Name: כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: למדו פרוטוקול לכימות וניתוח תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטה משפרת את תפוקת השחזור של תאי B ומפחיתה שונות בדגימות לב, וניתן להתאימה לאיברים נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקי NHLBI 5K08HLO145108-03 ו- 1R01HL160716-01 שהוענקו ללואיג'י אדמו.
ציטומטר זרימת אורורה ששימש לפיתוח מחקר זה מומן על ידי NIH Grant S10OD026859. אנו מכירים בתמיכתה של ליבת הציטומטריה של זרימת JHU Ross.

כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו באישור IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. הכנות
<ol><li>הכן את מאגר FACS, כמתואר בטבלה 1.</li>
	<li>ודא שיש מספיק CO2 כדי להרדים את בעלי החיים.</li>
	<li>הכינו את חלל הנתיחה (הניחו את משטח הספסל והניחו את כלי הקלטת והדיסקציה בקרבת מקום).</li>
	<li>תייג את הצינורות של 15 מ"ל, שים 3 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום בכל צינור (ראה טבלת חומרים) והנח אותם על קרח (צינור אחד לכל לב וצינור נוסף לקבוצת הפניה/בקרת ציטומטריה של זרימה). כמו כן, מלאו את צלחות הפטרי הקטנות (35 מ"מ) ב-HBSS.</li>
	<li>הפעל את השייקר מבוקר הטמפרטורה, הגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס, וצנן מראש את הצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו את משאבת המזרק והגדירו את קצב הזרימה ל-3 מ"ל/דקה. מלאו מזרק של 20 מ"ל ב-HBSS, הגדילו את קו הצינור במאגר והסירו את כל הבועות.</li>
</ol>2. מכתים תוך-וסקולריים של תאי B (in vivo)
<ol><li>שקלו עכבר זכר בן 12 שבועות מזן C57BL/6J. העמיסו מזרק אינסולין בנפח 3/10 סמ"ק עם 100 מיקרון של דילול הנוגדן B220 (1:10, ב-PBS). מכסים את המזרק ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור.</li>
	<li>הרדמה של עכבר אחד.<ol><li>החל הזרקה intraperitoneal של 2% 2,2,2-tribromoethanol עם מינון של 400 מ"ג / ק"ג ולחכות 10-20 דקות. הערה: עקוב אחר הנשימה והתנועה של העכבר. ברגע שהעכבר מפסיק לזוז, לעורר כאב על ידי צביטה של הבוהן; היעדר רפלקס נסיגה מצביע על הרדמה נאותה.</li>
		<li>אם לא הושגה הרדמה מספקת במהלך 20 דקות, ניתן לתת מנה נוספת של חומר הרדמה במינון של 100 מ"ג/ק"ג, ויש לבצע הערכה של קינטיקה של עכברים, רפלקס גמילה ונשימה כל 5 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>הניחו את העכבר על ספסל המעבדה על משטח ספסל המוטה לכיוון צד אחד, משכו בעדינות את עור הגב, ולחצו מעט את הגוף על הספסל כדי לגרום לעין לבלוט.</li>
	<li>הזריקו את הנוגדן המדולל B220 משלב 2.1 על ידי הזרקה רטרואורביטלית.<ol><li>הכניסו את המזרק לעין בזווית של 45° מהמישור הסגיטלי של ראש העכבר. לאט לאט להזריק את הפתרון. אם מורגשת התנגדות, הסר את המזרק והזן שוב. המתן 2 דקות. הערה: זמן הדגירה הממושך יסכן את היכולת להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת חוץ-וסקולריים, שכן הוא ייתן זמן לנוגדן המוזרק להתפזר מחוץ לכלי הדם.</li>
	</ol></li>
	<li>להרדים את העכבר בהתאם לתקנות IACUC.<ol><li>פתח את זרימת CO2 לתא המתת החסד בקצב של 0.5 ליטר לדקה, או את קצב הזרימה המומלץ בהתבסס על גודל התא שלך.</li>
		<li>הניחו את העכבר בתא לזמן המומלץ, וודאו שהוא כבר לא נושם. הסר אותו ולבצע פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית של המתת חסד.</li>
		<li>לאחר שהעכבר מורדם, המשך מיד לקצירת איברים וזליפה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. אוסף לב
<ol><li>פתח חזה.<ol><li>החזק את העור של העכבר עם מלקחיים באזור epigastric. צרו פתח בקוטר 2 מ"מ בעור באמצעות מספריים והשתמשו במלקחיים כדי לקלף את העור ולחשוף את שכבת החיתולית, שכבה שקופה ומבריקה, של החזה והבטן. חותכים באפיגסטריום דרך החיתולית והצפק כדי לפתוח את דופן הבטן ולחשוף את התהליך הקסיפואידי. מהדק את תהליך xiphoid באמצעות מלקחיים hemostatic.</li>
		<li>בעזרת המספריים, בצעו חתך אנכי דרך דופן בית החזה בגובה קו אמצע העצם בכל צד והרימו את דופן בית החזה הקדמית כדי לחשוף את תכולת המדיאסטינום, תוך שימוש במלקחיים המוסטטיים כמשקולת לשמירה על הפתח.</li>
	</ol></li>
	<li>זילוף לב ומיצוי.<ol><li>באמצעות מלקחיים, להסיר כל רקמת שומן או thymic סביב הלב.</li>
		<li>החזיקו את אבי העורקים היטב מאחור באמצעות מלקחיים. מכניסים את מחט המזרק (25 גרם) לתוך קצה הלב. עם 3 מ"ל של HBSS בקצב של 3 מ"ל לדקה. הערה: עקוב אחר ההזלפה. הכבד צריך למלא, ודם בכלי הדם הכליליים צריך להיות מוסר לחלוטין. מומלץ להשתמש במשאבת מזרק מכוילת ל-1 מ"ל/דקה כדי לשמור על זרימה יציבה.</li>
		<li>חותכים את אבי העורקים באמצעות מספריים ומוציאים את הלב. לשטוף את הלב בצלחת פטרי עם HBSS כדי להסיר את כל הדם שנותר. באמצעות מספריים ומלקחיים, להסיר את השומן, רקמת החיבור ואת בלוטת התימוס, ולייבש את הלב. שקלו את הלב המבודד ושימו לב למשקל במיליגרמים. טחנו את הלב בטמפרטורת החדר לחתיכות קטנות (1-2 מ"מ) בעזרת להב. הערה: לבבות עכברים בוגרים עשויים לשקול בין 0.090-0.210 מ"ג.</li>
		<li>מדוד את המסה של רקמת הלב והניח 60 מ"ג של הלב הטחון כדי להתעכל בצינור 15 מ"ל עם 3 מ"ל של HBSS. שמור על רקמת הלב הנותרת והניח בצינור שכותרתו "רקמת בקרת ייחוס"; זה ישמש לבקרת פיצויים עבור אות מת-חי ו- autofluorescence.</li>
