 μL / 2 μL = 250, ואורך הנתיב של צלחת המיקרוטיטר הוא 0.5 מ"מ.</li>
	<li>חשב את ריכוז תמיסת המניות באמצעות הנוסחה הבאה: ריכוז (mM) = A494 × גורם דילול / 0.05 (cm) / 77,000 (cm−1· M−1) × 1,000 (mM·M−1)</li>
	<li>התאימו לדילול תקין כך שהערך הנמדד A494 יהיה בין 0.1 ל-1.0. הערה: יש לחזור על המדידות מספר פעמים כדי להבטיח שהריכוז הנמדד מדויק. מקדם הכחדה של 77,000 ס"מ−1· M−1 נובע מקבוצת FITC.</li>
</ol>4. יציבות פפטידים בסרום בקר עוברי (FBS)
<ol><li>לדגור על הפפטיד בריכוז של 100 מיקרומטר עם 250 μL של 25% FBS/H2O (v/v) ב 37 ° C. לאחר הדגירה במשך 0 שעות, 1 שעות, 2 שעות ו -4 שעות, קח 10 μL aliquots ולאחר מכן הוסף 150 μl של 12% חומצה trichloroacetic מומס ב H2O/ACN (1/3, v/v) כדי לזרז את חלבוני הסרום.</li>
	<li>צנטריפוגה את הדגימות ב 10,000 × גרם במשך 5 דקות ולנתח את supernatant באמצעות HPLC (כמתואר בשלב 2.8) כדי לקבוע את מידת השפלת פפטידים.</li>
	<li>חשב את היחס בין שטח השיא ב- 1 שעות, 2 שעות ו- 4 שעות לזה שב- 0 שעות כדי לקבל את החלק של פפטיד לא מפורק בזמן המתאים. התוצאה היא ממוצע של שלוש דגימות מקבילות.</li>
</ol>5. ספיגה תאית של הפפטידים
<ol><li>הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית<ol><li>מניחים מכסה עגול לתוך צלחת של 12 בארות. לאחר מכן, חסן 1 x 105 תאים באופן אחיד על כיסויים ותרבית לילה עם 2 מ"ל של מדיום. הסר את המדיום ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS. הערה: במחקר זה, תאי HeLa ותאי 4T1 גודלו בתרבית במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM, ראה טבלת חומרים) בתוספת 10% FBS באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.</li>
		<li>לדגור על התאים עם 1 מ"ל של 3 מיקרומטר פפטידים מסומנים FITC ב- DMEM ללא FBS למשך שעה אחת ב- 37 ° C. לאחר מכן, להסיר את המדיום המכיל פפטיד ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>מכתימים את התאים עם 1 מ"ל של Hoechst 33258 למשך 15 דקות. התבוננו בהפנמה של כל פפטיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) באותה עוצמת פלואורסצנטיות וזמן חשיפה. הערה: ההגדרות הבאות שימשו עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מטרה: Plan-Apochromat: 63 x/1.40 שמן DIC M27; ערוץ 1 עבור FITC: מסנן עירור: 450-490 ננומטר, מסנן פליטה: 500-550 ננומטר, זמן חשיפה: 230 ms; ערוץ 2 עבור Hoechst 33258: מסנן עירור: 335-383 ננומטר, מסנן פליטה: 420-470 ננומטר, זמן חשיפה: 27 מטר.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח ציטומטריית זרימה<ol><li>חסן 5 x 105 תאי HeLa באופן אחיד בצלחות 12 בארות ובתרבית ב- DMEM למשך 24 שעות ב 37 ° C. לאחר מכן, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS.</li>
		<li>לדגור על התאים עם 1 מ"ל של 3 מיקרומטר פפטידים מסומנים FITC ב- DMEM ללא FBS למשך שעה אחת ב- 37 ° C. הסר את התווך המכיל פפטידים, נתק את התאים עם טריפסין 0.25% (w/v) ו- 0.53 mM EDTA ב- PBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן אסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה ב- 306 × גרם למשך 4 דקות. לשטוף את גלולת התא עם PBS.</li>
		<li>לדגור על התאים עם 1 מ"ל של 0.05% (w/v) טריפאן כחול PBS במשך 3 דקות כדי להרוות את הפלואורסצנטיות הקשורה לפני השטח, ולבצע ניתוח כמותי של פלואורסצנטיות תוך תאית באמצעות ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים). הערה: הגדרות ציטומטריית זרימה: עירור: 488 ננומטר, פליטה: 530 ננומטר. כחול טריפאן יכול גם להרוות את הפלואורסצנטיות של תאים מתים ולעזור להבחין בין תאים חיים למתים במהלך ניתוח ספיגת פפטידים.</li>
		<li>טפל ובדוק תאי 4T1 באמצעות ציטומטריית זרימה בהתאם לאותו פרוטוקול המתואר עבור תאי HeLa. אסוף 5 x 105 תאים לכל דגימה והגדר שלוש דגימות מקבילות לכל קבוצה.</li>
	</ol></li>
</ol>6. חקר חדירת הפפטידים מתא לתא באמצעות מודלים של טרנסוול
<ol><li>לחסן 1 x 10 5 תאי HeLa ב 2 מ"ל של DMEM בתא 12 בארות עם תוספת צלחת תרבית רקמה (ראה טבלת חומרים) ולדגור במשך 24 שעות באינקובטור לחות 37 מעלות צלזיוס המכיל5% CO2. לאחר מכן, להסיר את המדיום לדגור את התאים בתאים עם 1 מ"ל של 10 מיקרומטר FITC-R8 או FITC-sR8-4 (מטוהר באמצעות HPLC) DMEM ללא FBS במשך 1 שעות.</li>
	<li>הסר את המדיום המכיל את הפפטידים ושטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל של DMEM טרי ללא FBS לתאים ולאחר מכן לדגור במשותף על תאי HeLa בתא עם צלחת תרבית הרקמה להוסיף עם תאי HeLa על הכיסויים העגולים בתחתית במשך 2 שעות.</li>
	<li>תקן את תאי HeLa על הכיסויים העגולים עם 2.5% גלוטראלדהיד למשך 15 דקות ולאחר מכן הכתים את התאים עם DAPI למשך 15 דקות. לאחר מכן, התבוננו בתאי HeLa על הכיסויים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טפל ובדוק תאי 4T1 באמצעות אותו פרוטוקול המשמש לתאי HeLa.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly%28mannitol-co-PEI%29+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li>
<li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li>
<li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+on+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li>
<li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li>
<li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+Classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+%28PNA%29+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li>
<li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li>
<li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery%3A+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li>
<li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+%CE%B2-catenin+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li>
<li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+%CE%B1-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li>
<li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li>
<li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+in+shape%3A+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+%CE%B1-helical+peptides%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li>
<li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li>
<li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+short+%CE%B1-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li>
<li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li>
<li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrocyclic+cell+penetrating+peptides%3A+A+study+of+structure-penetration+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+%CE%B1-helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li>
<li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+proteolytically+stable%2C+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li>
<li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cationic+amphiphilic+%CE%B1-helical+peptides+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li>
<li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+Tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הייצוב הכימי של הפפטידים על ידי שילוב אילוצי קונפורמציה הוכח כאסטרטגיה יעילה לשיפור היציבות והחדירות התאית של הפפטיד26. בפרוטוקול זה, מתואר הליך שלב אחר שלב לסינתזה של CPPs מחזוריים עם קישורים צולבים ארומטיים והערכת החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים. בהשוואה לקישורים הצולבים הידרופיליים לקטם או טריאזול22,27, שילוב של קישורים צולבים ארומטיים (המשמשים במחקר זה) משפר את ההידרופוביות הכוללת של CPPs, ובכך מגדיל באופן משמעותי את חדירות התא ש...

