זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית
6 באוקטובר 2022
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.
שיטה זו מציעה דרך להגביר את האות מאירועי קשירה לצורה הניתנת לזיהוי חזותי לשימוש דל במשאבים או שניתן לכמת באמצעות מכשור מבוסס ספיגה. זהו פרוטוקול מהיר יחסית, חד פעמי, כדי לקבוע את נוכחות המטרה של האפתמר במדגם של עניין. ניתן להשוות את התוצאות מול עקומת כיול סטנדרטית אם רוצים לכמת.
אנשים חייבים להיות מדויקים מאוד בעת העברת וערבוב הפתרונות, כמו ערבוב מספיק יוביל לתוצאות שליליות. כמו כן, ודא ריאגנטים ותמיסות נשמרים מקוררים עד לשימוש כדי למזער את אות הרקע. התחל על ידי הפעלת מוצרי מחשוף ריבוזימים על ידי הוספת חמש יחידות של קינאז פולינוקלאוטיד T4 בצינור PCR.
לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של חיץ ריבוזימי 5X מוכן מראש לכל צינור דגימה. כדי להדגים באופן חזותי ספציפיות, הוסף 1.5 מיקרוליטר של שני מילימולרים תאופילין או שני מילימולרי קפאין לכל מבחנה כדגימות הבדיקה וערבב כל דגימה ביסודיות על ידי פיפטינג חמש עד 10 פעמים. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של 600 ננו-מולרי RNA המכיל תחום aptameric ספציפי למטרה לכל צינור דגימה, ולאחר מכן pipetting כדי לערבב את הרכיבים במהירות.
כעת, הניחו את הצינור על בלוק קר כדי למזער את אות הרקע. לאחר הכנת כל צינורות התגובה, דוגרים על כל דגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות בדיוק. בתום הדגירה, החזירו מיד את מבחנות הדגימה לקרח.
הוסיפו 3.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימי ניקזה פולימראז לכל צינור דגימה וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסף 31.5 מיקרוליטר של תערובת תגובת EXPAR המכילה נוקלאוטידים של תבנית ומאגר תגובה לכל צינור דגימה וערבב על ידי פיפטינג. לאחר הכנת כל הדגימות, יש לדגור על הדגימה המוכנה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות באמצעות טיימר.
מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח לאחר הדגירה. הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת hemin לכל צינור דגימה לפיתוח צבע וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף 58 מיקרוליטר של פתרון TMB הזמין מסחרית לכל צינור דגימה, לערבב היטב, ולדגור לפיתוח צבע.
קרא את הדגימות באופן איכותי בעין או כמת את התוצאות באמצעות קורא לוחות ספיגה, כמתואר בכתב היד. המבנה הממוטב יכול לזהות רק 500 ננו-מולרית תאופילין תוך 30 דקות. תכשירי דגימה הנחשפים למטרה מייצרים צבע כחול, בעוד דגימות שאינן מכילות מטרה נותרות חסרות צבע.
עקומה סטנדרטית הוכנה מהאות שנמדד ב-A450 לאחר 30 דקות של פיתוח צבע. חשוב לשמור דגימות על קרח כאשר לא מבצעים דגירה, שכן אפילו הרנ"א האופטימלי עדיין יציג רמת פעילות רקע נמוכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים בדיקת הגברה אקספוננציאלית מהירה בת 3 שלבים המבוססת על אפטמרים, לזיהוי מטרות כגון theophylline. הוא מכסה את הכנת הדגימות, הגברת האות ופיתוח הצבע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- אפטמרים הם מולקולות קצרות של RNA או DNA בעלות גדיל אחד, המסוגלות להיקשר למטרות ספציפיות.
- הגברת אות היא קריטית לגילוי מטרות בריכוזים נמוכים.
- שיטות גילוי חזותיות עשויות להועיל בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- טיפול מדויק בריאגנטים חיוני לקבלת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה לזיהוי תאופילין אל מול קפאין.
- אספקת פרוטוקול "סיר אחד" (one-pot) להגברת אות.