	</ol></li>
</ol>4. עיכול לב וכתמי תאים
<ol><li>הוסיפו אנזימים לכל צינור המכיל רקמה טחונה (ראו טבלה 1). הוסיפו 0.5 μL/מ"ג של DNase 1 (300 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב), 0.5 μL/מ"ג של קולגןאז II (625 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב), ו-0.2 μL/mg של היאלורונידאז (50 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב) לצינור.</li>
	<li>מניחים את תגובת העיכול בשייקר למשך 30 דקות ב-300 סל"ד. כוונן את מתלה השייקר לכ-25° של שיפוע.</li>
	<li>הוסף 7 מ"ל של HBSS לכל אחד מצינורות התגובה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 250 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם תאוצה ושבירה מוגדרות למתון או איטי. יש לנטרל את ה-supernatant ולהשהות כל כדור ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס ACK כדי להסיר תאי דם אדומים. דגירה בחיץ תזה ACK במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסיפו 10 מ"ל של PBS לכל צינור, ערבבו ולאחר מכן סננו לצינור של 50 מ"ל עם מסננת של 40 מיקרומטר. ודא שכל הלכלוך נמצא בתוך תא המסנן. יש לרסק כל פסולת על המסנן באמצעות בוכנה של מזרק עד שהוא תלוי לחלוטין בתוך תא המסנן.</li>
	<li>הוסף PBS דרך המסנן עד נפח מגיע 25 מ"ל לכל לב; פעולה זו תאפשר לתאים המושעים לעבור דרך המסנן. הוסף 25 מ"ל נוספים של PBS לצינור רקמת בקרת הייחוס וחלק את הנפח לצינורות שונים (25 מ"ל כל אחד). תייג את אחד הצינורות "Unstained" ואת השני כמו "לחיות מת". צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה, הכינו את הדילול לכתם החי-מת (דילול: 1:500 ב-PBS אחד).</li>
	<li>דקאנט את הסופר-נטנט, השהה את הכדור בצינור Unstained ב-100 μL של PBS וכל אחד מהכדורים האחרים ב-100 μL של דילול הכתם החי-מת. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך, מכסה את דלי הקרח עם רדיד אלומיניום.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר FACS לכל דגימה והעבר אותו לצינור FACS עם תווית דרך מסנן של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה צינורות FACS ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 °C. השליכו את הסופר-נטנט. השהה את הכדור ב-500 μL של מאגר FACS.</li>
	<li>הוסף 50 μL של תמיסת חסימת Fc (ראה טבלה 1) לכל צינור, למעט צינורות לא מוכתמים ומתים חיים. מערבבים ודוגרים במשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסיפו תמיסת תערובת נוגדנים של 50 μL (ראו טבלה 1) לכל צינור, למעט הצינורות Unstained ו-Live-dead, ודגרו במשך 30 דקות בחושך, תוך כיסוי דלי הקרח ברדיד אלומיניום.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את ה-supernatant והשעה מחדש ב-300-500 μL של מאגר FACS.</li>
</ol>5. ציטומטריה של זרימה
<ol><li>הגדרות בקרת מכשירים. הערה: בפרוטוקול זה הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטר זרימה של 4 לייזרים Cytek Aurora. עוד ציטומטר זרימה מתאים יכול לשמש כדי לזהות את סמני העניין.<ol><li>פתח את תוכנת בקרת המכשירים (ראה טבלת חומרים). בחלק העליון של החלון, בחר את הכרטיסייה רכישה ולחץ על חדש +. יוצג חלון בשם ' צור ניסוי חדש' .</li>
		<li>במקטע ספריה, בשדה סוג לסינון, הקלד PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 ו- Zombie Aqua, לחיצה על הוסף לאחר הקלדת כל אחד מהם. יש לראות את שמות הפלואורופור מימין. לאחר מכן לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסיה קבוצה .</li>
		<li>בכרטיסיה קבוצה , לחץ על הסמל עם צינור כדי להוסיף את הלב לניתוח.</li>
		<li>לחץ על הקבוצה + הפניה וחלון יוצג. בעמודת התג הפלואורסצנטי בחר Zombie Aqua, ובעמודת סוג הבקרה בחר תאים ולאחר מכן לחץ על שמור.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסייה הבא > סמנים ; תוצג טבלה עם שמות הפלואורופורים. הקלד את סמן התא המתאים בשורה הראשונה של כל עמודת פלואורופור והקלד Enter: CD45 עבור PerCP-Cy5.5; CD19 עבור BV421; CD11b עבור אלקסה פלואור 700; B220 עבור PE; וחיים מתים עבור זומבי אקווה.</li>
		<li>לחץ על הבא פעמיים כדי לעבור לכרטיסיה רכישה . ב'אירועים לתיעוד' של קבוצת הניסוי, הקלד 10,000,000, ובאותו שדה עבור קבוצת הייחוס סוג שורה 200,000. לחץ על שמור ופתח. ההגדרות האחרות צריכות להישאר כברירת מחדל, זמן עצירה ל- 10,000 והפסקת עוצמת קול ל- 3,000.</li>
		<li>בפינה השמאלית התחתונה לחץ על בקרת מכשירים. הגדר מתח ל- FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. לאחר מכן, בחר את פקד הרכישה. עבור האפשרות קצב זרימה , בחר גבוה מהתפריט הנפתח.</li>
	</ol></li>
	<li>רכוש דוגמאות ייחוס עם ציטומטר ובטל את המיקס בתוכנה.<ol><li>מערבבים את צינור הלב הלא מוכתם ומניחים אותו בבטחה על יציאת הזרקת הדגימה (SIP). ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדוגמה הנכונה ולאחר מכן לחץ על התחל בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו. עשו את אותו הדבר עבור רקמת הלב המוכתמת ב-Live-dead.</li>
		<li>בחר בתפריט Unmix והגדר את הפקדים הבאים:<ol><li>בחר את תיבות הסימון עבור PE, PerCP-Cy5.5, BV421 ו- Alexa Fluor 700 בעמודה מהספרייה. ודא ש-Zombie Aqua אינו מסומן באותה עמודה. בחלק התחתון, בדוק את האפשרות של Autofluorescence כתג פלואורסצנטי.</li>
