בניית פפטידים מחזוריים חודרי תאים לחדירה מוגברת של מחסומים ביולוגיים

מכשול רציני לטיפול בסרטן הוא הגישה המוגבלת של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר בשל מחסומים פיזיולוגיים. לפיכך, פיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים המסוגלים לטפל במחסומים ביולוגיים רצוי מאוד כדי לשפר את יעילות אספקת התרופות. מטרת הליך זה היא לסנתז את הפפטידים החודרים לתאים מחזוריים לחדירה משופרת מתא לתא.

היתרון של שיטה זו הוא שניתן להשיג בקלות את המחזוריות הפפטידית באמצעות תגובות החלפה עם ציסטאין ושרף ללא צורך בזרזים מתכתיים כלשהם. שילוב של קישורים צולבים ארומטיים משפר את ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים בהשוואה לקישורים הצולבים הידרופיליים לקטם או טריזול, ובכך משפר את החדירות שלהם. כדי להתחיל, להרכיב את מנגנון סינתזת הפפטיד הידני במכסה המנוע.

הניחו את הפקקים התלת-כיווניים על סעפת הוואקום וחברו אותם לחנקן. הקפד לכסות את הפתחים שאינם בשימוש. חברו עמוד פוליפרופילן בקוטר 10 מיליליטר לסטופק התלת-כיווני ונקזו את תערובת התגובה או הממסים מעמוד הפוליפרופילן באמצעות נורת פיפטה גומי או ואקום באמצעות מלכודת פסולת.

כדי להכין את השרף לסינתזה פפטידית, הוסף 4 עד 5 מיליליטר DMF לכמות הנדרשת של שרף והעבר אותו לעמוד פוליפרופילן עם חנקן עדין מבעבע במשך 30 דקות כדי לנפח את השרף כראוי. מסננים את ה-DMF ומוסיפים 4 עד 5 מיליליטר של 50% מורפולין/DMF לשרף. בעדינות לבעבע חנקן במשך 30 דקות כדי להסיר את קבוצת N-terminal Fmoc, ולאחר מכן לנקז את התערובת.

שטפו את השרף ביסודיות שלוש פעמים על ידי הוספת 4 עד 5 מיליליטר DMF לעמוד ומבעבעים בחנקן למשך דקה אחת לפחות בכל פעם. באותו אופן, לשטוף את השרף עם dichloromethane שלוש פעמים DMF שלוש פעמים. לאחר מכן, יש להמיס 648.8 מיליגרם של ארגינין מוגן Fmoc ו-PBF ו-372.6 מיליגרם של HATU ב-5 מיליליטר DMF בצינור צנטריפוגה.

הוסף 348.4 מיקרוליטר של DIPEA כדי להפעיל את תגובת הצימוד, ולהעביר את תערובת התגובה לעמוד פוליפרופילן עם שרף. בעדינות להתסיס את התערובת עם חנקן מבעבע במשך 1 עד 2 שעות, ולאחר מכן לחזור על תגובת הצימוד פעם אחת. סננו את תערובת התגובה ושטפו את השרף ברצף עם DMF, דיכלורומתאן ושוב DMF שלוש פעמים כל אחת למשך דקה לפחות בכל פעם.

הסר את הקבוצה המגנה מפני Fmoc ושטוף את השרף בהתאם להליך שהוצג קודם לכן לפני שתמשיך לזוג חומצת האמינו הבאה. לאחר מכן, חברו את הבטא-אלנין כספייסר עבור תיוג FITC באמצעות אותו תהליך שמוצג עבור צימוד חומצות אמינו, ולאחר מכן הוסיפו תערובת של FITC, DIPEA ו-DMF לעמוד הפוליפרופילן בחושך כדי לבצע תיוג FITC של פפטידים על השרף. התגובה תארך כמעט 8 שעות.

כדי לבצע את המחזוריות של הפפטיד הלינארי, הוסף תערובת של חומצה trifluoroacetic, triisopropylsilane, ו dichloromethane לעמוד פוליפרופילן במשך 2 דקות כדי להסיר באופן סלקטיבי את הקבוצה המגנה טריטיל של ציסטאין. מסננים את התערובת וחוזרים על התהליך עד שתמיסה צהבהבה הופכת לחסרת צבע כדי להסיר לחלוטין את הקבוצה המגנה על טריטיל. בצע שטיפות רציפות של השרף עם DMF ודיכלורומתאן לפחות שלוש פעמים והמיס 4, 4'bis-bromomethyl-biphenyl ב- DMF עם DIPEA.

הוסף את הפתרון לטור והגיב במשך 4 שעות. לשטוף את השרף עם 4 עד 5 מיליליטר של מתנול פעמיים במשך חמש דקות כל אחד, ולייבש אותו עם זרימה רציפה של חנקן. עבור פפטידים המכילים ציסטאין, יש לטפל בשרף עם קוקטייל מחשוף יעיל של חומצה טריפלואורואצטית, טריאיזופרופילסילן, ומים או חומצה טריפלואורואצטית, טריאיזופרופילסילן, 1, 2-אתנדיטיול ומים.

