Name: מדידות דמויות פוטנציאל פעולה המושרה בלייזר של קרדיומיוציטים במערכי מיקרואלקטרודות לחיזוי מוגבר של פרמקולוגיה בטיחותית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למד שיטה חדשנית לרישום פוטנציאלי פעולה תוך-תאיים בקרדיומיוציטים באמצעות ניקוב לייזר ומערכי מיקרואלקטרודות. שיטה זו משפרת את הסיווג של פוטנציאלים פרוע-פרפורמיים ואת בטיחות התרופות בקרדיולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות ל-Foresee Biosystems על השאלת מערכת IntraCell במהלך המחקרים. הם גם רוצים להודות להא אין צ'אנג על הסיוע הטכני. עבודה זו קיבלה מימון מתוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי Horizon 2020 במסגרת הסכם המענקים מס' 964518 (ToxFree), מתוכנית מועצת החדשנות האירופית של האיחוד האירופי Horizon Europe, מפרויקט SiMulTox (הסכם מענקים מס' 101057769), וממשרד המדינה של באדן-וירטמברג לעניינים כלכליים, עבודה ותיירות.

1. הכנה מושרית של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים
הערה: קרדיומיוציטים iCell2 (המכונים קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים מושרים [iPSCs]- קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSCs) הוכנו על פי הפרוטוקול שסופק על ידי הספק. הפרוטוקול יסוכם בקצרה בסעיף הבא.
<ol><li>ציפוי הפשרה ותחזוקה בינונית בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו ציפוי פיברונקטין על ידי המסת פיברונקטין סטרילי במים סטריליים בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן מלאי זה ב-aliquots (לדוגמה, 25 μL לכל aliquot). דלל את תמיסת המלאי המצוטטת 1:20 בתמיסת המלח המאוזנת הסטרילית של דולבקו (dPBS).</li>
	<li>מצפים את שדות האלקטרודות של ה-MEAs שהיו בעבר אוטוקלאבים מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, מבחינת טיפות בתנאים סטריליים עם פיברונקטין באמצעות פיפטה של 10 μL. לשם כך, יש לטפטף 5 μL מתמיסת הציפוי פיברונקטין על שדות האלקטרודות ולצפות בהיווצרות טיפה על גבי אזור האלקטרודה. הקפידו לא לגעת באלקטרודות הרגישות. הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, העבר את שבב MEA לתוך צלחת פטרי סטרילית לפני הסרתו ממכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.</li>
	<li>דגירה של MEAs מצופים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רצוי.</li>
	<li>להפשיר את cryovial המכיל את cardiomyocytes באמבט מים ב כ 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות עד רק גביש קרח קטן נשאר. העבר את תמיסת התא בעדינות לצינור של 50 מ"ל.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום ציפוי לקריוביאלי הריק. העבירו את התמיסה לאורך פרק זמן של 90 שניות לתוך צינור 50 מ"ל כדי להפחית את הזעזוע האוסמוטי. הוסיפו בעדינות 8 מ"ל נוספים של מדיום ציפוי לתוך הצינור.</li>
	<li>מערבבים בזהירות את מתלה התא באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. חשב את המספר הכולל של תאים בני קיימא באמצעות ציטומטריה פלואורסצנטית אוטומטית. המספר צריך להיות קרוב למספר בגליון הנתונים שסופק על-ידי היצרן.</li>
	<li>סובבו את תמיסת התא כלפי מטה למשך 3 דקות ב-200 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את הסופר-נטנט על ידי שאיפה באמצעות פיפטה זכוכית המחוברת למערכת שאיבה. התאם את מספר התא בין 6,000 ל- 15,000 תאים בני קיימא/μL. הערה: מספר התאים נמצא בדרך כלל בטווח שניתן לעיל, אך עשוי להשתנות בהתאם לספק המתאים.</li>
	<li>הסר את תמיסת הציפוי שיושמה בשלב 1.3 מאזור האלקטרודה MEA באמצעות פיפטה של 10 μL ישירות לפני זריעת התא. זרע את התאים מיד לאחר ההסרה כדי למנוע ייבוש של הציפוי. לשם כך, זרעו את התאים ב-4 μL הן עבור MEAs של 6 בארות והן עבור MEAs של באר אחת אל שדות האלקטרודות באותו אופן כמו שנעשה עם הציפוי.</li>
	<li>אפשרו לתאים להיצמד במשך שעה אחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפני מילוי הבארות במדיום הציפוי הסטרילי המחומם לכ-37 מעלות צלזיוס ב-200 מיקרו-ליטר עבור MEA של 6 בארות ו-1 מ"ל עבור MEA של באר יחידה מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.</li>
	<li>בצע שינוי בינוני מלא 48 שעות לאחר הציפוי מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. לשם כך, הסר את מדיום הציפוי על ידי שאיפה באמצעות פיפטה זכוכית המחוברת למערכת שאיבה. לאחר מכן, להוסיף 200 μL של תחזוקה סטרילית בינונית מחוממת ל 37 מעלות צלזיוס לבארות.</li>
	<li>בצע שינויים בינוניים מלאים אחת ליומיים.</li>
	<li>התחילו למדוד את התאים 5-8 ימים לאחר ההפשרה. בצע שינוי בינוני מלא שעתיים לפני תחילת הניסויים.</li>
</ol>2. הקלטות MEA
הערה: ההתקן המשמש להפיכת אות ה-FP ל-liAP מורכב ממיקרוסקופ זקוף ולייזר של 1064 ננומטר.
