Name: טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למד שיטה זעיר פולשנית להזרקה תוך-תימית בעכברים באמצעות הדרכת אולטרסאונד. הטכניקה מדויקת ובטוחה לתימוסים אטרופיים בעכברים מבוגרים או חסרי חיסון, ומאפשרת ניסויים בקנה מידה גדול ללא דיכאון חיסוני מלחץ ניתוחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לריימונד ה. ת'ורנטון על עבודתו המוקדמת התובנה והמקיפה על טכניקה זו. מחקר זה מומן על ידי תמיכה במענקים מהמכון הלאומי לסרטן (NCI 1R37CA250661-01A1), האגודה לחקר לוקמיה בילדים, בית הספר לרפואה של מרידיאן האקנסק, וקרן HUMC / התמודדות עם סרטן ילדים.

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים במרכז לגילוי וחדשנות (פרוטוקול IACUC 290). עבור המחקר הנוכחי, C57BL/6 עכברים (נקבה, 4-6 שבועות), C57BL/6 עכברים (נקבה, בת 6 חודשים), עכברים נקבות J:NU, עכברי נקבות NOD scid gamma (NSG) ו-B6; עכברי CAG-luc, -GFP שימשו כמודל העכבר הצעיר, מודל העכבר הזקן, מודל העירום האתימי, מודל החיסון ומקור התא הביולוגי, בהתאמה. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). הליך זה ידרוש בדרך כלל שני אנשים (אחד להישאר סטרילי בעת ביצוע הזריקות והשני לטפל בעכברים).
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>השרימו הרדמה בעכברים באמצעות גז איזופלורן 3%-4% ושמרו על הרדמה באמצעות גז איזופלורן 1%-3% הניתן באמצעות חרוט אף ומכשיר אידוי מכויל מדויק (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>אשרו את עומק ההרדמה/חוסר ההכרה המתאימים על ידי חוסר תגובה לצביטת הכפה האחורית.</li>
	<li>הסר את הפרווה מאזור החזה הקדמי של העכברים על ידי החלת שכבה דקה של קרם דפילציה במשך פחות מדקה אחת. השתמשו במגבת נייר רטובה כדי להסיר את הקרם לחלוטין יחד עם הפרווה הרופפת. הערה: מריחת קרם רב מדי תגרום לעור באזור החזה להיות מודלק.</li>
	<li>הניחו עכבר אחד בכל פעם, בשכיבה, על הפלטפורמה המחוממת של תחנת ההדמיה של אולטרסאונד של בעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) עם חרוט האף במקומו (איור 1).</li>
	<li>הצמידו את העכבר לשלב באמצעות סרט דבק רפואי בחלק האחורי ובגפיים הקדמיות (איור 1).</li>
	<li>יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.</li>
	<li>יש לחטא את עור בית החזה העליון ללא פרווה באמצעות אפליקטור כלורהקסידין גלוקונאט (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>2. הכנת מכשיר האולטרסאונד והשדה הסטרילי
<ol><li>הפעל את הבדיקה הליניארית בתדר הגבוה ביותר הזמינה, בדרך כלל הבדיקה עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה ביותר עבור גודל החיה המצולמת. הפעל את הבדיקה על-ידי הקשה על הלחצן המתאים לאחר מסך האתחול. הערה: עבור יישום זה עם עכברים, הבדיקה המשמשת מיועדת במיוחד לשימוש עם עכברים וחולדות קטנות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מטב את הגדרות האולטרסאונד להדמיה והזרקה בהתאם לשלבים הבאים.<ol><li>התאם את עומק שדה הראייה לגודל המתאים לחיית המטרה על-ידי התאמת המחוונים המכוונים אנכית בצד ימין של המסך (איור 2). הגדרת העומק המרבית תהיה בדרך כלל כ-6-8 מ"מ לעכברים צעירים.</li>
		<li>כוונן את רווח גווני האפור על-ידי החלקת הלחצן לאורך הסרגל האופקי בתחתית המסך (איור 2). המטרה היא להתחיל עם תמונה שהיא רק מעט כהה יותר מאשר מראה "אפור" טיפוסי.</li>
		<li>התאם את אזור המוקד (חץ כחול בצד ימין של המסך, איור 2) לרמה הצפויה של בלוטת התימוס. עבור עכברים צעירים, זה יהיה סביב עומק של 4 מ"מ.</li>
		<li>אם ברצונך לצלם תמונה, בדוק את הפונקציונליות של תמונת החנות ואחסן לחצני קליפ כדי לוודא שניתן לשמור את התמונות כראוי לאורך כל ההליך. בצע זאת על-ידי הקשה על לחצן שמור קליפ בפינה השמאלית התחתונה של המסך או על-ידי הקשה על לחצן הקפאה ולאחר מכן הקשה על שמור תמונה (איור 2).</li>
	</ol></li>
	<li>יש למרוח כמות קטנה (~1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד על משטח המתמר (ראו טבלת חומרים) כשהוא זקוף, כשהוא מונח במחזיק מכשיר האולטרסאונד או בידיו של עוזר.</li>
	<li>הכינו שדה סטרילי קטן ליד הפלטפורמה המחוממת. המיקום האופטימלי לכך הוא בדרך כלל בין הפלטפורמה למכשיר האולטרסאונד.<ol><li>רוקנו את הפריטים האלה לשדה הסטרילי: כיסוי בדיקה סטרילי, גומייה, כפפות סטריליות וג'ל אולטרסאונד סטרילי (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>עם הקמת השדה הסטרילי והפריטים במקום, לבשו את הכפפות הסטריליות.</li>
		<li>מניחים בזהירות את כיסוי הבדיקה הסטרילי מעל מתמר האולטרסאונד (כמו גם מעל הג'ל שהונח בתחילה על הבדיקה). לשמור על סטריליות ולגעת רק בכיסוי הסטרילי, שום דבר אחר. החליקו את הגומייה הסטרילית מעל כיסוי הבדיקה הסטרילי כדי לשמור אותה במקומה. הערה: מוקדי האוויר, ללא קשר לגודלם, עלולים להפריע להדמיית אולטרסאונד. לפיכך, חיוני להחיל את ג'ל האולטרסאונד בין המתמר לכיסוי הבדיקה הסטרילית, ועל גבי כיסוי הבדיקה כדי להבטיח ממשק ללא אוויר בין בדיקת האולטרסאונד לבין החיה.</li>