			<li>לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה זיהוי אוכלוסיות חיוביות/שליליות . בכרטיסייה זו תוצג עלילה של FSC-A לעומת SSC-B-A. לחץ וגרור את נקודות המצולע כדי לבחור אזור בין 1.0 M ל- 4.0 M בציר FSC-A, ובין 0.2 M ל- 3.0 M בציר SSC-B-A.</li>
			<li>בחלקה הבאה מימין, V5-A יוצג על ציר X. הזז את השערים כדי לבחור מחצית מהפסגה בקצה הימני כחיובי ואזור בצד שמאל של העלילה כשלילי. בעלילה שכותרתה קבוצת ייחוס - לא מוכתמת, בחר אוכלוסייה בטווח דומה. לשם כך אין צורך להגדיר את השלילי החיובי-שלילי.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>לרכוש דגימות ניסיוניות.<ol><li>עבור כל צינור המכיל דגימה לעכבר בודד, מערבלים את הצינור ומניחים אותו בבטחה על ה- SIP. ודא שחץ החיווי הירוק מצביע על הדגימה הנכונה, ולאחר מכן לחץ על התחל בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו.</li>
	</ol></li>
	<li>אסטרטגיית גיטינג.<ol><li>בחר את הכרטיסיה ברירת מחדל לגליון עבודה לא מעורבב . צור מתווה FSC-A לעומת SSC-A באמצעות הכלי 'התוויית נקודה' למעלה. בחר אירועים גבוהים מ- 0.4 M בציר FSC-A וגבוהים מ- 0.8 M בציר SSC-A באמצעות כלי הבחירה מצולע. לחץ פעמיים בבחירה זו ותוצג עלילה חדשה.</li>
		<li>מתוך העלילה החדשה שנוצרה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר X ובחר AF-A; לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר Y ובחר כתם חי מת. לחץ על כלי בחירת המלבן למעלה ובחר את כל האירועים מתחת ל-105 על ציר החי-מת המתאים לאות החי-מת התחתון. לחץ פעמיים בבחירה זו ותוצג עלילה חדשה.</li>
		<li>בחלקה החדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור PerCP-Cy5.5-A עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. בעזרת הכלי בחירת מלבן, בחר באירועים הגבוהים מ- 104 בציר PerCP-Cy5.5-A המתאימים לתאים החיוביים של CD45. לחץ פעמיים על הבחירה ותוצג עלילה חדשה.</li>
		<li>בהתווייה החדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור FSC-A עבור ציר X ו- FSC-H עבור ציר Y. באמצעות כלי הבחירה מצולע בחר את האירועים הבאים אחרי מגמה שבה ערך FSC-A וערך SSC-A זהים; בכך יוסרו כפילי התאים והאוכלוסייה בבחירה תיקרא אוכלוסיית CD45+. לחץ פעמיים על הבחירה כדי להציג מגרש חדש עם אוכלוסיית CD45+.</li>
		<li>מתוך עלילת האוכלוסייה CD45+, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור BV421 בציר X לעומת SSC-A בציר Y. בעזרת הכלי בחירת מצולע, בחר באוכלוסייה מימין לציר BV421 . זוהי אוכלוסיית תאי B. לחץ פעמיים באוכלוסייה זו כדי ליצור שתי חלקות חדשות עם אוכלוסיית תאי B.<ol><li>לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להגדיר את עלילת תאי B הראשונה עם PE-A בציר X ו- BV421-A בציר Y. האוכלוסייה מימין מתאימה לתאי B התוך-וסקולריים, והאוכלוסייה משמאל מייצגת את תאי ה- B הבין-ביתיים. השתמשו בכלי בחירת מצולע כדי לבחור בשניהם.</li>
			<li>לחץ לחיצה ימנית כדי להגדיר את עלילת תאי B השנייה עם Alexa Fluor 700-A על ציר X ו - SSC-A על ציר Y. האוכלוסייה משמאל מתאימה לתאי CD11b, והאירועים מימין (אם בכלל) תואמים לתאי CD11b+.</li>
			<li>לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל בחירה ולאחר מכן לחץ על מאפייני שער. לחץ על ספירה ועל % הורה כדי להציג את הגדלים והאחוזים. תעד את מספר האירועים והאחוזים לניתוח נתונים נוסף.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li>
<li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li>
<li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li>
<li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li>
<li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2%28-%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li>
<li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta%281%29-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li>
<li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li>
<li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).</li>
<li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li>
<li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%28gamma%29+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li>
<li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li>
<li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li>
<li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+knowledge+on+aetiology%2C+diagnosis%2C+management%2C+and+therapy+of+myocarditis%3A+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis%2C+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li>
<li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction%3A+an+experimental+medicine+safety+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li>
<li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4%2B+T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li>
</ol>

לואיג'י אדמו הוא מייסד שותף של i-Cordis, LLC, חברה המתמקדת בפיתוח מולקולות אימונומודולטוריות לטיפול באי ספיקת לב, עם עניין ספציפי בנגזרות של התרופה המווסתת תאי B pirfenidone. לשאר המחברים אין קונפליקטים להצהיר.

גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב ושיפוץ/הסתגלות שריר הלב לפציעה 7,8,9,10,11,12,13,36. ציטומטריה של זרימה היא כלי מצוין לחקר אוכלוסיות תאי חיסון בכל רקמה וכמעט כלי חובה לכל מחקר המתמקד בתאי B בלב.</p...

לימפוציטים מסוג B הם תאים חיסוניים מיוחדים מאוד הממלאים תפקיד חשוב הן בתגובה החיסונית הנרכשת והן בתגובה החיסונית המולדת1. ישנן שתי אוכלוסיות עיקריות של תאי B: אוכלוסייה קטנה יותר של תאי B1 המיוצרים בעיקר במהלך החיים העובריים, ואוכלוסייה מוקדמת של תאי B2 המיוצרים בחיים הבוגרים במח העצם1. לאחר ההתבגרות במח העצם, תאי B נודדים לאיברי לימפה ראשוניים ומשניים. משם הם חוזרים ללא הרף בין איברי הלימפה העוברים דרך כלי הדם וכלי הלימפה2. תאי B מבטאים נוגדנים ספציפיים על פני השטח שלהם, המתפקדים כקולטנים. כאשר תאי B נתקלים באנטיגן שנקשר לקולטן שלהם, ניתן להפעיל אות מפעיל. תאי B פעילים נודדים לרקמה שבה נמצא האנטיגן או חוזרים למח העצם, שם הם יכולים להבשיל לתאי פלזמה המייצרים נוגדנים 3,4.
לאחרונה, זה כבר מוערך כי הלב מכיל אוכלוסייה גדולה של תאי B. מחקרים במכרסמים הראו כי תאי B מאכלסים את הלב בשלב מוקדם במהלך ההתפתחות העוברית5, וכי תאי B הקשורים לשריר הלב הם בעיקר תאי B2 תוך-וסקולריים, נאיביים, הנצמדים לאנדותל6,7, עם אחוז קטן של תאי B1 7. ישנם עדיין תחומים רבים של אי ודאות, אך הנתונים הזמינים מצביעים על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב הן בלב התמים והן בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה.
מחקרים בלב המורין התמים הראו כי בנקודת ההתחלה תאי B של שריר הלב ממוקמים בעיקר בחלל התוך-וסקולרי, דבוקים לאנדותל (>95% מתאי ה-B הלבביים של מורין נמצאו ממוקמים בחלל התוך-וסקולרי). נמצא כי לתאי B אלה יש דפוסי ביטוי גנים שונים מאלה של תאי B במחזור הדם שבודדו מהדם ההיקפי. ניתוח של לבבות תמימים מבעלי חיים עם מחסור בתאי B ובקרות סינגניות מצאו שלבעלי חיים חסרי תאי B היו לבבות קטנים יותר ולחלקפליטה גבוה יותר 6. כל הראיות הללו מצביעות על כך שתאי B עשויים לווסת את גדילת שריר הלב ו/או את תפקוד שריר הלב, וכי לא רק תאי B אינטרסטיציאליים אלא גם תוך-וסקולריים יכולים להיות אחראים לתצפיות כאלה. כמו כן, נמצאו תאי B המווסתים את הפנוטיפ של מקרופאגים המתגוררים בשריר הלב8.
מספר מחקרים הראו כי תאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה 8,9,10,11,12,13. תאי B מצטברים באופן חולף בלב הפגוע, ככל הנראה באמצעות מנגנון תלוי CXCL13-CXCR511,13. משם, תאי B מקדמים שיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים הכוללים גיוסמונוציטים בתיווך ציטוקינים 9,12. בנוסף, תאי B יכולים לייצר נוגדנים נגד חלבוני לב שיכולים לקדם את הרחבת הנזק הלבבי ושיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . תאי B יכולים גם להפעיל השפעה מגנה על הלב הפגוע באמצעות הפרשת IL-1010.
ככל שמספר הקבוצות החוקרות את תפקידם של תאי B בלב התמים והפצוע גדל, חשוב יותר ויותר להגדיר פרוטוקולים משותפים כדי לכמת ולהעריך כראוי תאי B שריר הלב ובכך למנוע חוסר עקביות שכבר החלו להופיע בספרות. עד כה דווח כי תאי B הם כאחד מתאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם7 ונמצאים בשכיחות נמוכה משמעותית מאשר תאים מיאלואידים 26,27, או נדירים למדי28. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב 7,9,13, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלבהפגוע 29. מחקרים על תאי חיסון לבביים כמעט ולא נותנים פרטים על תנאי פרפוזיה ואין הסכמה על תנאי העיכול. מכיוון שבלב מכרסם חלק גדול מתאי B הם תוך-וסקולריים ומיצוי תאי מערכת החיסון משריר הלב תלוי מאוד בשיטת העיכול שבה נעשה שימוש, ההבדלים המדווחים בספרות עשויים להיות תוצאה של הבדלים בזליגת איברים ובעיכול רקמות.
מוצגת כאן שיטה מפורטת לכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב של מורין, אשר ממקסמת את התשואה של התאוששות תאי B על ידי אופטימיזציה של תנאי הזלוף והעיכול ומאפשרת הבחנה של תאי B תוך-וסקולרייםלעומת תאי B חוץ-וסקולריים 6. פרוטוקול זה הוא התאמה ואופטימיזציה של פרוטוקולים דומים אחרים המבחינים בין תאי חיסון תוך-וסקולריים ואינטרסטיציאליים 28,30,31.