<ol><li>הנח את מערכת MEA על גבי המכשיר כאשר מחזיק השבבים MEA מרוכז מעל החור האובייקטיבי. מקם את מערך ה-MEA כך שהמטרה תהיה ישירות מתחת לחור של מערכת MEA כדי לאפשר ללייזר להתמקד באלקטרודות.</li>
	<li>העבירו את שבב ה-MEA עם התאים המעובדים מהאינקובטור למערך ה-MEA 15 דקות לפני ההקלטה, מה שמאפשר לתאים להתאושש מההפרעה המכנית.</li>
	<li>נקו את רפידות המגע והסיכות בזהירות באמצעות איזופרופנול ומקלון צמר גפן כדי להפחית את רמות הרעש. מקם את ה-MEA בזהירות בהגדרת MEA. מקם את שבב MEA עם הלוגו בתחתית בצד שמאל למעלה (MEA של 6 בארות) או עם אלקטרודת הייחוס משמאל (MEA חד-באר).</li>
	<li>הגדר את החימום המשולב במערכת MEA ל-38°C. הניחו תא קטן על גבי שבב ה-MEA כדי לחדור כל הזמן לתאים עם קרבוגן לח (5% CO 2 ו-95% O2) כדי ליצור מחדש את תנאי האינקובטור ולמנוע אידוי.</li>
	<li>סגור את המכסה של ההתקן. מתג הבטיחות המשולב מאפשר להפעיל את הלייזר רק אם המכסה סגור מעל שבב MEA. הגדר את מסנן מערכת MEA באמצעות תוכנית התצורה של MEA ל- 0.1 הרץ או פחות מעבר גבוה ומעבר נמוך של 3,500 הרץ.</li>
	<li>השתמש בתוכנת MC_Rack (תוכנת הקלטה) או בכל תוכנה חלופית להקלטה. התאם את טווח הכניסה בהתאם לצרכים שלך כדי להבטיח שהאות לא ירווה את המגבר ואת קצב הדגימה (למשל, 20 קילוהרץ). השתמש בפונקציית התצוגה ארוכת הטווח של התוכנה כדי לבדוק את ההקלטה.</li>
</ol>3. פורציית תאים המושרה בלייזר
<ol><li>לאחר הכנסת שבב MEA להגדרת MEA והגדרת התוכנה, אתחל את מכניקת הלייזר באמצעות תוכנת FB Alps (תוכנת אתחול).</li>
	<li>ראשית, לחץ על כפתור האתחול . בסוף האתחול, נקודת הלייזר הווירטואלית תהיה ב- D היטב עבור MEA של 6 בארות ובפינה השמאלית התחתונה עבור MEA של באר יחידה, בהתאמה.</li>
	<li>הזז את נקודת הלייזר הווירטואלית עם Ctrl + לחיצה על העכבר באמצע אלקטרודה D5 והתאם את המיקוד. התאם את המוקד על ידי Ctrl + גלילה באמצעות גלגל העכבר.</li>
	<li>לחץ על הלחצן הגדר P1. נקודת הלייזר הווירטואלית תעבור באופן אוטומטי לתוך באר F. חזור על התהליך עם האלקטרודה F5 ובחר הגדר P2.</li>
	<li>לאחר הליך זה, נקודת הלייזר תעבור לתוך באר B. חזור על אותו תהליך עם אלקטרודה B5 ולחץ על Set P3 בתוכנה. המערכת מיושרת כעת.</li>
	<li>התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן התהליך בהתאם לצרכי התאים שלך. כאן נעשה שימוש ב-40% כוח ו-25% בזמן עיבוד.</li>
	<li>כדי להפעיל את הלייזר, לחץ על כפתור כיבוי לייזר , אשר יופיע לאחר מכן כלייזר על. עבור לתוכנת ההקלטה, בחר שם קובץ ולחץ על ה- הקלטה אדומה כפתור ואחריו לשחק כפתור בחלק העליון של החלון כדי להקליט את המדידה.</li>
	<li>רשום קו בסיס של 60 שניות לפני פתיחת התאים באמצעות הלייזר. חזור לתוכנת האתחול.</li>
	<li>השבת אלקטרודות כדי להיות נשלל על ידי הלייזר על המפה הווירטואלית בצד ימין באמצעות Ctrl + לחיצה על העכבר. בחר את האלקטרודות המעניינות על ידי הפעלתן על ייצוג המערך בצד ימין של חלון התוכנה.</li>
	<li>כדי להפעיל את הלייזר, השתמש Alt + לחץ על העכבר ובחר את האלקטרודה המרכזית של באר זו. פעולה זו מפעילה את הלייזר כדי לפתוח באופן אוטומטי את התאים על כל אלקטרודה של באר זו. חזרו על הפעולה עבור כל באר. לאחר מכן הלייזר יפתח את כל האלקטרודות שהופעלו בעבר של הבאר שנבחרה באופן אוטומטי.</li>
</ol>4. טיפול בסמים ויישום
<ol><li>הכן את כל החומרים שישמשו לבדיקות סמים טריות ביום המדידות. ודא שריכוז היישום הסופי גבוה פי 10 בבינוני כדי לבצע דילול של 1:10 בבארות.</li>
	<li>יש להמיס את Nifedipine, E4031 ו-Dofetilide תחילה ב-DMSO בריכוז mM, ולאחר מכן בהמשך בריכוז בינוני עד פי 10 מהריכוז הרצוי. לעולם אל תעלה על ריכוז DMSO סופי של 0.1% בבאר.</li>
	<li>הקלט את הפעילות הבסיסית במשך 60 שניות. הפעל את הפורציה המושרה בלייזר כמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול, וכתוצאה מכך טרנספורמציה של ה- FP לצורת liAP.</li>
	<li>החל את כל התרופות כריכוז יחיד לכל באר. הסר 20 μL של בינוני לכל באר עבור MEAs של 6 בארות ו- 100 μL עבור MEAs של באר יחידה, בהתאמה. הוסף 20 μL או 100 μL, בהתאם לסוג MEA, של תמיסת המלאי של התרופה להימדד לבאר בזהירות פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים. בצע לפחות שלושה שכפולים של כל תרופה וריכוז כדי להשיג רלוונטיות סטטיסטית.</li>
	<li>תנו לתרכובות להתרחץ פנימה במשך 300 שניות. במהלך תקופה זו, צורת ה-liAP עשויה להפוך בחזרה לצורת FP. שוב, לגרום לפורציה הנגרמת על-ידי לייזר ולרשום השפעות אפשריות הנגרמות על-ידי תרכובות על ה-liAP למשך 60 שניות נוספות.</li>
</ol>5. ייצוא נתונים
<ol><li>בחר אלקטרודות רלוונטיות על ידי השמעה חוזרת של ההקלטה בתוכנת ההקלטה. השתמש MC_DataTool כדי להמיר קבצי MC_Rack לקבצי ASCII .txt.</li>
	<li>לחץ על קובץ > פתח MCD > בחר קובץ MC_Rack. לחץ על כפתור txt (טקסט כחול).</li>
	<li>בחר אלקטרודה. האלקטרודה שנבחרה תוצג ברשימה בצד ימין.</li>
	<li>לחץ על עיון כדי לבחור את התיקיה ולשנות את שם קובץ .txt החדש. לחץ על שמור.</li>
	<li>בטל את הבחירה באלקטרודה המיוצאת ובחר את האלקטרודה הבאה לייצוא. חזור על ההליך עבור כל האלקטרודות המעניינות.</li>
</ol>6. טיפול בנתונים וניתוח סטטיסטי
<ol><li>ייבוא מעקבים בינאריים שהומרו ל- R19. הצג באופן חזותי/נתח את הנתונים באמצעות סקריפטים מותאמים אישית המכילים את החבילות הבאות: dplyr, tidyr ו- ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol><li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li>
<li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hERG+%28KCNH2+or+Kv11.1%29+K%2B+channels%3A+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li>
<li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li>