		<li>יש להניח כמות מתונה (2-3 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר. הערה: המשתמש מוכן כעת לצלם עכבר מורדם.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הדמיה ואיתור בלוטת התימוס
<ol><li>תוך שמירה על סטריליות, הניחו את הבדיקה בעלת ג'ל האולטרסאונד במאונך על החלק המחוטא של דופן החזה הקדמית של העכבר לצורך הדמיה ראשונית.<ol><li>קח רגע להסתכל על תמונת האולטרסאונד ולייעל אותה עוד יותר. חזור לשלב 2.2 והתאם את עצמך כדי לקבל מראה דומה לזה של איור 3.</li>
	</ol></li>
	<li>סרוק את החזה הקדמי של העכבר במישור רוחבי. בצעו זאת על ידי החזקת המתמר במאונך והזזתו מעלה ומטה מהצוואר אל הבטן בתנועה דמוית מכחול או "סוחפת". הערה: הלב יהיה המבנה המזוהה ביותר בחזה בשל תנועתו המהירה ומראהו ה"קאמרית". ברגע שהלב ממוקם, זה יכול לשמש כנקודת התייחסות כדי לרכוש תמונה של בלוטת התימוס.</li>
	<li>כאשר הלב מרוכז בשדה הראייה, טאטאו את המתמר מעט לכיוון הצוואר. רק עדיף על הלב, התימוס הוא נתקל בדרך כלל.</li>
	<li>דמיינו את בלוטת התימוס כמבנה בילובי, פירמידלי, היפואקואי ("כהה" או "שחור" המופיע על המסך) שמרכזו בקו האמצע, קדמי לאבי העורקים ואחורי לעצם החזה (איור 3A).</li>
	<li>שימו לב לשני המבנים השחורים העגולים (כלומר, "היפואקואיים") משני צדי החזה העליון. הערה: אלה הם הווריד הקאווה הדו-צדדי. אבי העורקים הוא מבנה היפואקואי מעוגל דומה בקו האמצע בין שני הוורידים. ניתן לזהות אותם בקלות על ידי תנועתם הפועמת.</li>
</ol>4. הזרקת התימוס
<ol><li>במידת הצורך, יש למרוח יותר (2-3 מ"ל) ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר. הערה: כמות גדולה יחסית של ג'ל סטרילי על המתמר (בהשוואה לגודל בית החזה של העכבר) תשמש כ"כרית ג'ל" סביב דופן החזה של העכבר. זה יקטין את מספר ממצאי האולטרסאונד שנעשו על ידי אוויר בתוך שדה הראייה.</li>
	<li>באמצעות בדיקת אולטרסאונד, אתר את החלק הרחב ביותר של בלוטת התימוס, שהוא בדרך כלל אתר היעד האידיאלי להזרקה. צפה מסלול מחט אופקי במיקום הנבחר.<ol><li>שימו לב היכן נמצאים כלי הדם העיקריים (SVCs ואבי העורקים) באתר זה. הימנע אלה במהלך ההזרקה.</li>
		<li>כלי הדם יהיו מבנים היפוכואיים, פועמים, כמתואר בשלב 3.7. אם אינכם בטוחים, השתמשו במצב דופלר בצבע כדי לבדוק אם יש זרימה בתוך כלי הדם (איור 4A). הפעל את מצב דופלר הצבע על-ידי הקשה על לחצן צבע על המסך.</li>
		<li>אם אחד מכלי הדם העיקריים (או הלב) צפוי להיות לאורך מסלול המחט הצפוי, בחר אזור יעד חדש או מצא גישה/מסלול אחר.</li>
	</ol></li>
	<li>החזיקו את המתמר ביד אחת ובמחט אינסולין של 30 גרם (ראו טבלת חומרים) עם 10 מיקרוגרם של הזרקה ביד השנייה. הערה: ההזרקה תשתנה בהתאם לתכנון הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתמיסת מלח עם מאגרי פוספטים, טריפן כחול או D-לוציפרין (0.1 מיקרוגרם/10 מיקרול).</li>
	<li>כדי להתחיל בתהליך ההזרקה, הזז את המתמר לרוחב כך שהתימוס יהיה מחוץ למרכז בשדה הראייה של האולטרסאונד. ודא כי הצד השני של שדה הראייה מורכב בעיקר ג'ל אולטרסאונד ולא שום דבר אחר.</li>
	<li>הניחו את קצה המחט בג'ל שמתחת למתמר והזיזו את המחט באיטיות עד שהיא תזוהה בצמוד לפני העור (איור 4B).</li>
	<li>תוך כדי הדמיה רציפה של המחט תחת אולטרסאונד, יש להחדיר את המחט לבלוטת התימוס במסלול מלעורי, הרחק מכלי הדם.<ol><li>השתמש במסלול אופקי "קרוס תימוס" כדי למקם את קצה המחט באונה התימית בניגוד לאתר הכניסה. זה מסביר דליפה פוטנציאלית לאורך מערכת המחט (איור 5A).</li>
	</ol></li>
	<li>ברגע שקצה המחט נמצא בתוך החלק הרצוי של בלוטת התימוס, הזריקו במהירות את התוכן (כגון 10 μL של טריפן כחול או D-לוציפרין, 0.1 מיקרוגרם/10 μL) מהמזרק 30 G תוך שימוש בהדמיה סונוגרפית.<ol><li>כדי לייצב את המזרק במהלך החדרת המחט והזרקתה, החזיקו את המזרק בין האגודל לאצבע השלישית ושלטו בבוכנה של המזרק באמצעות האצבע המורה.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר את המחט לאחר שכל התוכן הופקד.</li>
</ol>5. ניטור לאחר הזרקה של בעלי חיים
<ol><li>מעבירים את החיה לכלוב ריק ומתבוננים עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על משכון החזה. הערה: התאוששות מלאה מההרדמה צפויה להתרחש תוך 2 דקות.</li>
	<li>עקוב אחר בעל החיים במשך 10 דקות נוספות לאיתור סימני מצוקה, נשימה מאומצת או דימום. הערה: כאבים לאחר ההזרקה אינם צפויים, ובדרך כלל אין צורך בשיכוך כאבים לאחר ההזרקה.</li>
	<li>לאחר שהתאושש לחלוטין ולאחר תקופת תצפית ללא אירועים לאחר ההזרקה, החזירו את החיה שהוזרקה לחברתם של בעלי חיים אחרים.</li>
</ol>

