כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. זה נובע ככל הנראה משונות בטכניקות הזלוף והעיכול. הפרוטוקול שלנו מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור על תאי B שריר הלב.

טכניקה זו ממקסמת את תנובת ההתאוששות של תאי B ומפחיתה את השונות בספירת הציטומטריה של הזרימה בקרב תאי B ואוכלוסיות אחרות מדגימות לב. ניתן לשנות בקלות את שיטת העיכול והבידוד הממוטבת הזו כדי ליישם פאנל נוגדנים מורחב כדי לחקור סוגים שונים של תאי חיסון בלב. הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על איברים אחרים, כגון ריאות או כבד, כדי לחקור תאי B הקשורים לאיברים אלה.

כדי להתחיל, לשקול עכבר זכר בן 12 שבועות. העמיסו מזרק אינסולין בנפח 310 סמ"ק עם 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים B220. הזריקו את הנוגדן המדולל B220 בהזרקה רטרו-אורביטלית והמשיכו מיד לקצירת איברים ולזלוף.

לאחר המתת חסד, להחזיק את העור של העכבר עם מלקחיים באזור epigastric. צרו פתח של שני מילימטרים בעור באמצעות מספריים והשתמשו במלקחיים כדי לקלף את העור ולחשוף את שכבת החיתולית. חותכים באפיגסטריום דרך החיתולית והצפק.

מהדק את תהליך xiphoid באמצעות מלקחיים hemostatic. בצע חיתוך אנכי דרך דופן בית החזה בגובה קו האמצע בכל צד והרם את דופן החזה הקדמית כדי לחשוף את תוכן המדיה-סטינום. החזיקו את אבי העורקים היטב מאחור באמצעות מלקחיים.

הציגו את מחט המזרק לתוך קצה הלב. מתמזג עם שלושה מיליליטר של HBSS בקצב של שלושה מיליליטר לדקה. חותכים את אבי העורקים ומסירים את הלב.

לשטוף את הלב בצלחת פטרי עם HBSS. שקלו את הלב המבודד ושימו לב למשקל במיליגרמים. טחנו את הלב בטמפרטורת החדר לחתיכות קטנות עם להב.

חתיכות הלב צריך להיות כ 1.5 מ"מ בגודל. מדוד את המסה של רקמת הלב באמצעות איזון והניח 60 מיליגרם של הלב הטחון כדי להתעכל בצינור 15 מיליליטר על קרח עם שלושה מיליליטר של HBSS. חזור על תהליך זה עבור עכבר שלא קיבל את זריקת הנוגדן B220 והנח אותו בצינור עם שלושה מיליליטר של רקמת בקרת ייחוס המסומנת HBSS.

הוסיפו אנזימים לכל צינור המכיל רקמות טחונות. הוסף 0.5 מיקרוליטר למיליגרם של DNase I, 0.5 מיקרוליטר אחד למיליגרם של קולגןאז II, ו-0.2 מיקרוליטר למיליגרם של היאלורונידז. מניחים את תגובת העיכול בשייקר למשך 30 דקות במהירות של 300 סיבובים לדקה.

צינורות ממוקמים בשייקר בזווית קטנה, על 25 מעלות של שיפוע. הוסף שבעה מיליליטר של HBSS לכל אחד מצינורות התגובה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-250 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר נטרול הסופר-נטנט, יש להשעות כל כדור בחמישה מיליליטר של חיץ ליזיס ACK.

לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת 10 מיליליטר של PBS לכל צינור, מערבבים ומסננים לתוך צינור 50 מיליליטר עם מסננת 40 מיקרומטר. יש לרסק את כל הפסולת שעל המסנן באמצעות בוכנה מזרק כדי להבטיח שכל החומר יעבור דרך המסנן.

לאחר הוספת PBS דרך המסנן עד שהנפח מגיע ל -25 מיליליטר ללב, הוסף 25 מיליליטר נוספים של PBS לצינור רקמת בקרת הייחוס וחלק את הנפח לשני צינורות שונים. תייג את אחד הצינורות לא מוכתם והשני חי / מת. לאחר צנטריפוגה ב-250 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, יש לנטרל את הסופר-נטנט ולתלות מחדש את הצינור הלא מוכתם ב-100 מיקרוליטרים של PBS וכל אחד מהכדורים האחרים ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת הכתם החי/מת.

דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. לאחר הוספת 500 מיקרוליטרים של מאגר FACS לכל דגימה, העבר אותו לצינור FACS דרך מסנן של 40 מיקרומטר. לאחר סירוב צינורות FACS ב 250 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשלכת supernatant, להשעות את הכדור ב 500 microliters של חיץ FACS.

הוסף 50 מיקרוליטרים של תמיסת חסימת FC לכל צינור, למעט הצינורות הלא מוכתמים והחיים/מתים. מערבבים ודוגרים במשך חמש דקות. לאחר הוספת 50 מיקרוליטרים של תמיסת תערובת נוגדנים לכל צינור, למעט הצינורות הלא מוכתמים והחיות/מתות, דוגרים במשך 30 דקות בחושך, ומכסים את דלי הקרח ברדיד אלומיניום.

כמו עם הכתם החי/מת, יש לשטוף שוב עם 500 מיקרוליטרים של חיץ FACS ולהשהות מחדש ב-300 עד 500 מיקרוליטרים של חיץ FACS. פתח את תוכנת בקרת המכשירים. בחלק העליון של החלון, בחר את רכישה הכרטיסייה ולחץ על חדש.

במקטע הספרייה, בשדה סוג לסינון, הקלד PE, PerCP-Cy5.5, סגול מבריק 421, Alexa Fluor 700 ו- Zombie Aqua, בחירת הפלואורו-4 ולחיצה על הוסף לאחר הקלדת כל אחד מהם. לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה קבוצות. עכשיו לחץ על הסמל עם צינור כדי להוסיף את הלב לניתוח.

לחץ על קבוצת ההפניות ויוצג חלון. בעמודת התגים הפלואורסצנטיים, בחר Zombie Aqua כתג הפלואורסצנטי, ומחק את כל האחרים על ידי לחיצה על סמל אדום האשפה לצד כל אחד מהם. לאחר מכן, בסמל סוג בקרה, בחר תאים.

לאחר מכן, לחץ על שמור. לחץ על הבא. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה סמנים.

תוצג טבלה. הקלד את סמן התא המתאים בשורה הראשונה של כל עמודה של פלואורו-4 והקש Enter. לחץ על הבא פעמיים כדי לעבור לכרטיסיה רכישה.

ב- Events To Record של דגימות הניסוי, הקלד 10 מיליון, ובאותו שדה עבור שורת קבוצת הייחוס, הקלד 200, 000. לחץ על שמור ופתח. בפינה השמאלית התחתונה, לחץ על בקרת מכשירים.

הגדר מתח ל- FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. בחר את פקד הרכישה. עבור אפשרות קצב הזרימה, בחר גבוה מהתפריט הנפתח.

מערבבים את צינור הלב הלא מוכתם ומניחים אותו בבטחה על יציאת הזרקת הדגימה. ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדגימה הנכונה. לאחר מכן, לחץ על הקלט והמתן עד להקלטת האירועים.

עשו את אותו הדבר עבור רקמת הלב המוכתמת חיה/מתה. בחר בתפריט Unmix והגדר את הפקדים. בחר/י בתיבת הסימון עבור ״פלואורסצנציה אוטומטית״ כתג פלואורסצנטי.

לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה זיהוי אוכלוסיות חיוביות/שליליות. בכרטיסייה זו תוצג התווה של אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור צדדי. לחצו וגררו את נקודות המצולע כדי לבחור אזור בין 1 ל- 4 מיליון בציר אזור הפיזור הקדמי ובין 0.2 ל- 3 מיליון בציר אזור הפיזור הצדדי.

בחלקה הבאה מימין, V5-A יוצג על ציר X. הזז את השערים כדי לבחור מחצית מהפסגה בקצה הימני כחיובית, ואזור בצד שמאל של העלילה כשלילי. בעלילה שכותרתה קבוצת ייחוס-לא מוכתמת, בחר אוכלוסייה בטווח דומה.

