מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

ניתן להשתמש במערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על-ידי ננו-ברים כדי לחקור את התפקיד של עקמומיות הממברנה בוויסות הדינמיקה וההתפלגות של חלבונים ושומנים במהלך פעילות התא. טכניקה זו מציעה גם תת-שורש גבוה וגם רע ביצירת עקמומיות הממברנה על ידי יצירת דו-שכבת שומנים רציפה על שגיאות ננו-מוטות פטנט עם עקמומיות ממברנה המוגדרת מראש על ידי ננו-פבריקציה ברזולוציה גבוהה. כדי להתחיל, מניחים את שבב הננו בכוס של 10 מיליליטר כשצד התבנית פונה כלפי מעלה.

הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של 98% חומצה גופרתית לכוס וודאו שהחומצה מכסה באופן מלא את הצד הקדמי והאחורי של השבב. סובבו באיטיות את הכוס והוסיפו 200 מיקרוליטרים של 30% מי חמצן טיפה אחר טיפה עד שכל הכוס מתחממת. ודא כי חומצה גופרתית ומי חמצן מעורבבים היטב כדי ליצור תמיסת פיראנה להסרת מולקולות אורגניות מן שבב ננו.

הניחו את הכוס במיכל זכוכית משני ושמרו על שבב הננו שקוע בתמיסת הפיראנה למשך הלילה כדי לנקות את הלכלוך ביסודיות. הוציאו את הכוס והעבירו בזהירות את תמיסת הפיראנה למיכל פסולת חומצה. טען חמישה מיליליטר של מים שעברו דה-יוניזציה לתוך הכוס כדי לדלל את שארית החומצה ולהשליך אותה לפסולת החומצה.

חזור על שלב זה חמש פעמים. קח את השבב עם פינצטה ושטוף עם זרם מתמשך של מים deionized כדי להסיר חומצה שיורית ביסודיות. יש לייבש את השבב עם גז חנקן 99.9% להיווצרות SLB.

סוניקו את תערובת השומנים למשך 30 דקות. מקפיאים את תערובת השומנים בחנקן נוזלי למשך 20 שניות ואז מפשירים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות באמבט מים. חזרו על מחזורי ההקפאה/הפשרה 30 פעמים.

לאחר מכן, תערובת השומנים נראית כמו נוזל צלול. מעבירים את תערובת השומנים דרך המיני אקסטרודר ומוציאים קדימה ואחורה 20 פעמים. לאסוף את רכבי השטח מן המזרק בצד השני כדי להפחית את הזיהום עם חלקיקים גדולים יותר או חומר זר, ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

מוציאים בזהירות את שבב הננו המנוקה ממים שעברו דה-יוניזציה בעזרת זוג פינצטות ומייבשים אותו עם 99.9% גז חנקן. בצע ניקוי פני השטח של שבב הננו עם טיפול פלזמה אוויר במשך שעה אחת. הרכיבו את שבב הננו בתא PDMS.

התחל עם הנחת השבב על משטח נקי כאשר התבנית פונה כלפי מעלה. כסו בעדינות את ה-PDMS האמצעי עם השבב וודאו שכל התבנית חשופה לאזור המרכזי של הפתח הגדול בצורת אליפסה ב-PDMS האמצעי. כסו את ה-PDMS העליון ב-PDMS האמצעי ושמרו על שני החורים הקטנים שלו באזור החור הסגלגל הגדול של ה-PDMS האמצעי.

לאחר מכן, תא PDMS הוא התאספו. טען את רכבי השטח לתעלת PDMS מאחד משני החורים הקטנים ב- PDMS העליון עם פיפטה ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את ה- SLB. הכניסו בעדינות את מאגר ה-PBS לתעלת ה-PDMS מצד אחד של החור הקטן והוציאו את הפסולת עם ניצן כותנה מהחור השני כדי לשטוף את רכבי השטח הלא מאוגדים.

לאחר מכן לרכוש את SLB שנוצר על שבב ננו. הגדר את המיקרוסקופיה הקונפוקלית לסריקת לייזר באמצעות מטרה של 100 x שמן. פתח את תוכנת הזן כדי לבחור את עוצמת לייזר העירור שיכולה לעורר את הפלואורסצנטיות של השומנים והחלבון.