בעשורים האחרונים חלה התקדמות מהירה בפיתוח פפטידים חודרי תאים (CPP) לאספקת תרופות. CPPs נמצאים בשימוש נרחב כמובילים מולקולריים לטיפול במגוון מחלות מסכנות חיים, כולל הפרעות נוירולוגיות1,2, מחלות לב3, סוכרת4, דרמטוזיס5 וסרטן 6,7. מחלת הסרטן נותרה נטל בריאותי עולמי המלווה בשיעור גבוה של תחלואה ותמותה למרות מאמצי מחקר נרחבים8. מכשול רציני לטיפול בסרטן הוא הגישה המוגבלת של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר עקב מחסומים פיזיולוגיים כגון מטריצה חוץ-תאית קומפקטית (ECM), כלי דם גידוליים חריגים, מחסומי ממברנות מרובים ולחץ נוזל אינטרסטיציאלי גבוה (IFP)9. לפיכך, פיתוח CPPs חדשניים עם יכולת מעולה להעביר מטענים מעבר למחסומים ביולוגיים נחשב אסטרטגיה חיונית לטיפול בסרטן10,11.
ניתן לסווג CPPs לקטיון, אמפיפתי והידרופובי במונחים של התכונות הפיזיקוכימיות שלהם12. בין אלה, פפטיד HIV-TAT טעון חיובי ופוליארגינין סינתטי הם בעלי חשיבות רבה במחקר ביו-רפואי ונחקרו בהרחבה כדי להקל על מתן תרופות תוך תאיות13. טונמן ועמיתיו דיווחו כי אורך מינימלי של שמונה ארגינינים חיוני לחדירה יעילה של פפטידים פוליארגינין סינתטיים, בהתבסס על מחקר חדירות תאים שנערך באמצעות פפטידים R3 עד R1214. עם זאת, ל-CPPs אלה יש בדרך כלל זמן מחצית חיים קצר בפלזמה בשל ההידרוליזה המהירה שלהם in vivo. בנוסף, מעט ידוע על אופטימיזציה של המבנה הכימי של CPPs כדי להגדיל את יכולת מחסום הטרנס שלהם, שכן זה מאתגר לחדור קרומי תאים מרובים15. לפיכך, פיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים המסוגלים לחדור מחסומים ביולוגיים רצוי מאוד כדי לשפר את יעילות אספקת התרופות. בשנת 2020, Komin et al.16 גילו CPP בשם CL peptide, המכיל מוטיב סליל (RLLRLLR) וזנב פוליארגינין (R7) לחציית חד-שכבה אפיתלית. קבוצה של גרסאות פפטיד CL סונתזו גם על ידי שינוי התבנית הסלילית. מחקר זה יכול להיות מדריך משמעותי לפיתוח CPPs חדשניים להובלת מטענים מעבר למחסומים ביולוגיים. יתר על כן, דיטריך ועמיתיו ייעלו את חדירות התאים של פפטיד StAX, ועיכבו את מסלול האיתות Wnt/β-catenin על ידי הגדלת ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים17.
הגבלה קונפורמטיבית של פפטידים ליניאריים לא מובנים על ידי מחזוריות היא דרך יעילה לשפר את היציבות והחדירות הפרוטאוליטית שלהם18,19,20. החיזוק המבני מגביר את עמידות הפרוטאז של פפטידים מחזוריים, מה שהופך אותם ליציבים יותר ב-vivo בהשוואה למקביליהם הלינאריים. בנוסף, מחזוריות של פפטידים יכולה באופן פוטנציאלי להסוות את עמוד השדרה של הפפטידים הקוטביים על ידי קידום קשרי מימן תוך-מולקולריים, ובכך להגדיל את חדירות הממברנה של הפפטידים21. בשני העשורים האחרונים, שיטות מחזוריות כימוסלקטיביות הפכו לאסטרטגיות יעילות לבניית פפטידים מחזוריים עם ארכיטקטורות שונות, כגון כל-פחמימנים, לקטם, טריאזול, m-xylene, perfluoroaryl, וקישורים צולבים אחרים22,23. המחסום הביולוגי שמטילה המיקרו-סביבה המתוחכמת של הגידול יכול להפחית את חדירת התרופות בגידולים מוצקים24. מצאנו בעבר כי CPPs מחזוריים הפגינו עמידות עדיפה לעיכול אנזימטי על פני עמיתיהם הליניאריים20. יתר על כן, ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים היא קריטית לחדירות התאים המשופרת שלהם22. בהתבסס על המחקרים שנדונו לעיל, ניתן לשער כי השילוב של דפוס טעון חיובי, הידרופוביות כללית מוגברת ויציבות פרוטאוליזה משופרת מגביר את החדירות של CPPs על פני מחסומים ביולוגיים. במחקר שנערך לאחרונה, זיהינו שני CPPs מחזוריים עם קישורים ארומטיים במיקומים i ו- i+7 המציגים חדירות משופרת בתאים וברקמות של הגידול בהשוואה למקביליהם הליניאריים15. כאן, פרוטוקול סינתטי תמציתי לסינתזה של CPPs מחזוריים מסומנים פלואורסצנטית ואת השלבים העיקריים כדי לחקור את החדירות שלהם מוצגים.