<li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Scholarpedia%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665(2008).</li>
<li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+arrhythmias%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li>
<li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MICE+models%3A+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100(2013).</li>
<li>Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+%28Propulsid%29%3A+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li>
<li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344(2014).</li>
<li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li>
<li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed%2C+bright%2C+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878(2019).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+sensors+with+living+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%22%5BJournal%5D)">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li>
<li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li>
<li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K%2B+current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Stem+Cell+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li>
<li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs%3A+importance+of+triangulation%2C+reverse+use+dependence%2C+and+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li>
<li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li>
<li>R Core Team. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing. , Vienna Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2021).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer-Verlag. New York. (2009).</li>
<li>Wickham, H., Girlich, M. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2022).</li>
<li>Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2021).</li>
<li>Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of calcium channel blockers.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 286(2017).</li>
<li>Vater, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+4-%282%27-nitrophenyl%29-2%2C6-dimethyl-1%2C4-dihydropyridine-3%2C5-dicarboxylic+acid+dimethyl+ester+%28Nifedipine%2C+BAY+a+1040%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arzneimittelforschung%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040).</a> Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).</li>
<li>Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+E-4031-sensitive+potassium+current+in+rat+carotid+chemoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+cardiac+%C2%B5GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li>
<li>Fendyur, A., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+on-chip%2C+in-cell+recordings+from+cultured+cardiomyocytes+by+arrays+of+gold+mushroom-shaped+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes.</a> Frontiers in Neuroengineering. 5, 21(2012).</li>
<li>Hayes, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+action+potential+measurements+from+intact+cardiac+monolayers+with+multiwell+microelectrode+array+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11893(2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטה חדשנית זו מדגימה דרך חדשה לחקור במבחנה את המודולציה הפרמקולוגית של פוטנציאל הפעולה הלבבי במהלך היישום של תרכובות כלים פרמקולוגיים קרדיואקטיביים.
הקלטות MEA קלאסיות מאפשרות הקלטות FP, שהן הנגזרת של AP14 הלב. הקלטה עקיפה זו מעוותת את מהלך הזמן של הדה-פולריזציה ובכך מבטלת מאפיינים חיוניים של ה-AP. יתר על כן, למרות ששינוי המתח הטרנס-תאי של נקודת גישה מגיע בדרך כלל לערכים של כ-100 mV, משרעת ה-FP הכוללת נשארת נמוכה יחסית, עם משרעת שיא בין מספר 100 μV וערכי mV חד-ספרתיים נמוכים. בשל עקרון ההקלטה, שלב ה-repolarizing הוא קטן; במקרים רבים, הוא רק ניתן לזיהוי ולעתים קרובות בעל צורה לא ברורה, מה שמקשה על הגדרת סוף ה- FP. פתיחת קרום התא מאפשרת לנו לקבל גישה למתח התוך תאי, ובכך לחשוף את מהלך הזמן של AP הלב. ישנם יתרונות מרובים של שיטת הקלטה זו בהשוואה להקלטות FP. ראשית, משרעת האות בולטת יותר, ומספקת יחס אות לרעש מעולה. שנית, צורת הגל גורמת לזיהוי טוב יותר של הרפולריזציה. שלישית, הצורה של שלב הרפולריזציה תורמת תובנות לגבי אופן הפעולה של תרכובת הבדיקה, המסופקת על ידי התלילות של הרפיית האות. ולבסוף, שיטה זו מציעה רגישות משופרת לזיהוי תופעות לוואי קריטיות של תרופות, המודגמת על ידי דוגמת ההקלטה המוצגת באיור 6 עבור התרחשות של EADs ב- liAP אך לא ב- FP.
עד כה, ישנן שתי דרכים לקבל גישה לנקודת הגישה התוך-תאית. הראשון מושג על ידי אלקטרופורציה26,27. כאן, פולסים קצרים וחזקים המופעלים באמצעות אלקטרודות ההקלטה יכולים לפתוח את קרום התא28. האפשרות השנייה היא פתיחת הממברנה באמצעות פולס לייזר, תוך שימוש בתופעה פיזיקלית בשם תהודת פלסמון פני השטח, כפי שהודגם כאן. אחד היתרונות בהשוואה לאלקטרופורציה הוא הסבירות המוגברת לפתיחות רצופות. בשל נקודת הלייזר הממוקדת מאוד (1-3 מיקרומטר) אפקט זה מוגבל מאוד מקומית לאלקטרודה המעניינת. מעניין, ההתחלה של liAP לא שינה את התפשטות האות של סינסיטיום מעובד. זה מצביע על כך, למרות שלמות התא פגום, cardiomyocytes לא נראה depolarize דרך החור בממברנה.