טפל בשרף הקשור לפפטיד במשך 2 עד 3 שעות כדי לבקע את הפפטיד ולאחר מכן הסר את החומצה הטריפלואורואצטית בזהירות עם זרם של חנקן. כדי להשיג את הפפטידים הגולמיים, הוסף 4 עד 5 מיליליטר של אתר דיאתיל להכנת הפפטיד השסוע כדי לזרז את הפפטידים הגולמיים, וצנטריפוגה ב -10, 000 x גרם למשך 4 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ולייבש את הפפטיד באוויר למשך 3 דקות במכסה אדים יעיל.

ממיסים את הפפטיד הגולמי בקנה מידה קטן ב-800 מיקרוליטר של אצטוניטריל, ולאחר מכן מנתחים אותו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב ההפוך וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית. לחסן 100, 000 תאי HeLa ב 2 מיליליטר של DMEM בתא 12 בארות עם תוספת צלחת תרבית רקמה, ולדגור במשך 24 שעות באינקובטור לחות 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% פחמן דו חמצני. הסר את המדיום לדגור את התאים בתאים עם 1 מיליליטר של 10 מיקרומולרי FITC-R8 או FITC-sR8-4 ב DMEM ללא FBS במשך שעה 1.

לאחר מכן, להסיר את המדיום המכיל את הפפטידים ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של PBS. הוסף 1 מיליליטר של DMEM טרי ללא FBS לתאים, ולאחר מכן לדגור במשותף על תאי HeLa בתא עם תוספת צלחת תרבית הרקמה, עם תאי HeLa על הכיסויים העגולים בתחתית במשך 2 שעות. תקן את תאי HeLa על הכיסויים העגולים עם 2.5% גלוטראלדהיד למשך 15 דקות, ולאחר מכן הכתים את התאים עם DAPI למשך 15 דקות.

לבסוף, התבוננו בתאי HeLa על הכיסויים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תרשים סכמטי של הסינתזה של פפטיד R8 ליניארי המסומן בתווית FITC ופפטיד R8 מהודק המסומן ב- FITC מוצג כאן. ספקטרום HPLC ו-MS של הפפטיד R8 הליניארי והפפטיד R8 המהודק מוצגים באיור זה.

זמן השמירה של הפפטיד המהודק היה ארוך משמעותית מזה של האנלוגיה הליניארית, מה שמצביע על הידרופוביות כוללת משופרת של הפפטיד לאחר מחזוריות עם קישור צולב הידרופובי. תמונה גרפית זו מייצגת את יציבות הפפטיד הליניארי והפפטיד המהודק בנוכחות 25% FBS. R8 מחזורי נשאר 77.3% שלם לאחר דגירה עם FBS במשך 4 שעות, בעוד עמיתו הליניארי היה מפורק ברובו, מה שמרמז על יציבות פרוטאוליטית משופרת של פפטיד R8 מחזורי.

תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים של תאי HeLa ותאי 4T1 לאחר דגירה של שעה אחת עם 3 פפטיד R8 ליניארי עם תווית FITC מיקרומולרית ופפטיד R8 מהודק עם תווית FITC מוצגות כאן. ניתן לראות כי התאים שטופלו ב-R8 מחזורי עם קישור צולב ארומטי הפגינו פלואורסצנטיות תוך-תאית גבוהה יותר מאלה שטופלו במקבילם הליניארי. תוצאות דומות התקבלו עם ניתוח ציטומטריה זרימה.

כדי להמשיך ולחקור אם R8 מחזורי מעניק חדירה משופרת מתא לתא, נעשה שימוש במודלים של טרנסוול כדי לדמות את חדירות המחסום של הפפטידים משכבת תא אחת לאחרת. R8 המחזורי הציג בבירור חדירה גבוהה יותר של מחסום טרנס מאשר הפפטיד R8 הלינארי, כפי שצוין על ידי עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות תוך תאית. הגנה מלאה של קבוצת טריטיל של ציסטאין ושרף חשובה לשלב המחזוריות הבא.

חוץ מזה, יעילות המחזוריות תלויה גם ברצפים הספציפיים ובאורכי הפפטידים עקב השפעות סטריות. במקרה כזה, שימוש בשרף בעל כושר העמסה נמוך יותר או מחזוריות של הפפטידים תחת ריכוזים מדוללים בשלב התמיסה יהיה מועיל. פפטידים מחזוריים אלה הראו חדירות משופרת מתא לתא בהשוואה למקביליהם הליניאריים.

אנו מאמינים שהם טומנים בחובם הבטחה גדולה לכיבוש מחסומים ביולוגיים וישמשו כמולקולרית ליישומים נוספים בתחום אספקת התרופות.