- מתן אפשרות לכימות התוצאות באמצעות עקומת כיול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלה של תוצרי חיתוך של ריבוזים באמצעות T4 polynucleotide kinase.
- זיהוי חזותי של אירועי קישור.
- כימות באמצעות מכשור המבוסס על בליעה (absorbance).
- ערבוב וקירור קפדניים של ריאגנטים להפחתת רעש הרקע.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת זיהוי של theophylline בדגימות.
- ניתן לפרש את התוצאות באופן חזותי או לכמת אותן.
- דיוק בטיפול בתמיסות הוא קריטי להשגת תוצאות מוצלחות.
- ניתן לצמצם אותות רקע באמצעות ניהול נכון של הריאגנטים.
מסקנות
- הבדיקה מבוססת האפטמר היא שיטה מהירה ויעילה לזיהוי המטרה.
- ניתן להתאימה ליישומים שונים בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון מטרות נוספות ואופטימיזציה של הפרוטוקול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות זיהוי מבוססות אפטמר עם הגברה מעריכית איזותרמית מספקות תוצאות מהירות, רגישות וניתנות לפירוש חזותי לצורך תיקוף מטרה בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם. פרוטוקול הגברה זה של G-quadruplex בשלושה שלבים מאפשר קריאות איכותניות וכמותיות כאחד, ובכך תומך בקבלת החלטות מוצקה בנקודות המפנה של פיתוח ובדיקת המערך. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) וספציפיות, ובכך משפיעה ישירות על מיון הפורטפוליו ומוכנות הבדיקות בהמשך התהליך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של אירועי זיהוי מולקולרי באמצעות ספציפיות של אפטמרים.
- תומך בתיקוף תפקודי של קישור למטרה באמצעות פלטים הניתנים לזיהוי חזותי.
- מסייע בהערכה מהירה של מעורבות המטרה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- משפר את הביטחון בסלקטיביות של המטרה על ידי הבחנה בין אנליטים בעלי קשר קרוב.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק פרוטוקול סטנדרטי בשיטת one-pot להקמה רפרודוקבילית של הבדיקה.
- מספק פלטים כמותיים באמצעות מדידת בליעה להערכה מהימנה של תרכובות.
- מאפשר סריקה מהירה של דגימות עם דרישות מינימליות לציוד.
- תומך בכימות המבוסס על עקומת כיול לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מציע פוטנציאל להתאמה לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה כאשר הוא נתמך על ידי תכנון אפטמרים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות פורמטים של זיהוי הניתנים להרחבה.
- מפחית את הסיכון לתוצאות חיוביות שגויות על ידי מזעור אות הרקע באמצעות פרוטוקולים מותאמים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
מערכת aptamer-EXPAR זו משתלבת ברצף שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המולקולה המובילה, ומספקת גשר מזיהוי מולקולרי לפיתוח בדיקה כמותית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי אישור נוכחות המטרה וספציפיות.
- סריקה: מספק פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור, המתאימים למסגרות של סריקה רחבה או למסגרות עם משאבים מוגבלים.
- אנליזה: מאפשר מדידה מבוססת בליעה ויצירת עקומת סטנדרט לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: ניתן להתאימו לזיהוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) אם נקבעה ספציפיות לאפטמר.
- שימוש חוזר ארגוני: המודולריות של הפרוטוקול מאפשרת התאמה למטרות חדשות על ידי החלפת דומייני האפטמר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה באמצעות פרוטוקול מהיר, סטנדרטי וניתן להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשכה או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ופיתוח בדיקות יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתוני זיהוי כמותיים חסונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון אפטמרים וטיפול בחומצות גרעין.
- נדרשת גישה למכשור בסיסי של ביולוגיה מולקולרית וקוראי פלטות לספיגות לצורך כימות.
- דורש טיפול מדויק בריאגנטים ובקרת טמפרטורה כדי למזער את אות הרקע.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למטרות שונות על ידי שינוי הדומיין האפטמרי.
- נדרשת אופטימיזציה קפדנית כדי להבטיח ספציפיות ולמזער תוצאות חיוביות שגויות.