ישנן מגבלות לשיטה זו. כמו באלקטרופורציה, פתיחת הממברנה אכן נמשכת, ברוב המקרים, לאורך כל מסלול הניסוי. יש להגדיר את הגדרות ההספק ומשך הזמן המינימליים של פולס הלייזר הנדרשים לפתיחה יציבה של סוג העניין הספציפי של התא באופן עצמאי לפני הניסויים. מצאנו (לא מוצג) כי הפרמטרים משתנים באופן דרסטי בין סוגי תאים שונים (במקרה שלנו, כמה קרדיומיוציטים שמקורם ב- hiPS וראשוניים). זה מונע לחץ מיותר על התאים במהלך ניסוי הבדיקה המורכבת ומביא לנתונים אמינים יותר וניתנים לשחזור. יש חשיבות קריטית להתאמת ציר ה-z כך שיספק התמקדות ברורה בתאים ובאלקטרודות. תמונת מצלמה לא ממוקדת מניבה נקודת לייזר הממוקמת ברמה לא אופטימלית, מה שעלול לגרום לחוסר יכולת לפתוח את קרום התא. גם עם הפרמטרים המותאמים ביותר, אפקט ה- liAP הוא ארעי, והמשרעת פוחתת עם הזמן. יתר על כן, הגישה לחלל התוך-תאי של התאים משתנה בין אינדוקציות liAP, הן בתוך פתחים עוקבים באותה אלקטרודה והן בין אלקטרודות. התוצאה היא השתנות גבוהה של משרעת liAP. הסיבה עדיין לא מובנת במלואה. הסברים אפשריים כוללים בעיות מכניות כגון סחיפה של מוקד הלייזר או לוקליזציה תת-תאית שונה של פתח הממברנה. זה עושה את הניתוח של השפעות משרעת של תרכובות הבדיקה מסובך בנקודת זמן זו. כמו כן, הקלטת פעילות חשמלית על ידי מערכת MEA דורשת סינון מעבר גבוה כדי לפצות על סחיפה בסיסית בלתי נמנעת. למרות שבמערכת המשמשת כאן, סינון זה הוגדר ל-0.1 הרץ (הגדרת המסנן הנמוכה ביותר הזמינה עבור מערכת זו), השפעות הסינון במהלך שלב הרמה עדיין היו גלויות, וכתוצאה מכך מגמה איטית של סטיית המתח לכיוון קו הבסיס במהלך שלב הרמה של AP הלב. זה בעייתי במיוחד עם נקודות גישה בסיסיות ארוכות במיוחד כמו קרדיומיוציטים iCell2 שמקורם ב-iPSC המשמשים כאן, שכבר מייצרים AP >700 אלפיות השנייה בתנאי בקרה. השימוש במערכות עם סינון נמוך יותר עשוי לשמר טוב יותר את צורת ה-AP ולאפשר גישה טובה עוד יותר למהלך הזמן של שלב הרפולריזציה.

התרומה החשמלית של פעימת לב נובעת מיחסי גומלין מורכבים ומתוזמנים במדויק של תעלות לב ומובילים רבים, כמו גם התפשטות מכוונת במדויק של אותות חשמליים דרך שריר הלב1. שינוי במנגנונים המתואמים היטב הללו (למשל, שימוש בתרופות) עלול לגרום להשלכות חמורות על תפקוד הלב (כלומר, הפרעות קצב מסכנות חיים)2,3. הפרעות קצב מוגדרות כפעימות לב לא סדירות שמשנות את הקצב הרגיל של הלב, מה שעלול להיות בעל השלכות מסכנות חיים. הם עשויים להיגרם על ידי ייזום לקוי של גל של עירור לב או על ידי התפשטות חריגה של עירור לב4, אשר בתורו גורם לתפקוד לקוי של מנגנון שאיבה של הלב.
מועמדים רבים לתרופות חזקות מאוד חייבים להיות מודרים מחקירות נוספות בשלב פיתוח התרופה המוקדמת בשל הפוטנציאל הקצבי (הפרו-) שלהם 2,3. הם מווסתים תעלות לב מרכזיות (למשל, תעלת הגנים הקשורה לאתר אנושי [hERG]) האחראיות להיווצרות וסיום של פוטנציאל פעולה לבבי תקין, כמו גם להפצת אותות5 לאחר מכן.
חברות תרופות משתמשות באופן שגרתי במדידות מהדקי טלאים או במערכי מיקרואלקטרודות (MEA) כדי לחקור השפעות קרדיוטוקסיות פוטנציאליות מחוץ למטרה המושרות על ידי מועמדים לתרופות. הקלטות מהדקי טלאים מאפשרות לפענח את ההשפעה של חומרים על תעלות יונים לבביות ולנתח את פוטנציאל הפעולה הלבבי הטרנס-תאי ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה 6,7. עם זאת, החסרונות של טכניקה זו כוללים תפוקה נמוכה עם מהדק טלאי ידני וישימות מוגבלת של אוטומציה בשל התלות של שיטה זו על תאים בהשעיה. יתר על כן, לא ניתן לחקור השפעות כרוניות בשל הפולשנות של השיטה. לבסוף, בדרך כלל רק תאים בודדים נחקרים בו זמנית ולא כל הסינסיטיטיום הלבבי, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לטפל במידע על התפשטות האות.
צבעים רגישים למתח הם בעלי ערך לחקירה לא פולשנית של פוטנציאל פעולה לבבית והפרעות קצבהנגרמות על-ידי תרופות 8. הם מאפשרים לחקור הן פעילות של תא בודד והן של פעילות סינקליטיום. החסרונות של שיטה זו הם השפעות ציטוטוקסיות של הצבעים כשלעצמם או של תוצר התגובה במהלך התאורה. הם משמשים לניסויים אקוטיים וכמעט שאינם ישימים למחקרים ארוכי טווח 9,10,11. חלבונים רגישים למתח כחלופות התקדמו משמעותית בשנתיים האחרונות מבחינת שימושיות ורגישות אך דורשים שינוי גנטי של התאים המעניינים וחסרים רזולוציה טמפורלית גבוהה בהשוואה לטכניקות אלקטרופיזיולוגיות12.
