בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

פרוטוקול זה יסייע לחוקרים חדשים בעבודה עם אפטמרים כדי שיוכלו להשתמש בהם בפרויקטים שלהם וגם להבין את הצעדים הקטנים האינדיבידואליים הנדרשים להשלמת הפרוטוקול. Aptamers הם מאוד תכליתיים, ופרוטוקול זה מדגים עד כמה הם קלים ופשוטים במבחן אימונופנוטיפ. Aptamers ניתן להשתמש הן עבור יישומים אבחון וטיפול.

פרוטוקול זה הוא הצעדים הראשונים שננקטו כדי לאשר את הספציפיות והרגישות שלהם. בעוד שבדיקה מסוימת זו מדגימה צביעה של קולטן פני השטח של תא אחד, aptamers יכולים בקלות רבה לשמש עבור ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית, המספקת רמה גבוהה של ידע פנוטיפי. ההיבטים החשובים של עבודה עם aptamers הם להבטיח כי הם מקופלים כראוי לפני השימוש, וגם כי החיץ ואת תנאי הכוח היוני זהים כאשר הם נבחרו.

לאחר איסוף והשלכת המדיה בבקבוקון, מוסיפים שלושה מיליליטר של PBS ומורחים אותו על התאים. לאחר הוספת מיליליטר אחד של 0.25% של טריפסין-EDTA לכל בקבוקון, דגירה במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולדמיין את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום שלם לתאים ופיפט את התאים למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף של תא בודד.

לשפוך את התאים לצינור מתאים וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש לתלות את התאים במיליליטר אחד של מדיום טרי ולספור את התאים באמצעות צביעה כחולה טריפאן על ידי דילול נפח מסוים של תרחיף התאים בכחול טריפאן. להפיץ כ 15 microliters של התערובת בין hemocytometer וכוס כיסוי לספור את התאים.

לאסוף את המספר הנדרש של תאים, ולוודא שיש מאה אלף תאים לכל דגימת בדיקה. לאחר מכן דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר ייצוב של החלבון המעניין על קרום התא לאחר ניתוק אנזימטי. לאחר הדגירה של שעתיים, סובבו את התאים בעוצמה של 500 גרם למשך חמש דקות.

לאחר השלכת supernatant, להשעות את התאים ב 500 microliters של חסימת חיץ. דגירה של התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם ערבוב לסירוגין. במהלך דגירה זו של 30 דקות, בצע קיפול אפטמר על ידי הכנת ריכוזים כפולים של אפטמרים כמתואר בכתב היד.

לאחר מכן מערבבים ומדגרים את האפטמרים עם מכונת התרמוציקלר בהתאם לתנאי הקיפול הנדרשים תוך הקפדה על הגנה על האפטמרים מפני אור. לאחר 30 דקות הדגירה, צנטריפוגה של התאים כפי שהוכח קודם לכן ולהסיר את supernatant. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מאגר לשטוף צנטריפוגה את התאים שוב.

לאחר הסרת supernatant, לתלות את התאים בנפח מתאים של חיץ מחייב. לאחר מכן, פיפטה 50 מיקרוליטר של התאים המחיים לתוך כל באר של צלחת קרה כקרח 96 שחור היטב. לאחר מכן פיפטה 50 מיקרוליטרים של האפטמרים על נפח של 50 מיקרוליטרים של תאים, מערבבים ודוגרים בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר הצנטריפוגה והסרת הסופרנטאנט, יש להשעות בזהירות את הכדור במאגר הכביסה ושוב את הצנטריפוגה ב-500 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן יש להשעות ב-100 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה תוך חזרה על שלב השטיפה פעמיים. ראשית, הפעל את ציטומטר הזרימה ולאחר מכן את המחשב.

לאחר מכן, פתח את תוכנת ניתוח ציטומטריה של זרימה, היכנס לתוכנית, ותחת הכרטיסייה ציטומטר הפעל אתחול זורם. כדי ליצור ניסוי חדש, תחת הכרטיסיה ניסוי, לחץ על תיקיה חדשה ותן שם הולם לניסוי הלוכסן של התיקיה. לחץ על התיקיה החדשה כדי להדגיש אותה.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה ניסוי שוב, לחץ על ניסוי חדש ותן שם לניסוי בהתאם. כדי להוסיף את דגימת הלוכסן הראשונה לדוגמה, תחת הכרטיסיה ניסוי לחץ על דגימה חדשה ותן שם לדגימה בהתאם. כדי להוסיף דגימת צינור, סמן את הדגימה ותחת הכרטיסייה ניסוי, לחץ על צינור חדש.

לאחר מכן הוסף את המספר המתאים של צינורות ושם. כדי להכין את הגרפים הנדרשים, תחת לשונית גליון עבודה, פתח גליון עבודה חדש. לאחר שחלון גליון העבודה החדש יופיע, הכן גרף כתם נקודות של פיזור צדדי לעומת פיזור קדימה כדי לבחור את האוכלוסייה המעניינת.