בפרוטוקול זה, אנו מבצעים סטנדרטיזציה של פרפוזיה שריר הלב כדי לחסל תאי B שצפים בחלל התוך-וסקולרי מבלי להסיר תאי B רלוונטיים ביולוגית שנדבקו לאנדותל המיקרו-וסקולרי. יתר על כן, בהתבסס על פרוטוקולים קודמים שתיארו את השימוש בהזרקה תוך ורידית של נוגדנים כדי להבחין בין תאי חיסון תוך-ורידיים לתאי חיסון אינטרסטיציאליים32, ותוך ניצול העובדה שתאי B מבטאים את סמן פני השטח B22033, אנו מדגימים כיצד להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים באמצעות הזרקה תוך-וסקולרית של נוגדן ספציפי ל-B220 מיד לפני הקרבת בעלי החיים וזליגת הלב. פרוטוקול זה רלוונטי למחקרו של כל מדען המעוניין לכלול ניתוח של תאי B שריר הלב בלב התמים והפצוע. יישום נרחב של פרוטוקול זה יפחית את חוסר העקביות בין קבוצות המחקר, יאפשר ניתוח של שינויים בבריכות תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים, ובכך יחזק את קידום התגליות בתחום האימונולוגיה של הלב.
לסיכום, הפרוטוקול מייצג זרימת עבודה אופטימלית לכימות וניתוח תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריית זרימה, ובמקביל להבחין בין תאים הממוקמים בחלל החוץ-וסקולרי לבין החלל התוך-וסקולרי.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 נוגדן CD11b אנושי</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 ומיקרו; G 200 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) מסננת תאים, 40 ומיקרו; m, Blue</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה טבעי</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0.9% הזרקת נתרן כלורי, USP</td><td>114-055-101</td><td>איכות ביולוגית</td><td>0.90%</td></tr> <tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה טבעי</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, ארה"ב Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L טיפים מסננים TipOne בוגר</td><td>11213810</td><td>ארה"ב מדעי</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; טיפים מסננים טיפ אחד בוגר 11267810</td><td></td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה, מכסה אטם תקע, פוליפרופילן, שסתום</td> עצירה <td>חד</td><td></td>כיווני <td>430052</td> ללא RNase</tr><tr><td>, פוליקרבונט</td><td>SVPT951</td><td>ייצור</td><td></td>ECT</tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; טיפים מסננים TipOne בוגר L</td><td>11208810</td><td>ארה"ב שסתום</td> עצירה תלת כיווני מדעי<td></td></tr><tr><td>, פוליקרבונט</td><td>SVPT953</td><td>ECT ייצור</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול, פלקון 352054 בסגנון 12 x 75 מ"מ</td><td></td>, צינור צנטריפוגה <td>של מותג</td><td></td>קורנינג</tr><tr><td>50 מ"ל, מכסה אטם תקע, פוליפרופילן, RNase - / DNase</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK ( אמוניום-כלוריד-אשלגן) מאגר ליזינג</td><td>118-156-101</td><td>אוסמולליות ביולוגית איכותית: 290 + או -5% mOsm/Kg מתאם H20</td><td></td></tr><tr><td>4x50 מ"ל, עבור דלי מלבני של 250 מ"ל ברוטור A-4-63</td><td>5810759005</td> מתאם <td>אפנדורף</td><td></td></tr><tr><td>לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל, 9 צינורות לכל מתאם, תחתית חרוטית לשימוש עם רוטור דגם A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>מתאם ל-15 צינורות תחתונים עגולים 2.6 &ndash; 7 מ"ל, עבור דלי מלבני של 250 מ"ל ברוטור A-4-62</td><td>22638246</td><td>רדיד אלומיניום אפנדורף</td><td></td></tr><tr><td>12 אינץ' x 75 אינץ' גליל .0007</td><td>UPC 109153</td> תא אינדוקציה להרדמה <td></td>של <td>ריינולדס</td></tr><tr><td>- עכבר</td><td>RWD-AICMV-100</td><td>Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer מזרק קצה החלקה עם מחט מחוברת 25 גרם x 5/8 אינץ', סטרילי, לשימוש חד פעמי, 1 מ"ל</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין עדינים במיוחד של Brandzig 29G 1 סמ"ק 1/2 אינץ' 100-Pack</td><td>CMD 2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 נוגדן CD19 נגד עכבר</td><td>115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro; מכסי גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>לצינורות זרימה עם רשת מסננת 35 ומיקרו; m, מיקום כפול לצינורות 12 x 75 מ"מ, סטרילי</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>פחמן דו חמצני USP E CGA 940&nbsp;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials בצורה נמוכה, זכוכית, 500 מ"ל</td><td>UX-34502-46</td><td>קולגנאז Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>LS004176</td><td>מחבר סיגמא-אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>פליז מצופה כרום 1/4 אינץ' נקבה NPT x 1/4 אינץ' דוקרני</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas ארה"ב</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora זרימה ציטומטר</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 פטמה 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet&nbsp; 3 - בקר פיפטה אלקטרוני</td><td>4430000018</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Electronic Balance, AX223 / E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Eppendorf 5810R</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research בתוספת פיפטות משתנות חד-ערוציות</td><td>Eppendorf</td><td></td>FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company GLACIERbrand, מחבת קרח בצפיפות משולשת (IPAN-3100)Z740287 Heathrow Scientific HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostats, ישר</td><td>13018-14</td><td>Fine</td><td></td>Science</tr><tr><td>Tools