מידע מיוזמת CiPAהאחרונה 13 קובע כי MEAs נמצאים בשימוש נרחב בבדיקות בטיחות לב כגישה אלקטרופיזיולוגית חלופית מכיוון שהם מייצגים כלי רב עוצמה ומבוסס היטב לחקר תפקוד הלב ופרמקולוגיה בטיחותית. קרדיומיוציטים מעובדים כסינסיטיום ישירות על גבי השבבים, ופוטנציאלי שדה חוץ-תאיים (FPs) נרשמים באופן לא פולשני באמצעות מיקרואלקטרודות משולבות מצע. עיקרון הקלטה זה מאפשר ביצוע בדיקות תפוקה מוגברות במשך מספר ימים, מה שהופך אותן למתאימות למחקר תרופתי על השפעות כרוניות. צורת הגל של FP המתקבלת היא נגזרת של AP14 התוך-תאי. פרמטרים כגון קצב פעימה, המשרעת של החלק הראשוני של FP, ומשך FP נגישים בקלות15. קריטריונים חיוניים אחרים כגון ההבחנה בין הארכה לטריאנגולציה של ה- FP (סמן חשוב של פרואריתמיה16,17) אינם נגישים בשל אפקט סינון AC של הטכניקה. יתר על כן, גילוי אירועים פרו-אריתמיים קטנים אחרים כגון אפטרפולריזציות מוקדמות ומושהות (EAD ו- DAD, בהתאמה) מתעלמים לעתים קרובות בקלות בשל המשרעת הקטנה שלהם.
כאן אנו מתארים שיטה להשגת גישה לפוטנציאל הממברנה התוך תאית על ידי פתיחת הממברנה של קרדיומיוציטים. התקן IntraCell (להלן התקן הקלטה תוך-תאי) מאפשר פתחי ממברנה חוזרים ונשנים של קרדיומיוציטים המעובדים על גבי אלקטרודות MEA באמצעות קרן לייזר ננו-שניה ממוקדת מאוד באמצעות תופעה פיזיקלית ספציפית (תהודת פלסמון פני השטח)18. כתוצאה מכך, ההקלטה עוברת מ-FP רגיל ל-AP תוך-תאי (AP, liAP המושרה על-ידי לייזר). הפרוטוקול מראה כיצד זה מאפשר לקבל גישה להיבטים קינטיים של צורת הגל שלא ניתן ללכוד בקלות על ידי ניתוח FPs. שיטה זו מהווה גשר בין מהדק טלאי תוך-תאי מסורתי לבין הקלטות MEA. הטכנולוגיה היא אפוא הרחבה רבת עוצמה של שיטות הערכת בטיחות הלב הנוכחיות.

<table><tbody><tr><td>1 באר שבב MEA</td><td>מערכות רב ערוציות MCS GmbH</td><td>890301</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות שבב MEA</td><td>מערכות רב ערוציות MCS GmbH</td><td>7600069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck KGaA</td><td>20-139 ממס סיגמא-אולדריץ'</td><td>לתרופות</td></tr><tr><td>Dofetilide</td><td>ALOMONE LABS מטה ישראל</td><td>D-100</td><td>מדידת תרופות</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>פישר סיינטיפיק GmbH</td><td>12037539</td><td>Coating</td></tr><tr><td>E4031</td><td>ALOMONE LABS מטה ישראל</td><td>E-500</td><td>מדידת תרופות</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>FB Alps גרסה 0.5.005</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Merck KGaA</td><td>11051407001</td><td>ציפוי</td></tr><tr><td>iCell קרדיומיוציטים</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>IntraCell</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CN09.1</td><td>לניקוי רפידות מגע MEA</td></tr><tr><td>תחזוקה בינונית</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)#M1003</td><td></td> <td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>כלי MC_Data</td><td>מערכות רב ערוציות MCS GmbH</td><td></td><td>ייצוא נתונים</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>מערכות רב ערוציות MCS GmbH</td><td></td><td>הקלטת MEA MEA</td></tr><tr><td>2100 - 2x60 - מערכת</td><td>מערכות רב ערוציות MCS GmbH</td><td>890485</td><td>להקלטות MEA</td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Merck KGaA</td><td>N7634 Sigma-Aldrich</td><td>ציפוי מדידת תרופות</td></tr><tr><td>בינוני</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>M1001</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>VWR International, LLC</td><td>1304-1</td><td>ניקוי של MEA</td></tr></tbody></table>

מדידות דמויות פוטנציאל פעולה המושרה בלייזר של קרדיומיוציטים במערכי מיקרואלקטרודות לחיזוי מוגבר של פרמקולוגיה בטיחותית

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

הפרעת קצב לב הנגרמת על-ידי תרופות מסכנות חיים קדמה לעתים קרובות לפוטנציאלים ממושכים של פעולת לב (AP), המלווים בדרך כלל בתנודות פוטנציאליות קטנות של קרום פרו-אריתמי. הצורה ומהלך הזמן של החלק המתרפס של נקודת הגישה יכולים להיות מרכזיים לנוכחות או היעדר הפרעות קצב.
מערכי מיקרואלקטרודות (MEA) מאפשרים גישה נוחה להשפעות של תרכובות קרדיוטוקסיות באמצעות פוטנציאלי שדה חוץ-תאיים (FP). למרות שמדובר בכלי רב עוצמה ומבוסס היטב במחקר ובפרמקולוגיה של בטיחות הלב, צורת הגל של FP אינה מאפשרת להסיק את צורת ה-AP המקורית בשל עקרון ההקלטה החוץ-תאית וסינון הזרם החלופי הפנימי (AC) שנוצר כתוצאה מכך.