<ol><li>Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+primary+lymphoid+organs+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Changes in primary lymphoid organs with aging.</a> Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).</li>
<li>Gruver, A. L., Sempowski, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%2C+leptin%2C+and+stress-induced+thymic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).</li>
<li>Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+dirty+mice%2C+and+men%3A+Using+mice+to+understand+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology.</a> Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).</li>
<li>Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+animal+models+in+biomedical+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals+Research%22%5BJournal%5D)">Role of animal models in biomedical research: a review.</a> Laboratory Animals Research. 38 (1), 18(2022).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+What+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: What have we learned from mice.</a> Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).</li>
<li>Zlotoff, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+and+CCR9+together+recruit+hematopoietic+progenitors+to+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus.</a> Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).</li>
<li>Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+T-lymphocytes+induced+by+intrathymic+injection+of+a+thymic+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line.</a> Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).</li>
<li>Schwarz, B. A., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+hematopoietic+progenitors+with+T+lineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential.</a> Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).</li>
<li>Marodon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antigen-specific+tolerance+by+intrathymic+injection+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors.</a> Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).</li>
<li>Adjali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+correction+of+ZAP-70+immunodeficiency+by+intrathymic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).</li>
<li>Tuckett, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+intrathymic+injection+of+multipotent+stem+cells+supports+life-long+T+cell+immunity+and+facilitates+targeted+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy.</a> Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).</li>
<li>Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection+of+hematopoietic+progenitor+cells+establishes+functional+T+cell+development+in+a+mouse+model+of+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109(2017).</li>
<li>Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+induced+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Surgeon%22%5BJournal%5D)">Surgery induced immunosuppression.</a> Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).</li>
<li>Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+intrathymic+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">An alternative method for intrathymic injections in mice.</a> Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).</li>
<li>Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-hand+ultrasound+guidance+permits+safe+and+efficient+minimally+invasive+intrathymic+injections+in+both+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).</li>
<li>Küker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+necropsy+reports+for+animal+health+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">The value of necropsy reports for animal health surveillance.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 191(2018).</li>
<li>Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+thymocyte+death+underlies+the+CD4%3ACD8+T-cell+ratio+in+the+adaptive+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).</li>
<li>Manna, S., Bhandoola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathymic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intrathymic injection.</a> Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).</li>
<li>de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+intrathymic+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Refinement of intrathymic injection in mice.</a> Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הזרקה ידנית חופשית מונחית אולטרסאונד היא טכניקה מדויקת ביותר להעברת חומרי לימוד לבלוטת התימוס בצורה יעילה ואספטית. לאחר העיקור הראשוני של העור באתר ההזרקה, נשמרת סטריליות במהלך ההליך הודות לשימוש בכפפות סטריליות, כיסויי בדיקת אולטרסאונד סטריליים וג'ל אולטרסאונד סטרילי. בניגוד לגישה המלעורית העיוורת 10,17 או הסתמכות על חתכים כירורגיים להדמיה ישירה של בלוטת התימוס18,19, שהן השיטות הנפוצות להזרקות תוך-תימיות בעכברים, שימוש בהנחיית אולטרסאונד ...

