עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

שיטה זו יכולה לבדוק רנ"א מנחה בעוברים, לבחון שאלות התפתחותיות מוקדמות או ליצור עכברים ערוכים. כל התקדמות ב- CRISPR Cas9 יכולה לשמש בשיטה זו. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שהיא קלה ללמידה ומשתמשת בריאגנטים הזמינים למעבדות שיש להן גישה לעכברים.

בעתיד, טכניקה זו תהיה שימושית לתיקון מחלה או מוטציה בצאצאים של חיית מחמד או חיה חשובה לחקלאות. שיטה זו מתאימה ביותר ליצירת מודלים עכבר. במעבדה שלנו, השתמשנו בווריאציות של שיטה זו כדי לחקור את האירועים סביב הפריה והתפתחות מוקדמת לפני השרשה, במיוחד בקרת גנים בעוצמת העובר.

החלק המאתגר ביותר הוא השימוש במחט הזכוכית כדי להעביר עוברים מצלחת לצלחת. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה שנטל דיאלו, מומחית מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל באיסוף ועיבוד העוברים, הניחו את נקבת העכבר המורדמת על גבה ורססו 70% אתנול על הבטן לפתיחה כירורגית.

כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את האובידוקטים, חתכו את שכבת העור במספריים כירורגיים ואתרו את השחלות. לאחר מכן, להסיר בניתוח את שני oviducts, הממוקם פרוקסימלי השחלות, ומניחים אותם לתוך טיפות בודדות 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA בינוני. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו במלקחיים לדיסקציה כדי לנקב את האמפולה של האובידוקט כדי לשחרר את קומפלקסי קומולוס-ביציות, או COC, המכילים ביציות, ולאחר מכן כדי למנוע נשיאה של פסולת, העבירו ושלבו כל קומולוס-ביצית לטיפה אחת של 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA עם פיפטה מטופלת המוגדרת ל-20 עד 30 מיקרוליטר.

לאחר מכן, כדי להסיר תאי קומולוס מהזיגוטות, העבירו COC עם מעט מדיה נוספת לטיפה של 100 מיקרוליטר M2 בתוספת היאלורונידאז וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג עד שהעוברים מופרדים באופן נראה לעין מתאי הקומולוס הקטנים בהרבה. כדי לדלל היאלורונידאז ולפנות תאי קומולוס רופפים, השתמשו בפיפט המופעל על ידי הפה כדי להעביר את הזיגוטה לטיפת M2 טרייה של 50 מיקרוליטר בתוספת BSA. לאחר מכן, כדי לשחוק את zona pellucida של העובר ולהפחית מכשולים פיזיים נוספים למסירה מגיבה, להעביר את העוברים לטיפה 100 מיקרוליטר שחוממה מראש של חומצה Tyrode, או תמיסת AT, על צלחת 60 מ"מ.

התבונן ברציפות בזיגוטה תחת מיקרוסקופ סטריאו עד ש-30% מהזונה פלוצ'ידה נשחקת, ואז כדי לדלל את ה-AT, העבר את העוברים דרך ארבע טיפות של 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA. לאחר מכן, לקבוע מספר מתאים של עוברים שעובדו על ידי ספירתם תחת מיקרוסקופ סטריאו. לדלל BSA על ידי העברת העוברים דרך שתי טיפות של 50 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום.

לאחר מכן, פיפטה בפה 25 עד 30 עוברים לתוך טיפה של 10 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום, ולאחר מכן להשתמש פיפטה כף יד כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של ריבונוקלאו פרוטאין או קומפלקס RNP. לדלל את גליצרול צמיג מן קומפלקס RNP הומוגניזציה הדגימה על ידי pipetting 10 פעמים או עד תערובת כבר לא מראה צמיגות. לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובת עובר ו- RNP לתוך קובטת אלקטרופורציה של 0.1 ס"מ תוך הימנעות מבועות, ולאחר מכן כדי להעביר את ריאגנטי העריכה לתוך הזיגוטה אלקטרופורציה את העוברים באמצעות פרוטוקול גל מרובע של 30 וולט, 4 עד 6 פולסים עם אורך פולס 3 אלפיות השנייה, ו 100 מרווחי פעימות.

לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של M2 בתוספת BSA לחלק העליון של הקובט כדי לשטוף את העוברים מהקובטה ופיפט בעדינות את התערובת הזו לצלחת. לתרבית עוברים, העבירו 20 עד 30 זיגוטות לטיפה של KSOM בתוספת BSA בצלחת תרבית מאוזנת מראש והעבירו את העוברים לטיפה. דוגרים על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני עם 95% לחות.

למחרת, העבירו רק עוברים דו-תאיים לטיפה טרייה של תערובת KSOM בתוספת BSA והחזירו את הצלחת לאינקובטור. להשאיר או להשליך את העוברים המתים או הלא מופרים. לפני הג'נוטיפ, שטפו את עוברי המורולה בלסטוציסט בשתי טיפות של DPBS כדי לדלל את רכיבי המדיה שעלולים להפריע לתגובת PCR.

באמצעות פיפטה הפה, להעביר עוברים בודדים לבאר אחת של רצועת PCR 8 באר ולהוסיף 10 מיקרוליטר של חיץ ליזיס. לאחר מכן, כדי לשכב את העוברים, תכנת מחזור תרמי ל 55 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות, ואז להשבית את פרוטאינאז K עם דגירה של 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. במחקר זה מוצגת אסטרטגיה לדוגמה למיקוד מוקד הטירוזינאז בעכבר כבקרה חיובית, כולל עיצובי אוליגו ואסטרטגיות גנוטיפ לחיבור קצה לא הומולוגי ותיקון מכוון הומולוגיה.

בעת מסירת מדריך יחיד יחיד, או sgRNA, אספקת RNPs הייתה עד וכולל 100% בזני עכברי C57 שחורים 6J ו- C57 שחורים 6N עם היווצרות מחיקות החדרה המתרחשות ב- 50% עד 100% ותחליפים קטנים מבוססי אוליגו הנעים בין 17% ל- 63% בעת הנדסת מחיקות גנומיות, יעילות העריכה משתנה בין 3% ל -100%העובר צריך להישמר בתנאים אידיאליים ככל האפשר, כך שככל ש הפרוטוקול נעשה, יותר טוב. כמו כן, צמצמו את החשיפה להיאלורונידאז ולחומצה טירוד. שיטה זו מתארת יצירת בעל חיים ערוך, בדיקת יכולת השתלה או כדאיות הריונית, או ביצוע הניסוי מספר פעמים כדי לאסוף מדידות או תמונות ומדדים שונים במהלך הפיתוח שלפני הנטיעה.