מכשיר חדשני, המתואר כאן, יכול לפתוח שוב ושוב את הממברנה של קרדיומיוציטים המעובדים על גבי אלקטרודות MEA בנקודות זמן מרובות של טיפוח, באמצעות קרן לייזר ננו-שניות ממוקדת מאוד. פורציית הלייזר גורמת להפיכת האות האלקטרופיזיולוגי מ-FP ל-APs דמויי-תאים (AP, liAP המושרה על-ידי לייזר) ומאפשרת הקלטה של סטיות מתח טרנס-תאיות. גישה תוך-תאית זו מאפשרת תיאור טוב יותר של צורת ה-AP וסיווג טוב ורגיש יותר של פוטנציאלים פרו-קצביים מאשר הקלטות MEA רגילות. מערכת זו היא הרחבה מהפכנית לשיטות האלקטרופיזיולוגיות הקיימות, ומאפשרת הערכה מדויקת של השפעה קרדיוטוקסית עם כל היתרונות של הקלטות מבוססות MEA (ניסויים קלים, אקוטיים וכרוניים, ניתוח התפשטות אותות וכו ').

מערכת ההקלטה ששימשה להקלטת פעילות חשמלית מקרדיומיוציטים מעובדים כללה מערכת MEA סטנדרטית המצוידת בתנור חימום ותא קרבוגן המחובר למחשב. המערכת הונחה על גבי מכשיר ההקלטה התוך-תאי, אשר בתורו הורכב על גבי יחידה קטנה נגד רטט (איור 1A-B).
 קרדיומיוציטים 2 שמקורם ב-iPSC החלו לפעום באופן ספונטני תוך 2-3 ימים לאחר ההפשרה (ימים במבחנה, DIV) ונראו תחת מיקרוסקופ. מ-DIV 4 ואילך, תדר הפעימה הפך לקבוע, וניתן היה לזהות פוטנציאלי שדה חוץ-תאיים (FP) עם משרעת שיא לשיא של הרכיב הדה-פולריזציה בין 1 ל-5 mV ברוב האלקטרודות בתוך הבארות המתאימות של שבבי MEA. ניתן היה לזהות את הפעילות החשמלית ביותר מ-95% מהבארות הנחקרות. מ-DIV 7 ואילך, ההסתברות לניתוק תאים עלתה, מה שהפך את המשך השימוש בבארות אלה לבלתי אפשרי.
התוכנה לשליטה בפתח הממברנה המושרה בלייזר מאפשרת לכוונן הן את ההספק והן את זמן התהליך של הלייזר המתווך את פתיחת קרום התא רק על האלקטרודה הנחקרת (איור 1C), בעוד שאלקטרודות אחרות בבאר המתאימה אינן מושפעות. בעוד הגדרות שמרניות מדי לא שינו את צורת הגל של FP, הגדרות גבוהות מדי גרמו לפציעה פוטטיבית של הקרדיומיוציטים, המסומנים על ידי מכות נמרצות אך חולפות או אובדן של האות. כאשר התאים מותאמים להגדרה של 40% עוצמה וזמן תהליך של 25% הנסבלים היטב על-ידי התאים, הפעלת פולס הלייזר גרמה לשינויים מרובים בצורת הגל המוקלטת (ראו איור 1D להקלטה למופת). בתנאים אלה, לא נצפה שינוי בחומר האלקטרודה באופן מקרוסקופי. משרעת האות המוקלטת עלתה באופן מסיבי ב-4.1 ± 0.41 (n = 20, טווח 1.34-8.83) פעמים, נותחה מתת-קבוצה שנבחרה באקראי של הקלטות, וכתוצאה מכך אמפליטודות בין 7 ל-22 mV. יתר על כן, צורת הגל השתנתה מצורת FP סטנדרטית עם סטיית מתח מהירה, דו-פאזית וחולפת בהתחלה, ואחריה פאזה מישורית בחזרה בנקודת ההתחלה וסטייה קטנה המציינת את סוף ה-FP לצורה שהייתה קרובה יותר ל-AP שנרשם תוך-תאי עם עלייה מהירה, פאזה מורחבת של מישור דה-פולריזציה ושלב רפולריזציה עם תחתית מתחת לקו הבסיס (איור 1E ). הגדרנו את סטיות המתח האלה כנקודת גישה (liAP) הנגרמת על-ידי לייזר. ברוב המקרים, המעבר היה חולף והתהפך לפחות חלקית תוך 5 דקות. התפשטות האותות בתוך הסינסיטיום הלבבי נותרה ללא שינוי לאחר אינדוקציה של liAP (איור 2), מה שמצביע על כך שהסינקיטיום הנותר לא הושפע מנזק פוטנציאלי מפעימת הלייזר.
קווי דמיון לנקודות גישה שנרשמו תוך-תאיות אפשרו לחלץ פרמטרים של ה-liAP שאינם נגישים ל-FPs (עבור פרמטרים לדוגמה, איור 3A), ובראשם מדידת משך הזמן של ה-liAP בנקודות זמן ספציפיות (לדוגמה, ב-20%, 50% ו-90%) (איור 3B), המקבילה ל-APD20/50/90 המשמשות בדרך כלל לתיאור נקודות גישה.
לאחר מכן בדקנו את התגובה של הקרדיומיוציטים שנפתחו בלייזר לתרכובות נפוצות של כלים פרמקולוגיים קרדיואקטיביים. תכנון פרוטוקול למופת ניתן למצוא באיור 3C. מכיוון שהטרנספורמציה של ה-liAP לא תמיד נמשכה לאורך כל הניסוי, היישום המורכב בוצע כריכוז יחיד לבאר ולא באופן מצטבר כדי להפחית את זמן ההקלטה הכולל. עם זאת, היה צורך לפתוח מחדש את התאים או לפתוח אזור אלקטרודה אחר לפני החלת תרכובת הבדיקה.