Luer Slip מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 20 מ"ל</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson Underpads, בינוני</td><td>4033- CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator איזון נייד רב תכליתי</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE נגד עכברים/אנושי CD45R/B220 נוגדן</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 נוגדן CD45 נגד עכבר</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 ומיקרו; g 500 uL</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, ניתנת לערמה 35 מ"מ x 10 מ"מ פוליסטירן סטרילי</td><td>FB0875711YZ</td><td>פישר מדעי</td><td></td></tr><tr><td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas ארה"ב</td><td></td></tr><tr><td>עוצמתי 6 וואט LED כפול צוואר אווז תאורה</td><td>LED-6W</td><td>AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide מחט 25 גרם x 5/8 (0.5 מ"מ x 16 מ"מ)305122</td><td></td> <td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc בלוק) שיבוט 2.4G2 (RUO)553141</td><td></td> <td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0.5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td> סכיני הגילוח של קרן <td></td>R</tr><tr><td></td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>רגולטור אנליטי שני שלבים 0-25 psi משלוח CGA320 3500 psi כניסת</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas ארה"ב</td><td></td></tr><tr><td>רוטור A-4-62, כולל 4 x 250 מ"ל דליים מלבניים</td><td>רוטור A-4-62</td><td>אפנדורף</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית, סתומה, 10 מ"ל, סטרילית, לא פירוגנית/נטולת אנדוטוקסין, לא ציטוטוקסית, 1 חתיכה/שלפוחית</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG & Co KG</td><td></td></tr><tr><td>Sigma תווית קלטת</td><td>L8394</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, ישר, זכר Luer Lock x 1/8 אינץ' צינור דוקרני; 1 / EA</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>Std Wall Lab Tubing, גודל S2, Excelon, 1/8 אינץ' מזהה x 3/16 אינץ' OD x 1/32 אינץ' קיר x 50 אינץ' ארוך</td><td>CG-730-003</td><td>מעבדת אקסלון</td><td></td></tr><tr><td>מזרק PP / PE ללא מחט, 3 מ"ל</td><td>Z683566</td><td>Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>55-1199 (95-240)</td> <td>מכשיר</td><td></td>הרווארד</tr><tr><td>טיימר אזעקה תומאס 3 ערוצים TM10500</td><td>9371W13</td><td>מתלה צינורות תומאס סיינטיפיק</td><td></td></tr><tr><td>, 12&nbsp; עמדות, 6 עבור 5.0&nbsp; מ"ל ו-15&nbsp; צינורות מ"ל ו-6 ל-25&nbsp; מ"ל ו-50&nbsp; צינורות מ"ל, פוליפרופילן, עמדות ממוספרות,</td> מתלה צינורות <td>30119835</td><td>אפנדורף</td><td></td>הניתן לחיטוי</tr><tr><td>, 12&nbsp; פוזיציות, עבור 5.0&nbsp; מ"ל ו-15&nbsp; צינורות מ"ל, פוליפרופילן, עמדות ממוספרות, ניתנות לחיטוי</td><td>30119827</td> צינורות מעבדה <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603, תעודת זהות וזמנים; OD 1/4 אינץ' וזמנים; 3/8 אינץ'.</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לניתוח VWR עם סיכת מנחה עם קצות מעוקלים</td><td>89259-946</td><td>Avantor, מאת VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR מספריים לניתוח, קצה חד, 4&frac12; "</td><td>82027-578</td><td>Avantor, על ידי VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR Incubating Orbital Shaker, דגם 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, על ידי VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי b שריר הלב

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי לימפוציטים מסוג B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב והסתגלות שריר הלב לפציעה. עם זאת, הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. דווח כי תאי B הם גם בין תאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם או שהם נוכחים, אך בשכיחות נמוכה משמעותית מתאי מיאלואידים, או שהם נדירים למדי. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלב הפגוע. יישום שיטה משותפת הניתנת לשחזור כדי להעריך את השכיחות של תאי B שריר הלב הוא קריטי כדי ליצור הרמוניה בין תצפיות מקבוצות מחקר שונות ובכך לקדם את קידום המחקר של אינטראקציות שריר הלב של תאי B. בהתבסס על הניסיון שלנו, התצפיות המנוגדות לכאורה המדווחות בספרות נובעות ככל הנראה מהעובדה שתאי B של שריר הלב הם ברובם תוך-וסקולריים ומחוברים לאנדותל המיקרו-וסקולרי. לכן, מספר תאי B שהתאוששו מלב מורין רגיש להפליא לתנאי הזלוף המשמשים לניקוי האיבר ולשיטת העיכול המשמשת. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי המביא בחשבון את שני המשתנים הקריטיים הללו באופן ספציפי. פרוטוקול זה מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור של מספר תאי B שריר הלב ומאפשר לחוקרים להבחין בין תאי B מיו-וסקולריים חוץ-וסקולריים לעומת תאי B תוך-וסקולריים.

לאחר השלמת הרכישה ואיסוף כל האירועים, יש לנתח את הנתונים על פי תרגול ציטומטריה של זרימה סטנדרטית. מוקד הניתוח ישתנה בהתאם למטרה האישית של כל ניסוי. במקרה זה, כימות של תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים נרדף, והוא בא לידי ביטוי כמספר התאים למ"ג רקמה.
בעת שימוש בציטומטר ספקטרלי, מומלץ להתחיל את הניתוח עם gating ראשוני כדי להסיר פסולת בגדלים שאינם בטווח המתאים לתאי החיסון, ולאחר מכן להסיר את האות כתם חי מת+. זה מאפשר לזהות אוכלוסייה נקייה של תאים חיוביים מסוג CD45 המתאימים ללויקוציטים (<strong cl...