<table><tbody><tr><td>1,2-אתנדיטיול</td><td>אלאדין</td><td>K1722093</td><td>צחנה</td></tr><tr><td>2-(7-אזובנזוטריאזול)-N,N,N',N'-טטרמתילורוניום הקספלואורופוספט (HATU)</td><td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-ביס(ברומומתיל)ביפניל</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 תאים</td><td>ATCC</td><td></td><td>תאי 4T1 תורבבו במדיום DMEM בתוספת 10% FBS (Hyclone) ב-37 מעלות; אינקובטור לח C המכיל 5% CO2.</td></tr><tr><td>אצטוניטריל&nbsp;</td><td>רעילות 1484971 אדמס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>אנרגיה</td><td>W330229</td><td>מזיק לעור</td></tr><tr><td>אתר דיאתיל</td><td>אולדריץ'</td><td>673811</td><td>דליק</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>מזיק לעור</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrospray יינון מסה ספקטרומטר</td><td>מים</td><td>G2-S Tof</td><td></td></tr><tr><td>אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)</td> <td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>בקמן קולטר</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט איזומר ( FITC)</td><td></td><td></td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי E0801812500 <td></td></tr><tr><td></td><td>אנרגיה Carl Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&beta; תאי HeLa של Ala-OH</td><td>Adamas</td><td>51341C</td><td></td></tr><tr><td>תאי ATCC</td><td></td><td></td><td>HeLa תורבבו ב-DMEM בתוספת 10% FBS (Hyclone) ב-37 מעלות; אינקובטור לח C המכיל 5% CO2.</td></tr><tr><td>כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1260</td><td></td></tr><tr><td>עמודת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים</td><td>Agilent</td><td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 & פעמים; 150 מ"מ (גודל נקבוביות 120 &Aring;, גודל חלקיקים 4 &mu; m)</td><td></td></tr> <tr><td>Lyophilizer</td><td>SP מדעי</td><td>Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>רעילות</td></tr><tr><td>צלחת מיקרוטיטר</td><td>Thermo &mu; צלחת זריקה</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>מורפולין</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>קורא מיקרו-פלטות רב טכנולוגי</td><td>תרמו</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>N, N-Dimethyl formamide</td><td>אנרגיה</td><td></td><td>B020051 מזיק לעור</td></tr><tr><td>עמודת Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>עמודות כרומטוגרפיה מפוליפרופילן</td></tr><tr><td>Rink Amide שרף MBHA (0.572 mmol/g)</td> <td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>פקקים תלת כיווניים</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>הכנסת צלחת תרבית רקמות</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td> Triisopropylsilane <td>קורוזיבית</td></tr><tr><td></td><td></td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>סעפת ואקום</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