התוספת של חוסם הערוצים Ca 2+ הספציפי מסוג L, Nifedipine23,24, הפחיתה את שלב הרמה של ה-liAP באופן תלוי ריכוז ובכך קיצרה את ה-liAP כולו (איור 4A,B). קיצור זה היה דומה לניתוח שהתקבל מ-FPs של קרדיומיוציטים מאלקטרודות לא מניפולטיביות (איור 4C), מה שמצביע על כך שלשיטת ההקלטה הזו לא היו השפעות שליליות בהשוואה להקלטות FP קלאסיות.
E4031 מעכב את הפולריזציה של ערוץ האשלגן הרלוונטי Kv1.11 (hERG)25 ומוביל להתנהגות קצבית של קרדיומיוציטים בריכוזים מוגברים. בדומה לניתוח שהתקבל מהקלטות FP, E4031 הגדיל את משך ה-liAP באופן תלוי ריכוז (איור 5). בנוסף, בריכוזים של 0.01 מיקרומטר ומעלה, נראו סטיות מתח חיוביות קטנות בקצה ה-liAP. הסטיות האלה נעשו בולטות יותר עם ריכוזים גבוהים יותר, מה שמעיד על דה-פולריזציה חדשה וחולפת, שלא כמו ב-FPs, שם הסטיות האלה היו כמעט בלתי נראות (ראו איור 5B-C, עקבות עליונים (FP) לעומת תחתונים (liAP). התנהגות זו ידועה בשם אפטר פולריזציה מוקדמת (EAD). בריכוז הגבוה ביותר של 0.1 מיקרומטר, EADs אלה הסלימו עם הזמן לפעימות חוץ רחמיות, שהן פוטנציאל פעולה מוקדם מדי (איור 5C). גם EAD וגם פעימות חוץ רחמיות הן אינדיקטורים מרכזיים לפעילות פרו-אריתמית. בסוף הדוגמה שמוצגת באיור 5D, הפעילות החשמלית גרמה לפעימות קצביות. כמו כן, יחסי ריכוז-תגובה-שהוצגו בין הקלטות FP ו-liAP היו תואמים (איור 5E). עם זאת, קיימת שונות ניכרת יותר בנתוני ה-FP כתוצאה ממרכיב הרפולריזציה החלש של ה-FPs בריכוזים גבוהים יותר של תרכובת הבדיקה. נראה כי האופי האופייני של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC2 נוטים ליצור APs ארוכים באופן לא פיזיולוגי בתנאי בקרה גם (משכי AP &gt; 700 אלפיות השנייה). מערכת MEA יישמה סינון AC פנימי של 0.1 הרץ, אשר בתורו הביא לצורה מסוננת חלקית של ה- liAP, אם כי מבלי להסתיר את המידע האיכותי על תחילת וסיום נקודת הגישה הבסיסית.
התברר כי המופע הראשוני של סטיות מתח פרו-אריתמי יכול להיות מזוהה בריכוזים נמוכים יותר ב- liAPs בהשוואה להקלטות FP. באיור 6 מוצגת הקלטה של פעילות חשמלית במהלך יישום דופטיליד בריכוז של 3 מיקרומטר. ההקלטה הושגה באותה באר. למרות שגם FP וגם liAP הציגו משכי זמן של כ-2 שניות, צורת הגל של FP לא הייתה פולשנית, והציגה סטיות רפולריזציה קבועות. במקביל, בסוף liAPs, EADs בגדלים שונים הפך גלוי. עלייה זו ברגישות הבטיחותית-פרמקולוגית הרלוונטית תומכת עוד יותר בממצא כי liAPs המושרים על ידי תהודה פלסמונית על פני השטח מאפשרים הכשרה משופרת של שלב ה-repolarizing ובכך מסייעים ללמוד יותר על אופן הפעולה של תרכובות הבדיקה הנחקרות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> איור 1: מערך ההקלטה התוך-תאית והקלטות המופת . (A) סקירה כללית של ההתקנה. (B) מבט עליון על מערכת ההקלטה עם מגבר הקלטה MEA פתוח. (C) תוכנת אתחול עם מפת MEA וירטואלית בצד ימין. 1: טבלת אנטי-רטט, 2: מערכת הקלטה תוך-תאית, 3: מכסה הגנה מפני לייזר, 4: תא קרבוגן לח, 5: מערכת חימום MEA, 6: לוח ממשק MEA, 7: שבב MEA 1-well בתוך מגבר ההקלטה. (D) הקלטת דוגמאות מאלקטרודה אחת לפני ואחרי אינדוקציה של liAPs. למעלה: הקלטה של כ-6 דקות. קווים מנוקדים מסמנים את האזורים המורחבים המוצגים בתחתית. (E) FP מוגדל (למעלה) ו-liAP (למטה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> איור 2: תבנית התפשטות האותות נשמרת לאחר אינדוקציה של liAP. קידוד צבע כוזב של התפשטות האות של גל העירור בתוך הסינסיטיום. כחול מציין מוקדם (החל מ -4 אלפיות השנייה); אדום מציין נקודות זמן מאוחרות (+3 אלפיות השנייה) מהאות המתקבל באלקטרודת ייחוס E54 כפי שמצוין בסרגל הצבע. האות נע מימין למעלה לשמאל למטה של מערך האלקטרודות. (A) לפני אינדוקציה של liAP, (B) דקה אחת לאחר אינדוקציה של liAP. (C) 4 דקות לאחר אינדוקציה של liAP. סמל הפלאש מציין את נקודת האינדוקציה של הלייזר באלקטרודה 64. שים לב שלא נראה הבדל בכיוון ההתפשטות הכולל. מלבנים שחורים מציינים נתונים לא חוקיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> איור 3: הגדרת פרמטר FP/liAP ופרוטוקול הקלטה . (A) פרמטרים שניתן לחלץ מה-FP הקלאסי. (B) פרמטרים נוספים שניתן לקבל מ-liAPs. (C) ציר הזמן של מדידת התרופה. משמאל לימין: הקלטת שליטה במשך 60 שניות, אינדוקציה של liAP, הקלטה של liAP במשך 60 שניות, יישום סמים, זמן שטיפה 300 שניות, אינדוקציה מחדש של liAP, הקלטה של liAP במשך 60 