6 באוקטובר 2022
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.
שיטה זו מציעה דרך להגביר את האות מאירועי קשירה לצורה הניתנת לזיהוי חזותי לשימוש דל במשאבים או שניתן לכמת באמצעות מכשור מבוסס ספיגה. זהו פרוטוקול מהיר יחסית, חד פעמי, כדי לקבוע את נוכחות המטרה של האפתמר במדגם של עניין. ניתן להשוות את התוצאות מול עקומת כיול סטנדרטית אם רוצים לכמת.
אנשים חייבים להיות מדויקים מאוד בעת העברת וערבוב הפתרונות, כמו ערבוב מספיק יוביל לתוצאות שליליות. כמו כן, ודא ריאגנטים ותמיסות נשמרים מקוררים עד לשימוש כדי למזער את אות הרקע. התחל על ידי הפעלת מוצרי מחשוף ריבוזימים על ידי הוספת חמש יחידות של קינאז פולינוקלאוטיד T4 בצינור PCR.
לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של חיץ ריבוזימי 5X מוכן מראש לכל צינור דגימה. כדי להדגים באופן חזותי ספציפיות, הוסף 1.5 מיקרוליטר של שני מילימולרים תאופילין או שני מילימולרי קפאין לכל מבחנה כדגימות הבדיקה וערבב כל דגימה ביסודיות על ידי פיפטינג חמש עד 10 פעמים. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של 600 ננו-מולרי RNA המכיל תחום aptameric ספציפי למטרה לכל צינור דגימה, ולאחר מכן pipetting כדי לערבב את הרכיבים במהירות.
כעת, הניחו את הצינור על בלוק קר כדי למזער את אות הרקע. לאחר הכנת כל צינורות התגובה, דוגרים על כל דגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות בדיוק. בתום הדגירה, החזירו מיד את מבחנות הדגימה לקרח.
הוסיפו 3.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימי ניקזה פולימראז לכל צינור דגימה וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסף 31.5 מיקרוליטר של תערובת תגובת EXPAR המכילה נוקלאוטידים של תבנית ומאגר תגובה לכל צינור דגימה וערבב על ידי פיפטינג. לאחר הכנת כל הדגימות, יש לדגור על הדגימה המוכנה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות באמצעות טיימר.
מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח לאחר הדגירה. הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת hemin לכל צינור דגימה לפיתוח צבע וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף 58 מיקרוליטר של פתרון TMB הזמין מסחרית לכל צינור דגימה, לערבב היטב, ולדגור לפיתוח צבע.
קרא את הדגימות באופן איכותי בעין או כמת את התוצאות באמצעות קורא לוחות ספיגה, כמתואר בכתב היד. המבנה הממוטב יכול לזהות רק 500 ננו-מולרית תאופילין תוך 30 דקות. תכשירי דגימה הנחשפים למטרה מייצרים צבע כחול, בעוד דגימות שאינן מכילות מטרה נותרות חסרות צבע.
עקומה סטנדרטית הוכנה מהאות שנמדד ב-A450 לאחר 30 דקות של פיתוח צבע. חשוב לשמור דגימות על קרח כאשר לא מבצעים דגירה, שכן אפילו הרנ"א האופטימלי עדיין יציג רמת פעילות רקע נמוכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
פרוטוקול זה מדגים מבחן האצה אקספוננציאלי מהיר בן 3 שלבים המבוסס על אפטמר לזיהוי מטרות כמו תיאופילין. הוא מכסה הכנת דגימה, האצת אות והתפתחות צבע.
Aptamer-based detection systems with isothermal exponential amplification offer rapid, sensitive, and visually interpretable outputs for target validation in early discovery workflows. This three-stage G-quadruplex amplification protocol enables both qualitative and quantitative readouts, supporting robust decision-making at the assay development and screening inflection points. The approach enhances predictive confidence for target engagement and specificity, directly impacting portfolio triage and downstream assay readiness.
This aptamer-EXPAR system fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge from molecular recognition to quantitative assay development.