סרטן היה אתגר גדול בבריאות העולמית. עם זאת, המיקרו-סביבה המורכבת של הגידול בדרך כלל מגבילה את הגישה של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר, מה שמוביל להישנות הגידול. כדי להתגבר על החדירה המוגבלת של מחסומים ביולוגיים, פפטידים חודרי תאים (CPPs) התגלו עם יכולת טרנסלוקציה מעולה של הממברנה והתגלו כמובילים מולקולריים שימושיים להעברת מטענים שונים לתאים. עם זאת, CPPs ליניאריים קונבנציונליים מראים בדרך כלל יציבות פרוטאוליטית פגומה, מה שמגביל את החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים. לפיכך, הפיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים שיכולים לחדור מחסומים ביולוגיים ולהפגין יציבות פרוטאוליטית משופרת הוא רצוי מאוד כדי לקדם יעילות אספקת תרופות ביישומים ביו-רפואיים. בעבר סינתזנו פאנל של CPPs מחזוריים קצרים עם קישורים צולבים ארומטיים, שהציגו חדירות מעולה בתאים וברקמות סרטניים בהשוואה למקביליהם הליניאריים. כאן, פרוטוקול תמציתי מתואר לסינתזה של פפטיד פוליארגינין R8 מחזורי המסומן פלואורסצנטית ומקבילו הלינארי, כמו גם שלבי מפתח לחקר חדירות התא שלהם.