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. זה נובע ככל הנראה משונות בטכניקות הזלוף והעיכול. הפרוטוקול שלנו מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור על תאי B שריר הלב.טכניקה זו ממקסמת את תנובת ההתאוששות של תאי B ומפחיתה את השונות בספירת הציטומטריה של הזרימה בקרב תאי B ואוכלוסיות אחרות מדגימות לב. ניתן לשנות בקלות את שיטת העיכול והבידוד הממוטבת הזו כדי ליישם פאנל נוגדנים מורחב כדי לחקור סוגים שונים של תאי חיסון בלב. הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על איברים אחרים, כגון ריאות או כבד, כדי לחקור תאי B הקשורים לאיברים אלה.כדי להתחיל, לשקול עכבר זכר בן 12 שבועות. העמיסו מזרק אינסולין בנפח 310 סמ"ק עם 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים B220. הזריקו את הנוגדן המדולל B220 בהזרקה רטרו-אורביטלית והמשיכו מיד לקצירת איברים ולזלוף.לאחר המתת חסד, להחזיק את העור של העכבר עם מלקחיים באזור epigastric. צרו פתח של שני מילימטרים בעור באמצעות מספריים והשתמשו במלקחיים כדי לקלף את העור ולחשוף את שכבת החיתולית. חותכים באפיגסטריום דרך החיתולית והצפק.מהדק את תהליך xiphoid באמצעות מלקחיים hemostatic. בצע חיתוך אנכי דרך דופן בית החזה בגובה קו האמצע בכל צד והרם את דופן החזה הקדמית כדי לחשוף את תוכן המדיה-סטינום. החזיקו את אבי העורקים היטב מאחור באמצעות מלקחיים.הציגו את מחט המזרק לתוך קצה הלב. מתמזג עם שלושה מיליליטר של HBSS בקצב של שלושה מיליליטר לדקה. חותכים את אבי העורקים ומסירים את הלב.לשטוף את הלב בצלחת פטרי עם HBSS. שקלו את הלב המבודד ושימו לב למשקל במיליגרמים. טחנו את הלב בטמפרטורת החדר לחתיכות קטנות עם להב.חתיכות הלב צריך להיות כ 1.5 מ"מ בגודל. מדוד את המסה של רקמת הלב באמצעות איזון והניח 60 מיליגרם של הלב הטחון כדי להתעכל בצינור 15 מיליליטר על קרח עם שלושה מיליליטר של HBSS. חזור על תהליך זה עבור עכבר שלא קיבל את זריקת הנוגדן B220 והנח אותו בצינור עם שלושה מיליליטר של רקמת בקרת ייחוס המסומנת HBSS.הוסיפו אנזימים לכל צינור המכיל רקמות טחונות. הוסף 0.5 מיקרוליטר למיליגרם של DNase I, 0.5 מיקרוליטר אחד למיליגרם של קולגןאז II, ו-0.2 מיקרוליטר למיליגרם של היאלורונידז. מניחים את תגובת העיכול בשייקר למשך 30 דקות במהירות של 300 סיבובים לדקה.צינורות ממוקמים בשייקר בזווית קטנה, על 25 מעלות של שיפוע. הוסף שבעה מיליליטר של HBSS לכל אחד מצינורות התגובה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-250 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר נטרול הסופר-נטנט, יש להשעות כל כדור בחמישה מיליליטר של חיץ ליזיס ACK.לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת 10 מיליליטר של PBS לכל צינור, מערבבים ומסננים לתוך צינור 50 מיליליטר עם מסננת 40 מיקרומטר. יש לרסק את כל הפסולת שעל המסנן באמצעות בוכנה מזרק כדי להבטיח שכל החומר יעבור דרך המסנן.לאחר הוספת PBS דרך המסנן עד שהנפח מגיע ל -25 מיליליטר ללב, הוסף 25 מיליליטר נוספים של PBS לצינור רקמת בקרת הייחוס וחלק את הנפח לשני צינורות שונים. תייג את אחד הצינורות לא מוכתם והשני חי / מת. לאחר צנטריפוגה ב-250 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, יש לנטרל את הסופר-נטנט ולתלות מחדש את הצינור הלא מוכתם ב-100 מיקרוליטרים של PBS וכל אחד מהכדורים האחרים ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת הכתם החי/מת.דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. לאחר הוספת 500 מיקרוליטרים של מאגר FACS לכל דגימה, העבר אותו לצינור FACS דרך מסנן של 40 מיקרומטר. לאחר סירוב צינורות FACS ב 250 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשלכת supernatant, להשעות את הכדור ב 500 microliters של חיץ FACS.הוסף 50 מיקרוליטרים של תמיסת חסימת FC לכל צינור, למעט הצינורות הלא מוכתמים והחיים/מתים. מערבבים ודוגרים במשך חמש דקות. לאחר הוספת 50 מיקרוליטרים של תמיסת תערובת נוגדנים לכל צינור, למעט הצינורות הלא מוכתמים והחיות/מתות, דוגרים במשך 30 דקות בחושך, ומכסים את דלי הקרח ברדיד אלומיניום.כמו עם הכתם החי/מת, יש לשטוף שוב עם 500 מיקרוליטרים של חיץ FACS ולהשהות מחדש ב-300 עד 500 מיקרוליטרים של חיץ FACS. פתח את תוכנת בקרת המכשירים. בחלק העליון של החלון, בחר את רכישה הכרטיסייה ולחץ על חדש.במקטע הספרייה, בשדה סוג לסינון, הקלד PE, PerCP-Cy5.5, סגול מבריק 421, Alexa Fluor 700 ו- Zombie Aqua, בחירת הפלואורו-4 ולחיצה על הוסף לאחר הקלדת כל אחד מהם. לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה קבוצות. עכשיו לחץ על הסמל עם צינור כדי להוסיף את הלב לניתוח.לחץ על קבוצת ההפניות ויוצג חלון. בעמודת התגים הפלואורסצנטיים, בחר Zombie Aqua כתג הפלואורסצנטי, ומחק את כל האחרים על ידי לחיצה על סמל אדום האשפה לצד כל אחד מהם. לאחר מכן, בסמל סוג בקרה, בחר תאים.לאחר מכן, לחץ על שמור. לחץ על הבא. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה סמנים.