לתימוס יש תפקיד חיוני בהתפתחות תאי T ובחסינות. מחסור בתאי T, אשר יכול להיגרם על ידי התנוונות thymic, הפרעות גנטיות, זיהומים, וטיפולים בסרטן, בין היתר, מוביל לתמותה גבוהה ותחלואה 1,2. מודלים של עכברים הם הכרחיים הן במחקר אימונולוגיה בסיסית והן במחקר אימונולוגיה תרגומית, והם שימשו במשך עשרות שנים לחקר ביולוגיה תימית והתפתחות תאי T, כמו גם לפיתוח טיפולים עבור אלה הסובלים מתפקוד לקוי של בלוטת התימוס ומחסור בתאי T 3,4,5.
חלק מרכזי בחקר התימיקה היה הזרקה תוך-תמית של חומרים ביולוגיים כגון תאים, גנים או חלבונים במודלים של עכברים 6,7,8,9,10,11,12. שיטות הזרקה תוך-תימיות קונבנציונליות משתמשות בכריתת בית החזה ולאחר מכן בהזרקה תוך-תימית בהדמיה ישירה או בהזרקה מלעורית "עיוורת" למדיאסטינום. הגישה הניתוחית מגדילה באופן משמעותי את הסיכון לפנאומוטורקס, בין היתר. יתר על כן, הלחץ המוגבר במהלך ניתוח זה גורם לדיכוי חיסוני, ובכך עלול לפגוע בנתונים אימונולוגיים13. חוקרים מנוסים, לאחר תרגול מסוים, יכולים לבצע את טכניקת ההזרקה העיוורת, אך גישה זו פחות מדויקת ולכן מגבילה את הנבדקים הניסיוניים לעכברים צעירים עם תימוס גדול.
השימוש בהנחיית אולטרסאונד הוכנס כחלופה מדויקת וזעיר פולשנית לגישות ההזרקה התוך-תימיות המסורתיות14. עם זאת, הליך זה גוזל זמן רב בעת שימוש במערכת המסילה המשולבת במקום בטכניקת היד החופשית. ביצוע הזרקות עם תושבת ההזרקה דורש אופטימיזציה ומיקום קפדניים של המתמר בעזרת החיבורים השונים כגון מעמד המתמר והרכבתו, מערכת המיקום X, Y ו- Z, כמו גם הפעלה מיומנת של בקרות המיקרו-מניפולציה והרחבות מערכת המסילה. טכניקה חלופית פשוטה, הזרקת תימי מונחית אולטרסאונד, מוצגת כאן על ידי רדיולוג באמצעות גישה ביד חופשית15, שהיא גם חלופה מהירה וגם מדויקת זעיר פולשנית לשיטות שתוארו לעיל. חשוב לציין, ניתן לבצע את הגישה הנוכחית עם כל מערכת הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה ללא צורך בתושבת הזרקה ומערכת מסילות משולבת. הוא שימושי במיוחד למחקרים הדורשים הזרקה של מספר גדול של עכברים11, לניסויים הכוללים הזרקה של שתי האונות התימיות, או להזרקה מדויקת של תימוזים קטנים בעכברים מזדקנים, מוקרנים או מדוכאי חיסון12.