בפרוטוקול זה הוצג הליך סינתטי להגבלת הפוליארגינין R8 הליניארי לצורתו המחזורית. ה-SPPS בוצע באופן ידני באמצעות מכשיר פשוט (איור 1). התהליך הסינתטי המפורט של SPPS מוצג באיור 2. בקצרה, השרף התנפח מספיק, ואחריו הגנה על קבוצת ההגנה N α-Fmoc. לאחר מכן, חומצת האמינו המוגנת N α-Fmoc עוגנה על השרף עד להשלמת הרכבת הפפטיד (שלבים 1-4 באיור 2). לאחר מכן, הפפטידים הגסים נחתכו מהשרף על-ידי קוקטייל המחשוף (של...

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של פפטידים מחזוריים החודרים לתאים עם קישורים צולבים ארומטיים ואת הערכת החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים.

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

מכשול רציני לטיפול בסרטן הוא הגישה המוגבלת של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר בשל מחסומים פיזיולוגיים. לפיכך, פיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים המסוגלים לטפל במחסומים ביולוגיים רצוי מאוד כדי לשפר את יעילות אספקת התרופות. מטרת הליך זה היא לסנתז את הפפטידים החודרים לתאים מחזוריים לחדירה משופרת מתא לתא.היתרון של שיטה זו הוא שניתן להשיג בקלות את המחזוריות הפפטידית באמצעות תגובות החלפה עם ציסטאין ושרף ללא צורך בזרזים מתכתיים כלשהם. שילוב של קישורים צולבים ארומטיים משפר את ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים בהשוואה לקישורים הצולבים הידרופיליים לקטם או טריזול, ובכך משפר את החדירות שלהם. כדי להתחיל, להרכיב את מנגנון סינתזת הפפטיד הידני במכסה המנוע.הניחו את הפקקים התלת-כיווניים על סעפת הוואקום וחברו אותם לחנקן. הקפד לכסות את הפתחים שאינם בשימוש. חברו עמוד פוליפרופילן בקוטר 10 מיליליטר לסטופק התלת-כיווני ונקזו את תערובת התגובה או הממסים מעמוד הפוליפרופילן באמצעות נורת פיפטה גומי או ואקום באמצעות מלכודת פסולת.כדי להכין את השרף לסינתזה פפטידית, הוסף 4 עד 5 מיליליטר DMF לכמות הנדרשת של שרף והעבר אותו לעמוד פוליפרופילן עם חנקן עדין מבעבע במשך 30 דקות כדי לנפח את השרף כראוי. מסננים את ה-DMF ומוסיפים 4 עד 5 מיליליטר של 50% מורפולין/DMF לשרף. בעדינות לבעבע חנקן במשך 30 דקות כדי להסיר את קבוצת N-terminal Fmoc, ולאחר מכן לנקז את התערובת.שטפו את השרף ביסודיות שלוש פעמים על ידי הוספת 4 עד 5 מיליליטר DMF לעמוד ומבעבעים בחנקן למשך דקה אחת לפחות בכל פעם. באותו אופן, לשטוף את השרף עם dichloromethane שלוש פעמים DMF שלוש פעמים. לאחר מכן, יש להמיס 648.8 מיליגרם של ארגינין מוגן Fmoc ו-PBF ו-372.6 מיליגרם של HATU ב-5 מיליליטר DMF בצינור צנטריפוגה.הוסף 348.4 מיקרוליטר של DIPEA כדי להפעיל את תגובת הצימוד, ולהעביר את תערובת התגובה לעמוד פוליפרופילן עם שרף. בעדינות להתסיס את התערובת עם חנקן מבעבע במשך 1 עד 2 שעות, ולאחר מכן לחזור על תגובת הצימוד פעם אחת. סננו את תערובת התגובה ושטפו את השרף ברצף עם DMF, דיכלורומתאן ושוב DMF שלוש פעמים כל אחת למשך דקה לפחות בכל פעם.הסר את הקבוצה המגנה מפני Fmoc ושטוף את השרף בהתאם להליך שהוצג קודם לכן לפני שתמשיך לזוג חומצת האמינו הבאה. לאחר מכן, חברו את הבטא-אלנין כספייסר עבור תיוג FITC באמצעות אותו תהליך שמוצג עבור צימוד חומצות אמינו, ולאחר מכן הוסיפו תערובת של FITC, DIPEA ו-DMF לעמוד הפוליפרופילן בחושך כדי לבצע תיוג FITC של פפטידים על השרף. התגובה תארך כמעט 8 שעות.כדי לבצע את המחזוריות של הפפטיד הלינארי, הוסף תערובת של חומצה trifluoroacetic, triisopropylsilane, ו dichloromethane לעמוד פוליפרופילן במשך 2 דקות כדי להסיר באופן סלקטיבי את הקבוצה המגנה טריטיל של ציסטאין. מסננים את התערובת וחוזרים על התהליך עד שתמיסה צהבהבה הופכת לחסרת צבע כדי להסיר לחלוטין את הקבוצה המגנה על טריטיל. בצע שטיפות רציפות של השרף עם DMF ודיכלורומתאן לפחות שלוש פעמים והמיס 4, 4'bis-bromomethyl-biphenyl ב- DMF עם DIPEA.