תוצג טבלה. הקלד את סמן התא המתאים בשורה הראשונה של כל עמודה של פלואורו-4 והקש Enter. לחץ על הבא פעמיים כדי לעבור לכרטיסיה רכישה.ב- Events To Record של דגימות הניסוי, הקלד 10 מיליון, ובאותו שדה עבור שורת קבוצת הייחוס, הקלד 200, 000. לחץ על שמור ופתח. בפינה השמאלית התחתונה, לחץ על בקרת מכשירים.הגדר מתח ל- FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. בחר את פקד הרכישה. עבור אפשרות קצב הזרימה, בחר גבוה מהתפריט הנפתח.מערבבים את צינור הלב הלא מוכתם ומניחים אותו בבטחה על יציאת הזרקת הדגימה. ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדגימה הנכונה. לאחר מכן, לחץ על הקלט והמתן עד להקלטת האירועים.עשו את אותו הדבר עבור רקמת הלב המוכתמת חיה/מתה. בחר בתפריט Unmix והגדר את הפקדים. בחר/י בתיבת הסימון עבור ״פלואורסצנציה אוטומטית״ כתג פלואורסצנטי.לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה זיהוי אוכלוסיות חיוביות/שליליות. בכרטיסייה זו תוצג התווה של אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור צדדי. לחצו וגררו את נקודות המצולע כדי לבחור אזור בין 1 ל- 4 מיליון בציר אזור הפיזור הקדמי ובין 0.2 ל- 3 מיליון בציר אזור הפיזור הצדדי.בחלקה הבאה מימין, V5-A יוצג על ציר X. הזז את השערים כדי לבחור מחצית מהפסגה בקצה הימני כחיובית, ואזור בצד שמאל של העלילה כשלילי. בעלילה שכותרתה קבוצת ייחוס-לא מוכתמת, בחר אוכלוסייה בטווח דומה.עבור הלא מוכתם, אין לבחור חיובי/שלילי. לחצו על הלחצן 'ביטול ערבוב חי'. כעת רכשו את דגימות הניסוי, מערבבים את הצינור, ומניחים אותו בבטחה על ה- SIP.ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדגימה הנכונה. לאחר מכן, לחץ להקליט בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו. בחר את הכרטיסיה ברירת מחדל לגליון עבודה לא מעורבב.צור מתווה FCS-A לעומת SSC-A באמצעות כלי התוויית הנקודות שמעליו. בחר אירועים הגבוהים מ- 0.4 מיליון בציר FSC-A וגבוהים מ- 0.8 מיליון בציר SSC-A באמצעות כלי בחירת המצולעים. צור מגרש חדש על-ידי לחיצה כפולה על הבחירה, ובעלילה חדשה זו, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר Y ובחר כתם חי/מת.לחץ לחיצה ימנית על תווית ציר X ובחר Autofluorescence A.בחר את כל האירועים מתחת 10 עד החמישי על ציר חי / מת. אלה התאים החיים. לחץ פעמיים בבחירה זו.בחלקה החדשה, בחר PerCP-Cy5.5A עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. בחר את האוכלוסיות בצד ימין של PerCP-Cy5.5A. אלה הם תאי החיסון.לחץ פעמיים על הבחירה. בהתווייה החדשה, בחר FSC-A עבור ציר X וגובה פיזור קדימה עבור ציר Y. בחר את האירועים העוקבים אחר מגמה שבה הערך FSC-A וערך SSC-A זהים.פעולה זו בוחרת תאים בודדים ומבטלת כפילויות. לחץ פעמיים על בחירה זו כדי להציג עלילה חדשה באוכלוסיית התאים הבודדים החיוביים ל-CD45. מתוך עלילת האוכלוסייה החד-תאית החיובית ל-CD45, בחר סגול מבריק 421 על ציר ה-X לעומת SSC-A על ציר ה-Y.בחר את האוכלוסייה מימין על ציר 421 סגול מבריק. זוהי אוכלוסיית תאי B. לחץ פעמיים באוכלוסייה זו כדי ליצור שתי חלקות חדשות עם אוכלוסיית תאי B.הגדר את עלילת תאי B הראשונה עם PEA על ציר X וסגול מבריק 421A על ציר Y. האוכלוסייה מימין מתאימה לתאי B הבין-וסקולריים, והאוכלוסייה משמאל מייצגת את תאי B הבין-ביתיים. בחר את שניהם.הגדר את עלילת תאי B השנייה עם Alexa Fluor 700A על ציר X ו- SSC-A על ציר Y. האוכלוסייה משמאל מתאימה לתאים השליליים של CD11b, והאירועים מימין מתאימים לתאים החיוביים ל- CD11b. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל מקטע ולאחר מכן לחץ על מאפייני שער.לחץ על ספירה והורה כדי להציג את מספרי האירועים והאחוזים של אוכלוסיות ההורים. תעד את מספר האירועים והאחוזים לניתוח נתונים נוסף. לאחר הסרת כפילויות בלב נאיבי שאינו נגוע, צפוי שכ-20% מהתאים החיוביים ל-CD45 יהיו תאי B חיוביים ל-CD19.מתוך תאים אלה, בממוצע, 5.5% ממוקמים בחלל interstitial. 94.5% נמצאים בחלל התוך-וסקולרי. מתוך כל אוכלוסיית תאי B שנמצאת בלב, רק כ-1.6% מתאימים לתאי B1 המבוססים על סמן פני השטח CD11b ו-98.4% האחרים מתאימים לתאי B2.כאשר מנתחים תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריה של זרימה, חיוני לחדור ולטחון את הלב כראוי בהתאם לפרוטוקול. סינון נכון של הלב המעוכל הוא גם חיוני כדי למקסם את ההתאוששות של תאים חיסוניים.

flow-cytometry-based-quantification-and-analysis-of-myocardial-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

סרטון זה מדגים את ההרכבה מחדש של תאים סינתטיים מציגי אנטיגן באמצעות דו-שכבות ליפידים הנתמכות על ידי חרוזים ויישומם בהערכת הפלט הסינפטי שנוצר על ידי תאי T פעילים.

שימוש בשכבות שומנים הנתמכות על ידי חרוזים כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

למדו פרוטוקול לכימות וניתוח תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטה משפרת את תפוקת השחזור של תאי B ומפחיתה שונות בדגימות לב, וניתן להתאימה לאיברים נוספים.

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

גלה סרטונים נוספים