עבור הלא מוכתם, אין לבחור חיובי/שלילי. לחצו על הלחצן 'ביטול ערבוב חי'. כעת רכשו את דגימות הניסוי, מערבבים את הצינור, ומניחים אותו בבטחה על ה- SIP.

ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדגימה הנכונה. לאחר מכן, לחץ להקליט בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו. בחר את הכרטיסיה ברירת מחדל לגליון עבודה לא מעורבב.

צור מתווה FCS-A לעומת SSC-A באמצעות כלי התוויית הנקודות שמעליו. בחר אירועים הגבוהים מ- 0.4 מיליון בציר FSC-A וגבוהים מ- 0.8 מיליון בציר SSC-A באמצעות כלי בחירת המצולעים. צור מגרש חדש על-ידי לחיצה כפולה על הבחירה, ובעלילה חדשה זו, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר Y ובחר כתם חי/מת.

לחץ לחיצה ימנית על תווית ציר X ובחר Autofluorescence A.בחר את כל האירועים מתחת 10 עד החמישי על ציר חי / מת. אלה התאים החיים. לחץ פעמיים בבחירה זו.

בחלקה החדשה, בחר PerCP-Cy5.5A עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. בחר את האוכלוסיות בצד ימין של PerCP-Cy5.5A. אלה הם תאי החיסון.

לחץ פעמיים על הבחירה. בהתווייה החדשה, בחר FSC-A עבור ציר X וגובה פיזור קדימה עבור ציר Y. בחר את האירועים העוקבים אחר מגמה שבה הערך FSC-A וערך SSC-A זהים.

פעולה זו בוחרת תאים בודדים ומבטלת כפילויות. לחץ פעמיים על בחירה זו כדי להציג עלילה חדשה באוכלוסיית התאים הבודדים החיוביים ל-CD45. מתוך עלילת האוכלוסייה החד-תאית החיובית ל-CD45, בחר סגול מבריק 421 על ציר ה-X לעומת SSC-A על ציר ה-Y.

בחר את האוכלוסייה מימין על ציר 421 סגול מבריק. זוהי אוכלוסיית תאי B. לחץ פעמיים באוכלוסייה זו כדי ליצור שתי חלקות חדשות עם אוכלוסיית תאי B.

הגדר את עלילת תאי B הראשונה עם PEA על ציר X וסגול מבריק 421A על ציר Y. האוכלוסייה מימין מתאימה לתאי B הבין-וסקולריים, והאוכלוסייה משמאל מייצגת את תאי B הבין-ביתיים. בחר את שניהם.

הגדר את עלילת תאי B השנייה עם Alexa Fluor 700A על ציר X ו- SSC-A על ציר Y. האוכלוסייה משמאל מתאימה לתאים השליליים של CD11b, והאירועים מימין מתאימים לתאים החיוביים ל- CD11b. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל מקטע ולאחר מכן לחץ על מאפייני שער.

לחץ על ספירה והורה כדי להציג את מספרי האירועים והאחוזים של אוכלוסיות ההורים. תעד את מספר האירועים והאחוזים לניתוח נתונים נוסף. לאחר הסרת כפילויות בלב נאיבי שאינו נגוע, צפוי שכ-20% מהתאים החיוביים ל-CD45 יהיו תאי B חיוביים ל-CD19.

מתוך תאים אלה, בממוצע, 5.5% ממוקמים בחלל interstitial. 94.5% נמצאים בחלל התוך-וסקולרי. מתוך כל אוכלוסיית תאי B שנמצאת בלב, רק כ-1.6% מתאימים לתאי B1 המבוססים על סמן פני השטח CD11b ו-98.4% האחרים מתאימים לתאי B2.

כאשר מנתחים תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריה של זרימה, חיוני לחדור ולטחון את הלב כראוי בהתאם לפרוטוקול. סינון נכון של הלב המעוכל הוא גם חיוני כדי למקסם את ההתאוששות של תאים חיסוניים.