בחר מצב רכישה. לאחר מכן לחץ על הגדרה חכמה, ואחריו טקסס אדום. כוונן את המיקוד באמצעות ידית המיקוד כדי לאתר את פסי הננו על השבב עד שקצוות מוטות הננו יהיו חדים מתחת לתעלת השומנים.

הגדר את פרמטרי הסריקה כדי לקבל תמונת בקרה של תעלת השומנים לפני הוספת חלבון. בצע את בדיקת FRAP על ידי הלבנה עם דו-שכבת שומנים המסומנים בפלואורסצנט על אזור אקראי של ננו-בר יחיד. בחר בתיבות הסימון אזורי ניסוי והלבנה.

ציירו שטח מעגלי בקוטר של חמישה מיקרומטרים שיכול לכלול את כל הננו-מוט במרכז, והוסיפו לאזורי הניסוי. פרמטרי הדמיה של קלט TimeLapse. בחר סדרות זמן.

לאחר מכן לחצו על 'משך'. בחר 100 מחזורים ומרווח שווה לשתי שניות. פרמטרי הלבנת קלט.

בחר את תיבות הסימון של הלייזר המבצעות FRAP ושנה את צריכת החשמל ל- 100%לחץ על התחל ניסוי עבור ניסוי FRAP. יש לטעון את תמיסת החלבון לתעלת ה-PDMS ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את קשירת החלבון ב-SLB. מקד מחדש את הננו-ברים והגדר את פרמטרי הסריקה כדי לצלם תמונות של תעלות השומנים והחלבונים לצורך זיהוי חישת עקמומיות חלבונים.

בחר אזורי ניסוי ובצע את בדיקת FRAP הן בתעלות השומנים והן בתעלות החלבון, ובצע הדמיית TimeLapse כדי לאפיין את הניידות של חלבון חישת עקמומיות. שניהם מראים הצטברות מוגברת בקצה של ננו-מוטות בודדים מצופים SLB ברוחב 300 ננומטר. כאן SLB מכיל 10% PS כדי לשפר באופן אלקטרוסטטי את קשירת החלבון.

לשני החלבונים יש יחס קצה למרכז גבוה יותר מאשר שומנים, שהוא בערך אחד. כאשר משווים את IDR FBP17 ו- F-Bar, יחס הקצה למרכז הגבוה יותר של IDR FBP17 מצביע על חישת עקמומיות חזקה יותר מאשר F-Bar. כל שלושת החלבונים הראו הצטברות מועדפת באתרי הממברנה המעוקלים בקצה הננו-בר כאשר העקמומיות ירדה מתחת לקוטר של 400 ננומטר.

מבין שלושת תחומי החלבון הללו, IDR FBP17 נותן את פס הננו והצפיפות הגבוהים ביותר, מה שמעיד על יכולת חישת העקמומיות החזקה ביותר שלו, בעוד ש-F-Bar מציג את הערך הנמוך ביותר. ניתן לשרטט את עקומת קשירת החלבון על ידי הגדלה הדרגתית של ריכוז החלבון, מה שמראה כי ל-IDR FBP17 יש יכולת חישת עקמומיות שיתופית חזקה. בהשוואה להתאוששות המהירה של אותות השומנים על ננו-מוטות, ה-F-Bar אינו יכול להתאושש תוך שתי דקות, מה שמרמז על ירידה משמעותית בניידות הממברנה ובדינמיקת האסוציאציה שלו באתרי הממברנה המעוקלים.

באופן מפתיע, שונה מההתנהגות של F-Bar, אותות IDR FBP17 הראו התאוששות ברורה באותה מסגרת זמן, מה שמעיד על האופי הדינמי של IDR FBP17 שהצטבר בממברנות המעוגלות. עם זאת, לאחר שטיפת IDR FBP17 הלא מאוגד בתמיסה, לא ניתן היה לראות את אותה התאוששות בערוץ IDR FBP17 כמו קודם. איכות SLB חשובה מאוד כאשר חוקרים את האינטראקציה בין ממברנה מעוקלת לחלבון.

לכן בדיקת FRAP נחוצה בניסוי שלנו כדי לאמת את ניידות הממברנה. מערכת זו תסייע לחוקרים לחקור פרמטרים שונים המשפיעים על אינטראקציית החלבון עם הממברנה המעוקלת, כגון תחומי חישת העקמומיות, והרכב השומנים, וכן לערוך את המחקרים הדינמיים על ממברנה מעוקלת כגון התנהגויות הפרדת פנים.