מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

דלקת עצבית היא שחקן מפתח בהפרעות נוירולוגיות שונות. לפיכך, זה עניין רב לחקור ולפתח מודלים חלופיים in vivo neuroinflammation כדי להקל על מחקרים של התפתחות פתולוגית. הטכניקה המתוארת כאן היא כלי מצוין להבנה טובה יותר של שינויים פתולוגיים במוח באמצעות הדמיית in vivo, ולהערכה מהירה ויעילה של תרופות אנטי-דלקתיות אפשריות.

היכונו להזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית באמצעות מושך מיקרופיפטה בהתאם לפרוטוקול חמשת השלבים למשיכת צינור נימי זכוכית. פתח את קצה המחט לגודל המתאים בזווית באמצעות מלקחיים. מלא את המחט עם 0.1 מיליליטר של שמן מינרלי כדי להבטיח כי אין בועות.

הסר את מכסה הבורג של מחט הפלדה של מנגנון המיקרו-הזרקה. יישר את חור מחט הזכוכית עם מחט הפלדה, ולאחר מכן הדק את מכסה ההברגה. הרכב את מנגנון המיקרו-הזרקה של המחט הטעונה במיקרומניפולטור.

התאם את המיקום של מנגנון המיקרו-הזרקה כך שהמיקרומניפולטור יוכל להזיז בגמישות את המנגנון מתחת למיקרוסקופ. לפרוק נפח מתאים של שמן פרפין הדרוש כדי להפוך את מחט הפלדה להיכנס צינור זכוכית נימי. זרוק את תמיסת ההזרקה המורכבת מ- PBS או ליפופוליסכריד על שקופית זכוכית מעוקרת עם 70% אתנול והתאם את מנגנון המיקרו-הזרקה כך שהקצה יוכנס לתוך טיפת הנוזל.

טען כשני מיקרוליטרים של תמיסת הזרקה לתוך המחט. הגדר את המיקרומניפולטור כך שקצה המחט של מנגנון המיקרו-הזרקה נמצא באותו שדה ראייה כמו הזחלים בהגדלה גבוהה. המירו תמיסה של 2% אגרוז במים מזוקקים כפולים באמצעות מיקרוגל.

יוצקים את האגרוז המותך לתוך צלחת פלסטיק. השתמשו בפיפטה להעברת פלסטיק כדי להעביר את הזחלים המורדמים למרכז צלחת פלסטיק מצופה 2% אגרוז. כוון את הזחלים הרכובים עם צד המוח כלפי מעלה לגישה למחט.

התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ כך שמבנה חדר המוח של דגי הזברה יוצג בבירור בשדה הראייה. מניחים את המחט בזהירות מעל טקטום המוח. נקו את אזור המוח עם 70% אתנול ונקבו את עור מוח דגי הזברה עם קצה המחט באיטיות באמצעות המיקרומניפולטור.

לחץ על דוושת הרגל כדי להוציא ננוליטר אחד של 1X PBS או ריכוזים שונים של ליפופוליסכריד. מעבירים את הזחלים למדיום E3 נקי מיד לאחר ההזרקה. לאחר 24 שעות, לאסוף את הזחלים עבור הדמיה מיקרוסקופית, בדיקה התנהגותית קטר, וקביעת אינדיקטורים אחרים.

הכינו תמיסת אגרוז עם 1.5% נמס נמוך במדיום E3 וחממו אותה במיקרוגל ליצירת נוזל צלול. השתמשו בפיפטה נקייה מפלסטיק כדי להעביר את הזחלים למגלשת זכוכית ולהסיר כמה שיותר מים. השתמש פיפטה העברת פלסטיק כדי להוסיף טיפה של 1.5% אגרוז נמס נמוך לזחלים.

השתמש במחט מזרק מיליליטר אחד כדי לכוון את הזחלים. המתן עד שהאגרוז יתקרר ויתמצק לפני שתתחיל בהדמיה. ב 24 שעות לאחר הזרקת חדר המוח lipopolysaccharide, להמשיך עם קביעת סמני ביטוי גנים.

השתמש בשני מזרקים של מיליליטר אחד כדי להפריד את חלקי הראש של הזחלים ללא אזורי העין ושק החלמון. הומוגניזציה של חלק הראש עם 200 מיקרוליטרים של מגיב מיצוי RNA באמצעות מטחנת רקמות ב 11, 000 סיבובים לדקה במשך חמש שניות, ולאחר מכן לבצע מיצוי RNA באמצעות שיטת איזופרופנול כלורופורם. ייבשו באוויר את גלולת הרנ"א במשך 5 עד 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטרים של מים נטולי RNAse כדי להמיס את גלולת ה-RNA.

סנתז cDNA באמצעות תעתיק הפוך עם פריימרים אקראיים כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, בצע PCR בזמן אמת במערכת qPCR באמצעות ערכת RT-qPCR זמינה מסחרית כדי לקבוע את הביטוי של גני המטרה. ב-24 שעות לאחר הזרקת חדר המוח ליפופוליסכריד, מעבירים את זחלי דגי הזברה לבארות של מיקרו-פלטה מרובעת בגודל 96 בארות בנפרד.

הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מדיום E3 לכל באר ולאחר מכן דגרו את הזחלים במשך ארבע שעות כדי להתאקלם לצלחת הבדיקה. העבירו את המיקרו-פלטה הטעונה בזחלים לתיבת המעקב של דגי הזברה. הפעילו את מקור האור והדגירו את הזחלים בתיבת הבדיקה למשך 30 דקות כדי להתאקלם בסביבה.

נטר ותעד את התנהגות דגי הזברה באמצעות מערכת מעקב וידאו אוטומטית. תעדו 12 מפגשים בני חמש דקות כל אחד עבור זחלי דגי זברה בודדים והגדירו את המרחק הכולל כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר טיפול במשך 24 שעות, אחד עד חמישה מיליגרם למיליליטר של הזרקת מוח חדרית ליפופוליסכריד גרם לאובדן משמעותי של נוירוני RA במוחם של TgEtvmat2:GFP זחל דג זברה בהשוואה לקבוצות הביקורת והבושה.

הקו המהונדס elavl3:mCherry zebrafish הדגים שינויים משמעותיים בצפיפות המשולבת הפלואורסצנטית של נוירונים במוח הזחל כאשר הוזרקו להם 2.5 עד 5 מיליגרם למיליליטר ליפופוליסכריד, בעוד שהזרקת מיליגרם אחד למיליליטר ליפופוליסכריד לא הראתה השפעה. יתר על כן, חמישה מיליגרם למיליליטר ליפופוליסכריד גרם למחסור בתנועה והפחית את המרחק הכולל של תנועת דגי הזברה במשך 60 דקות מעקב. ייצור תחמוצת החנקן וביטוי ה-mRNA של ציטוקינים מעודדי דלקת בראשם של זחלי דגי זברה הוגברו בטיפול של 2.5 עד 5 מיליגרם לליפופוליסכריד מיליליטר בהשוואה לביטוי בקבוצות הביקורת והבושה.

הזרקה של אחד עד חמישה מיליגרם לליפופוליסכריד מיליליטר הדגימה את גיוס הנויטרופילים למוח של דגי הזברה, וכתוצאה מכך עלייה משמעותית במספר הנויטרופילים באזור המוח של דגי הזברה Tgmpo:eGFP. גודל הפתיחה של המחטים וכמות כוח ההזרקה למיקרו הזרקה יחד עם הפרדת הראש מהעיניים והגוף של דגי הזברה חיוניים להליך זה.