<table><tbody><tr><td>Aquasonic 100 אולטרסאונד ג'ל</td><td>מעבדות פרקר (פיירפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>01-01</td><td>ג'ל העברת אולטרסאונד</td></tr><tr><td>סטרילי B6; CAG-luc, -עכבר GFP</td><td>מעבדת ג'קסון (בר הרבור, מיין, ארה"ב)025854</td><td></td> <td>מקור תא ביולומינסנציה</td></tr><tr><td>BD מזרקי אינסולין עם מחט</td><td>בקטון דיקינסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)328431</td><td></td> <td>מחט דקה במיוחד - 12.7 מ"מ, 30 גרם</td></tr><tr><td>עכבר C57BL/6 - מיושן</td><td>מעבדת ג'קסון (בר הרבור, מיין, ארה"ב)000664</td><td></td> <td>בן 6 חודשים; עכבר מיושן</td></tr><tr><td>דגם C57BL/6 - צעיר</td><td>מעבדת ג'קסון (בר הרבור, מיין, ארה"ב)000664</td><td></td> <td>גיל 4-6 שבועות; הדגם הצעיר</td></tr><tr><td>Chloraprep One-step 0.67 מ"ל</td><td>CareFusion (אל פאסו, טקסס, ארה"ב)</td><td>260449</td><td>מוליך כלורהקסידין גלוקונאט</td></tr><tr><td>Curity Cotton Tippped Applicator</td><td>Cardinal Health (דבלין, אוהיו, ארה"ב)</td><td>A5000-2</td><td>סטרילי, 6 אינץ'</td></tr> <tr><td>D-Luciferin</td><td>Gold Biotechnology (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein (מלוויל, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5</td><td>PerkinElmer (Melville, NY, USA)</td><td>n/a</td><td>מערכת הדמיה ביולומינסנציה In vivo עכבר</td></tr><tr><td>J:NU</td><td>מעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME, ארה"ב)</td><td>007850</td><td>מודל עירום אתימי</td></tr><tr><td>קנדל סרט נייר היפואלרגני</td><td>Cardinal Health (דבלין, אוהיו, ארה"ב)</td><td>1914C</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech כפפות ניטריל כירורגיות</td><td>קימברלי-קלארק פרופשיונל (אירווינג, טקסס, ארה"ב)</td><td>56892</td><td>כפפות סטריליות</td></tr><tr><td>קרם מסיר שיער נאיר</td><td>צ'רץ' ודווייט (טרנטון, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>n/a</td><td>חומר אפילציה</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG) עכבר</td><td>מעבדת ג'קסון (בר הרבור, ME, ארה"ב)005557</td><td></td> <td>דגם חסר חיסון</td></tr><tr><td>מי מלח פוספט חוצץ (PBS), 1x</td><td>קורנינג (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>21-040- </td><td></td>CV</tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Med Vet International</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td>משחת עיניים</td></tr><tr><td>מעטפת</td><td>טכנולוגיות מעטפת (מורגן היל, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>10040</td><td>בדיקת אולטרסאונד סטרילית מכסה</td></tr><tr><td>תא אינדוקציה בטוח</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA, ארה"ב)</td> <td>EZ-17 85</td><td>מתמר תא אינדוקציה הרדמה</td></tr><tr><td>MX550D</td><td>FUJIFILM VisualSonics ( טורונטו, אונטריו, קנדה)</td><td>n/a</td><td>בדיקת הדמיה Vevo 3100 (25-55 מגה-הרץ, שידור מרכזי: 40 מגה-הרץ)</td></tr><tr><td>טריפאן כחול, תמיסה של 0.4% ב-PBS</td><td>MP Biomedicals (סולון, אוהיו, ארה"ב)</td><td>91691049</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה Vevo 3100</td><td>FUJIFILM VisualSonics (טורונטו, אונטריו, קנדה)</td><td>n/a</td><td>מערכת הדמיית אולטרסאונד</td></tr><tr><td>Vevo 3100 Lab Software</td><td>FUJIFILM VisualSonics (טורונטו, אונטריו, קנדה)</td><td>n/a</td><td>גרסה 3.2.7 להדמיה וניתוח</td></tr><tr><td>מערכת הרדמה כפולה קומפקטית Vevo</td><td>FUJIFILM VisualSonics (טורונטו, אונטריו, קנדה)</td> <td>n/a</td><td>יחידת הרדמה מבוססת איזופלורן שולחנית</td></tr><tr><td>תחנת הדמיה Vevo</td><td>FUJIFILM VisualSonics (טורונטו, אונטריו, קנדה)</td> <td>n/a</td><td>פלטפורמה פרוצדורלית</td></tr></tbody></table>

טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

הזרקה תוך-תימית במודלים של עכברים היא טכניקה חשובה לחקר תפקוד התימיק ומערכת החיסון, כולל הפרעות גנטיות ונרכשות בתאי T. לשם כך נדרשות שיטות לתצהיר ישיר של ריאגנטים ו/או תאים לתוך בלוטת התימוס של עכברים חיים. שיטות מסורתיות של הזרקה תוך תמית כוללות ניתוחי חזה או זריקות עיוורות מלעוריות זעיר פולשניות, שלשתיהן יש מגבלות משמעותיות. מכשירי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד אפשרו הזרקות מלעוריות מונחות תמונה בעכברים, ובכך שיפרו מאוד את דיוק ההזרקה של גישת ההזרקה המלעורית ואפשרו הזרקה של מטרות קטנות יותר. עם זאת, הזרקות מונחות תמונה מסתמכות על שימוש במערכת מסילות משולבת, מה שהופך את זה להליך נוקשה וגוזל זמן. כאן מוצגת שיטה ייחודית, בטוחה ויעילה להזרקות תוך תימיות מלעוריות בעכברים, המבטלת את ההסתמכות על מערכת המסילה להזרקות. הטכניקה מסתמכת על שימוש ביחידת מיקרו-אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי לדמות את בלוטת התימוס של העכבר באופן לא פולשני. באמצעות טכניקת יד חופשית, רדיולוג יכול למקם קצה מחט ישירות לתוך בלוטת התימוס של העכבר בהנחיה סונוגרפית. עכברים מנוקים ומורדמים לפני ההדמיה. עבור רדיולוג מנוסה המיומן בהליכים מונחי אולטרסאונד, תקופת הלמידה של הטכניקה המוצהרת היא קצרה למדי, בדרך כלל תוך פגישה אחת. לשיטה יש שיעור תחלואה ותמותה נמוך לעכברים והיא מהירה בהרבה מהטכניקות הקיימות כיום בסיוע מכני להזרקה מלעורית. היא מאפשרת לחוקר לבצע ביעילות זריקות מלעוריות מדויקות ואמינות של תימוזות בכל גודל (כולל איברים קטנים מאוד כמו תימוס של עכברים זקנים או מדוכאי חיסון) עם לחץ מינימלי על החיה. שיטה זו מאפשרת הזרקת אונות בודדות אם רוצים ומאפשרת ניסויים בקנה מידה גדול בשל האופי החוסך בזמן של ההליך.

היישום המוצלח של טכניקה זו מסתמך על כמה צעדים מרכזיים שיש לעקוב אחריהם. ראשית, יש להבטיח זיהוי אמין של בלוטת התימוס עצמה. בעכברים צעירים, זה פשוט בגלל גודלה הגדול של הבלוטה (איור 3A). בעכברים מבוגרים או בעכברים מדוכאי חיסון, זה יכול להיות מאתגר יותר; עם זאת, זה עדיין אפשרי מאוד עם ציוד אולטרסאונד מודרני (איור 3B,C). שנית, יש חשיבות קריטית לקביעת מסלול המחט כך שהיא תוצג באופן רציף במהלך התקדמות קצה המחט דרך שכבות דופן בית החזה ולתוך בלוטת התימוס....

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך רדיולוגיה התערבותי שנקבע להזרקה תוך-תימית בעכברים כדי למנוע את הסיכון לניתוח פתוח ולשפר את הדיוק של זריקות מלעוריות עיוורות.

Intrathymic injection in mouse models is an important technique for studying thymic and immune function, including genetic and acquired T cell disorders. ...