הוסף את הפתרון לטור והגיב במשך 4 שעות. לשטוף את השרף עם 4 עד 5 מיליליטר של מתנול פעמיים במשך חמש דקות כל אחד, ולייבש אותו עם זרימה רציפה של חנקן. עבור פפטידים המכילים ציסטאין, יש לטפל בשרף עם קוקטייל מחשוף יעיל של חומצה טריפלואורואצטית, טריאיזופרופילסילן, ומים או חומצה טריפלואורואצטית, טריאיזופרופילסילן, 1, 2-אתנדיטיול ומים.טפל בשרף הקשור לפפטיד במשך 2 עד 3 שעות כדי לבקע את הפפטיד ולאחר מכן הסר את החומצה הטריפלואורואצטית בזהירות עם זרם של חנקן. כדי להשיג את הפפטידים הגולמיים, הוסף 4 עד 5 מיליליטר של אתר דיאתיל להכנת הפפטיד השסוע כדי לזרז את הפפטידים הגולמיים, וצנטריפוגה ב -10, 000 x גרם למשך 4 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ולייבש את הפפטיד באוויר למשך 3 דקות במכסה אדים יעיל.ממיסים את הפפטיד הגולמי בקנה מידה קטן ב-800 מיקרוליטר של אצטוניטריל, ולאחר מכן מנתחים אותו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב ההפוך וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית. לחסן 100, 000 תאי HeLa ב 2 מיליליטר של DMEM בתא 12 בארות עם תוספת צלחת תרבית רקמה, ולדגור במשך 24 שעות באינקובטור לחות 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% פחמן דו חמצני. הסר את המדיום לדגור את התאים בתאים עם 1 מיליליטר של 10 מיקרומולרי FITC-R8 או FITC-sR8-4 ב DMEM ללא FBS במשך שעה 1.לאחר מכן, להסיר את המדיום המכיל את הפפטידים ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של PBS. הוסף 1 מיליליטר של DMEM טרי ללא FBS לתאים, ולאחר מכן לדגור במשותף על תאי HeLa בתא עם תוספת צלחת תרבית הרקמה, עם תאי HeLa על הכיסויים העגולים בתחתית במשך 2 שעות. תקן את תאי HeLa על הכיסויים העגולים עם 2.5% גלוטראלדהיד למשך 15 דקות, ולאחר מכן הכתים את התאים עם DAPI למשך 15 דקות.לבסוף, התבוננו בתאי HeLa על הכיסויים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תרשים סכמטי של הסינתזה של פפטיד R8 ליניארי המסומן בתווית FITC ופפטיד R8 מהודק המסומן ב- FITC מוצג כאן. ספקטרום HPLC ו-MS של הפפטיד R8 הליניארי והפפטיד R8 המהודק מוצגים באיור זה.זמן השמירה של הפפטיד המהודק היה ארוך משמעותית מזה של האנלוגיה הליניארית, מה שמצביע על הידרופוביות כוללת משופרת של הפפטיד לאחר מחזוריות עם קישור צולב הידרופובי. תמונה גרפית זו מייצגת את יציבות הפפטיד הליניארי והפפטיד המהודק בנוכחות 25% FBS. R8 מחזורי נשאר 77.3% שלם לאחר דגירה עם FBS במשך 4 שעות, בעוד עמיתו הליניארי היה מפורק ברובו, מה שמרמז על יציבות פרוטאוליטית משופרת של פפטיד R8 מחזורי.תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים של תאי HeLa ותאי 4T1 לאחר דגירה של שעה אחת עם 3 פפטיד R8 ליניארי עם תווית FITC מיקרומולרית ופפטיד R8 מהודק עם תווית FITC מוצגות כאן. ניתן לראות כי התאים שטופלו ב-R8 מחזורי עם קישור צולב ארומטי הפגינו פלואורסצנטיות תוך-תאית גבוהה יותר מאלה שטופלו במקבילם הליניארי. תוצאות דומות התקבלו עם ניתוח ציטומטריה זרימה.כדי להמשיך ולחקור אם R8 מחזורי מעניק חדירה משופרת מתא לתא, נעשה שימוש במודלים של טרנסוול כדי לדמות את חדירות המחסום של הפפטידים משכבת תא אחת לאחרת. R8 המחזורי הציג בבירור חדירה גבוהה יותר של מחסום טרנס מאשר הפפטיד R8 הלינארי, כפי שצוין על ידי עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות תוך תאית. הגנה מלאה של קבוצת טריטיל של ציסטאין ושרף חשובה לשלב המחזוריות הבא.חוץ מזה, יעילות המחזוריות תלויה גם ברצפים הספציפיים ובאורכי הפפטידים עקב השפעות סטריות. במקרה כזה, שימוש בשרף בעל כושר העמסה נמוך יותר או מחזוריות של הפפטידים תחת ריכוזים מדוללים בשלב התמיסה יהיה מועיל. פפטידים מחזוריים אלה הראו חדירות משופרת מתא לתא בהשוואה למקביליהם הליניאריים.אנו מאמינים שהם טומנים בחובם הבטחה גדולה לכיבוש מחסומים ביולוגיים וישמשו כמולקולרית ליישומים נוספים בתחום אספקת התרופות.