הכן גרף כתם נקודה של גובה הפיזור קדימה לעומת אזור הפיזור קדימה כדי לבחור את אוכלוסיית התא הבודד. לאחר מכן, להכין היסטוגרמה של מספר האירועים נגד fluorophore של עניין. ודא שלוח המחוונים של הרכישה לשליטה ברכישת הדגימה, המפקח והציטומטר להתאמת פרמטרי המתח וכן גליון העבודה עם כל הגרפים פתוח לפני תחילת ציטומטריה של זרימה.

ראשית, הפעל את התאים שלא טופלו. ודא שהחץ המצביע על הצינור ירוק. אם חץ זה אינו ירוק, לחץ על החץ כדי להפוך אותו לירוק.

באמצעות פיפטה, העבירו כל דגימה מהצלחת השחורה 96 לצינור ציטומטריה של זרימה. בלוח המחוונים של הרכישה, בחר מספר מתאים של אירועים להקלטה, שנה את קצב הזרימה לנמוך ולחץ על רכוש נתונים. התאם את המתח עבור הפרמטרים FSC ו- SCC, וודא שאוכלוסיית התאים מרוכזת בתוך מתווה הנקודה ושאף תא לא נוגע באף אחד מהצירים של הגרף כדי למנוע אובדן של התאים המעניינים.

הגדר את השער הראשון על ידי זיהוי ובחירת האוכלוסייה המעניינת בחלקת צפיפות מפוזרת קדימה ובצד תוך אי הכללת הפסולת, המהווה את האוכלוסייה עם אות הפיזור הקדמי הנמוך ביותר. הגדר את השער השני על-ידי אי-הכללת אוכלוסיות תאים כפולים, שכן תאים כפולים משפיעים במידה ניכרת על התוצאות והמסקנות. הגדל את מהירות הרכישה לבינונית או גבוהה כדי לנתח את הדגימות מהר יותר, אך אל תעלה על יותר מ -200 עד 300 אירועים בשנייה.

לאחר מכן לחץ על נתוני רשומה. לאחר התאמת המתח וההתחמקות והקלטת הנתונים, הוצא את הדגימה ולחץ על הצינור הבא. הוסף את הדוגמה הבאה וחזור על נתוני ההקלטה עבור כל דוגמאות הבקרה והבדיקה.

לאחר איסוף כל הנתונים, יש לשטוף את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת שלושה צינורות של 50% אקונומיקה, FACSRinse ומים אולטרה-פוריים, כל אחד במשך חמש דקות בקצב זרימה גבוה. לאחר מכן, מהתפריט הנפתח של הציטומטר, לחץ על כיבוי fluidics. ייצא את התוצאה כקבצי fsc לכונן USB להעברה.

נתח אותם באמצעות תוכנת הניתוח על-ידי לחיצה על הלחצן החדש כדי ליצור מסמך וחלון חדשים לטיפול בניתוח, וגרור את הקבצים לדוגמה לחלון החדש. לחץ פעמיים כדי לפתוח את הדוגמה שלא הוכתמה. כדי לשער את אוכלוסיית התא הבודד, בחר באוכלוסיית P1 ולחץ פעמיים על אוכלוסיית P1 כדי ליצור גרף FSCH לעומת FSCA.

לחץ פעמיים על התאים הבודדים המגודרים כדי ליצור היסטוגרמה של אירועים כנגד הפלואורוכרום המשמש. בחלון המקורי, בחר P1 ותאים בודדים וגרור אותם לכל הדגימות כך שכל הדגימות יכילו כעת את אותו gating. לאחר מכן, לחץ על כפתור עורך הפריסה כדי לפתוח את חלון הפריסות וגרור שתי דוגמאות זו מעל זו כדי ליצור היסטוגרמה של שכבת-על.

בתאי MDA-MB-231 חיוביים ל-EpCAM, כיסוי ההיסטוגרמות המייצגות תאים שטופלו ב-TEPP וב-TENN מראה שהתאים המטופלים ב-TEPP מוסטים ימינה, בהשוואה לתאים המטופלים ב-TENN המוכיחים כי הקשירה של ה-TEPP aptamer מתרחשת לחלבון המעניין. בבקרה שלילית, תאי HEK 293T מעל כיסוי היסטוגרמות של TEPP ו- TENN אינם משקפים כל תזוזה המציינת כי בתאים המבטאים EpCAM TEPP הוא אפטמר EpCAM מחובר לקולטן שלו. יתר על כן, לא נצפתה קשירה בתאים שליליים של EpCAM, המאשרת את הסלקטיביות והספציפיות של האפטאמר המפותח.

ודא שהאפטמרים מוגנים מפני אור, האפטמרים והתאים מעורבבים על הצלחת, והמתחים הנכונים מוגדרים על ציטומטר הזרימה. זה תלוי מאוד ביישומים עתידיים עבור האפטמרים. לדוגמה, אנו מתמקדים באספקת תרופות.

אז השלב הבא עבורנו יהיה להעריך אם האפטמרים מופנמים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. פרוטוקול זה הדגים עד כמה קל לאפטמרים להחליף נוגדנים חד שבטיים ופוליקלונליים במבחנים אימונופנוטיפיים.