הפרוטוקול מספק חלופה לא ניתוחית מדויקת, בטוחה ויעילה לשיטות ההזרקה הכירורגיות והעיוורות המסורתיות. זוהי גם טכניקת ההזרקה המדויקת ביותר עבור ניוון תימוזים בעכברים מבוגרים או מדוכאי חיסון. היתרון העיקרי הוא הליך הזרקה מלחיץ מינימלי, בטוח ומדויק מאוד, אך גם מהיר, ובכך מאפשר ניסויים בקנה מידה גדול ללא פגיעה בנתונים כתוצאה מדיכוי חיסוני הקשור ללחץ כירורגי.שמירה על יישור המחט והמתמר תוך כדי התקדמותו דרך דופן בית החזה דורשת תרגול מסוים. לכן אנו ממליצים לשתף פעולה עם רדיולוג התערבותי מנוסה כדי לבצע זריקות או לספק הדרכה. מי שתעזור להדגים את ההליך תהיה שיינה אנונסיו, טכנאית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, להחיל שכבה דקה של קרם depilatory על אזור החזה הקדמי של העכברים במשך פחות מדקה אחת כדי להסיר את הפרווה. השתמשו במגבת נייר רטובה כדי להסיר את הקרם ואת הפרווה הרופפת. אשר את עומק ההרדמה המתאים על ידי חוסר תגובה לצביטת הכפה האחורית.יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. הנח עכבר אחד בכל פעם במצב שכיבה על הפלטפורמה המחוממת של תחנת הדמיית אולטרסאונד של בעלי חיים קטנים עם חרוט האף במקום. הצמידו את העכבר לבמה בעזרת סרט דבק רפואי בגפיים האחוריות והקדמיות.יש לחטא את עור בית החזה העליון ללא פרווה באמצעות אפליקטור כלורהקסידין גלוקונאט. הפעל את הבדיקה הליניארית בתדר הגבוה ביותר הזמינה. בדרך כלל, הבדיקה עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה ביותר עבור גודל החיה המצולמת.הפעל את הבדיקה על ידי הקשה על הלחצן המתאים לאחר מסך ההפעלה. כדי למטב את הגדרות האולטרסאונד להדמיה והזרקה, התאם את עומק שדה הראייה לגודל המתאים לחיית המטרה על ידי התאמת המחוונים המכוונים אנכית בצד ימין של המסך. התאם את רווח קנה המידה האפור על-ידי החלקת הלחצן לאורך הפס האופקי בתחתית המסך.לאחר מכן, התאם את אזור המוקד לרמה הצפויה של בלוטת התימוס. החל על מיליליטר אחד של ג'ל אולטרסאונד על משטח מתמר בזמן שהוא זקוף, או נח במחזיק מכונת אולטרסאונד או בידיו של עוזר. כדי להכין שדה סטרילי קטן ליד הפלטפורמה המחוממת, רוקנו כיסוי בדיקה סטרילי, גומייה, כפפות סטריליות וג'ל אולטרסאונד סטרילי על השדה הסטרילי.לאחר מכן, לבש את הכפפות הסטריליות. מניחים בזהירות את כיסוי הבדיקה הסטרילי מעל מתמר האולטרסאונד והג'ל. כדי לשמור על סטריליות, געו רק בכיסוי הסטרילי.החליקו את הגומייה הסטרילית מעל כיסוי הבדיקה כדי לשמור אותה במקומה. מניחים שניים עד שלושה מיליליטר של ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר. מניחים את הבדיקה בעלת ג'ל האולטרסאונד במאונך על החלק המחוטא של דופן החזה הקדמית של העכבר לצורך הדמיה ראשונית, תוך שמירה על סטריליות.צפה ובצע אופטימיזציה של תמונת האולטרסאונד כפי שהודגם קודם לכן. כדי לסרוק את החזה הקדמי של העכבר במישור רוחבי, החזק את המתמר אנכית והזז אותו למעלה ולמטה מהצוואר אל הבטן בתנועה דמוית מכחול או גורפת. כאשר הלב מרוכז בשדה הראייה, טאטאו את המתמר מעט לכיוון הצוואר.שימו לב לשני המבנים השחורים הזוגיים העגולים משני צדי החזה העליון. באמצעות בדיקת אולטרסאונד, אתר את החלק הרחב ביותר של בלוטת התימוס, שהוא בדרך כלל אתר היעד האידיאלי להזרקה. צפו מסלול מחט אופקי במיקום הנבחר, ושימו לב היכן נמצאים כלי הדם העיקריים באתר זה.יש להימנע מכלי דם אלה במהלך ההזרקה. כלי הדם יהיו מבנים פולסטיים היפואקואיים. אם אינכם בטוחים, הפעילו את מצב דופלר הצבע על ידי הקשה על לחצן הצבע במסך כדי לבדוק אם יש זרימה בתוך כלי הדם.החזיקו את המתמר ביד אחת ומחט אינסולין בעלת 30 מדים עם 10 מיקרוליטרים של הזרקה ביד השנייה. כדי להתחיל בתהליך ההזרקה, הזז את המתמר לרוחב כך שהתימוס יהיה מחוץ למרכז בשדה הראייה של האולטרסאונד. ודא כי הצד השני של שדה הראייה מורכב בעיקר ג'ל אולטרסאונד ולא שום דבר אחר.מניחים את קצה המחט בג'ל שמתחת למתמר, ומזיזים באיטיות את המחט עד שהיא מוצגת בצמוד לפני העור. תוך כדי הדמיה רציפה של המחט תחת אולטרסאונד, הכנס את המחט לבלוטת התימוס עם מסלול מלעורי הרחק מכלי הדם. השתמש במסלול אופקי של בלוטת התימוס כדי למקם את קצה המחט באונה התימית בניגוד לאתר הכניסה.ברגע שקצה המחט נמצא בתוך החלק הרצוי של בלוטת התימוס, הזריקו במהירות את התוכן מהמזרק בעל 30 המדים תוך שימוש בהדמיה סונוגרפית. כדי לייצב את המזרק במהלך החדרת המחט וההזרקה, החזיקו את המזרק בין האגודל לאצבע השלישית, ושלטו בבוכנה של המזרק באמצעות האצבע המורה. הסר את המחט לאחר שכל התוכן הופקד.בעכברים צעירים, זיהוי בלוטת התימוס היה פשוט בשל גודלה הגדול של הבלוטה. זה היה מאתגר יותר בעכברים מבוגרים או מדוכאי חיסון. עם זאת, זה עדיין היה אפשרי מאוד עם ציוד אולטרסאונד מודרני.הזרקה מוצלחת נרשמה כאשר המחט לא חצתה מבנים קריטיים, כגון הלב, אבי העורקים, או אחד הווריד הנבוב הנחות. קצה המחט הודגם במיקום המטרה שלו במהלך ההזרקה, ואישר את התצהיר התוך-תימי. המיקום התוך-תאי של ההזרקה אושר באמצעות לוציפרין כהזרקה לעכברים מהונדסים של לוציפראז.אלה הוערכו באופן מיידי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה, המאשרת את מיקומה הנכון של ההזרקה מבלי להקריב את החיה. לחלופין, טריפאן בלו הוזרק כסמן חזותי של אתר ההזרקה ודיוק ההזרקה באמצעות ex vivo עם נמק. הקבוצה שלנו משתמשת בטכניקה זו במשך מספר מחקרים גדולים, כולל מחקר אימונותרפיה של סרטן, המבוסס על הזרקה של תאי אב מהונדסים גנטית, וכדי לשפר את תפקוד התימיות בעכברים מדוכאי חיסון.