construction-cyclic-cell-penetrating-peptides-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

זה פרוטוקול פרטים שיטה למדידת כמותית של טרנסלוקציה הפפטיד לתוך שלפוחית ​​גדולה השומנים unilamellar. שיטה זו מספקת גם מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה והוא יכול לשמש כדי לזהות את הפפטידים זה ביעילות באופן ספונטני לחצות bilayers השומנים.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

מתוארת שיטה פשוטה וכללית לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות הקרנת מיקרוגל. הליך זה מאפשר סינתזה של פפטידים מחזוריים של עמוד השדרה עם אוסף של קונפורמציות שונות תוך שמירה על שרשראות הצד והחלקים הפרמקופוריים., ולכן מאפשר לסנן את הקונפורמציה הביו-אקטיבית.

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

זהו פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין עם החידוש של שילוב רצפים חודר לתא. היתרון העיקרי הוא הרצף היעד מודגרת עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות תתרחש בתוך ההקשר הסלולר.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

פרוטוקול זה מציג את הסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה בין ציסטאין למתיונין ואת תגובת תיול-ין המופעלת על ידי מרכז פרופרגיל סולפוניום.

בניית פפטידים מחזוריים באמצעות מרכז סולפוניום על קשירה

פרוטוקול זה נועד להעריך פפטידים ביו-פונקציונליים להרכבה עצמית עבור הידבקות תאים, מורפולוגיה אורגנואידית וביטוי גנים על ידי אימונוסטיין. אנו נשתמש בקו תאי סרטן המעי הגס כדי לספק דרך חסכונית להשגת אורגנואידים לבדיקות אינטנסיביות.

ייצור ואפיון אורגנואידים מסרטן המעי הגס SW1222 בקו תאים במטריצת פפטיד אולטרה-קצרה להרכבה עצמית

למד לסנתז פפטידים מחזוריים חודרי תאים עם קשרים ארומטיים לשיפור חדירות מולקולות תרופה לתאי גידול. השיטה מאפשרת ציקליזציה ללא זרזי מתכות ומגבירה הידרופוביות לחדירה מוגברת דרך מחסומים ביולוגיים.

בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים

גלה סרטונים נוספים