a-minimally-invasive-accurate-efficient-technique-for-intrathymic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מדגים שתי שיטות שונות של הזרקת מאוד: 1) לתוך המוח (intracerebroventricular) ו 2) מערכתית (תוך ורידי) כדי להציג את סוכני טיפולית לתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים הילוד.

מסירה של סוכני טיפולית באמצעות Intracerebroventricular (ICV) ו תוך ורידי (IV) הזרקה של עכברים

במאמר זה נדון כיצד לבסס מודל סרטן שד בעכברות נקבות על ידי הזרקת תאי סרטן השד לתוך כרית שומן החלב. הפרוטוקול לדוגמה מדגים את ההזרקה האורתוטופית.

הזרקה אורתוטופית לפד שומן החלב: ביסוס סרטן השד בעכברות

חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן לשפר מאוד וניתן להפחית מינוני חיסון.

Intralymphatic חיסוני וחיסון בעכברים

דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה ומהירה של נקב מחט intrathecal עבור transfection מקומי של siRNA בחוט השדרה המותני בעכבר תחת הרדמה קצרה אור בר קיימא.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אקו מייצגת שיטה יעילה, אמינה, וניתן למקד עבור המשלוח של סוכני העברת גנים או תאים לתוך הלב העכברי. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

כאן מתוארת גישה פשוטה ומהירה לביצוע הזרקות תוך-מוחיות בעכברים בגישה של יד חופשית (כלומר, ללא מכשיר סטריאוטקסי).

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

זריקות תת-רשתית הן טכניקה הכרחית לפיתוח פרה-קליני של טיפולים למחלות קולטני אור ו-RPE. אנו מתארים טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית אופטימלית בעכברים המשפרת את שיעורי ההצלחה תוך ניתוחיים וממזערת נזק לרשתית.

טכניקת הזרקה תת-רשתית טרנססקלרלית זעיר פולשנית אופטימלית בעכבר

עם העניין הגובר באימונותרפיה תוך-גידולית, בחירת מודלים נגישים ומעשיים היא חיונית. גידולים תת-עוריים קלים לזיהוי אך קשה לדמיין ולמניפולציה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטות ליצירת גידולים תוך-עוריים המספקות נראות ונגישות משופרת.

השתלת גידול תוך-עורי כמודל חזק למחקרי אימונותרפיה תוך-גידולית בסרטן עכברים

למד שיטה זעיר פולשנית להזרקה תוך-תימית בעכברים באמצעות הדרכת אולטרסאונד. הטכניקה מדויקת ובטוחה לתימוסים אטרופיים בעכברים מבוגרים או חסרי חיסון, ומאפשרת ניסויים בקנה מידה גדול ללא דיכאון חיסוני מלחץ ניתוחי.

טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים

גלה סרטונים נוספים