שניות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> איור 4: Nifedipine מקצר את ה-liAP הלבבי באופן תלוי ריכוז. (A) למעלה: עקבות FP בשליטה (כחול) ובנוכחות 0.3 μM Nifedipine (אדום). מעקבים מוצגים עם היסט ציר y לתצוגה חזותית טובה יותר. למטה: עקבות liAP מאותה הקלטת MEA, וכתוצאה מכך קיצור של ה-liAP בשילוב עם עלייה בקצב הפעימה. (B) סופרפוזיציה של liAPs בודדים במהלך בקרה (כחול) ויישום של ריכוזים שונים של Nifedipine (אדום). a: 0.01 μM, b: 0.1 μM, ו- c: 0.3 μM. שים לב לקיצור משך ה- liAP עם ריכוזים הולכים וגדלים. (C) יחסי ריכוז-תגובה של רוחב האות המתקבל מהקלטות FP (שחור) ו-liAP (אדום). הנתונים הם מניסויים n = 3 ומנורמלים לבקרה. קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> איור 5: E4031 משרה התנהגות ריתמית (פרו-). (A) FP (למעלה) ו-liAP (למטה) בתנאי בקרה. (ב-ג) FPs ו- liAPs נרשמו בנקודות זמן שונות לאחר החלת E4031 (0.1 μM). לאחר 80 שניות, ה- EADs הראשונים נראים בסוף ה- liAP (B; מסומן בחץ אדום). EADs הופכים לפעימות חוץ רחמיות לאחר 320 שניות בנוכחות תרכובת הבדיקה (C). (D) לאחר 530 שניות, הסינסיטיום הלבבי נכנס למצב טכיקרדי. עקבות המתוארים מהקלטת liAP. (E) יחסי ריכוז-תגובה של רוחב FP (שחור) ורוחב liAP (אדום). נתונים מ n = 4 ניסויים, מנורמל כדי לשלוט. קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> איור 6: זיהוי של אירועים פרו-אריתמיים רגיש יותר ב-liAPs מאשר ב-FPs . (A) הקלטת FP ו-(B) הקלטת liAP בתוך אותה באר במהלך יישום של 3 μM Dofetilide. בעוד שבסוף חלק מה-liAPs, EADs ניתנים לזיהוי, הם נשארים בלתי ניתנים לגילוי בהקלטות FP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

השילוב של מערכי פורציות לייזר ומיקרו-אלקטרודות (MEA) מאפשר הקלטות דמויות פוטנציאל פעולה של קרדיומיוציטים מעובדים שמקורם בתאי גזע ראשוניים. צורת הגל מספקת תובנה טובה יותר לגבי אופן הפעולה של תרכובות הבדיקה מאשר הקלטות סטנדרטיות. הוא מקשר בין מהדק טלאים וקריאת MEA כדי לייעל עוד יותר את מחקר הבטיחות האירובי בעתיד.

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

שיטה זו מאפשרת לתעד פוטנציאלי פעולה תוך-תאיים זהים ב-MEA'S מסורתיים, ובכך מאפשרת תיאור טוב יותר של צורת ה-AP וסיווג רגיש יותר של פוטנציאלים פרו-קצביים. בהשוואה להקלטות פוטנציאליות שדה טיפוסיות, הצורה הפוטנציאלית התוך-תאית מספקת תובנה רבה יותר לגבי ההרשאה המדויקת של תעלות היונים הבסיסיות. כאשר היא מיושמת על קרדיומיוציטים המופקים מחולים קליניים באמצעות טכנולוגיית תאי גזע, השיטה יכולה לתרום לאבחון סיבתי, והתאמה אישית של C R P ומחלות לב כמו הפרעות קצב הטכנאית שלנו, קארין גבהארדט תדגים את טיפוח הקרדיומיוציטים.כדי להתחיל לצפות את שדות האלקטרודות של ה-MEA's שהיו בעבר אוטוקלוויים, Dropwise עם פיברונקטין באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. כדי להפחית את הזעזוע האוסמוטי, העבירו את תמיסת הציפוי טיפה למשך 90 שניות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל קרדיומיוציטים מופשרים. הוסיפו בעדינות שמונה מיליליטר של מדיום ציפוי לתוך הצינור וערבבו היטב את השעיית התא.באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר, הסר את הסופרנטנט, תוך הקפדה שלא להשליך את הכדור ולהתאים את מספר התא לריכוז הסופי. לפני הישיבה בתא הסר את תמיסת הציפוי המיושמת מאזור האלקטרודה MEA באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר. כדי למנוע ייבוש של הציפוי זרעו התאים באופן מיידי על ידי הוספת ארבעה מיקרוליטרים של התאים על שדות האלקטרודה עבור שניהם, שש בארות MEA ובאר אחת M E A.Now, אפשרו לתאים להיצמד לבארות במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני.מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית, הוסיפו 200 מיקרוליטרים ומיליליטר אחד של ציפוי סטרילי בינוני מחומם ל-37 מעלות צלזיוס עבור שישה Well MEA, ו-MEA של באר אחת בהתאמה. עבור הקלטות MEA, הנח את מערכת MEA על גבי המכשיר כאשר מחזיק השבב MEA מרוכז מעל החור האובייקטיבי. לאחר מכן אפשר ללייזר להתמקד באלקטרודות על ידי מיקום מערך MEA, כך שהמטרה תהיה ישירות מתחת לחור של מערכת MEA.כדי לאפשר לתאים להתאושש מההפרעה המכנית, העבירו את שבב ה-MEA עם התאים המעובדים מהאינקובטור למערך ה-MEA 15 דקות לפני ההקלטה. לאחר מכן, נקה את רפידות המגע ואת הפינים בזהירות, באמצעות ספוגית איזופרופנול כדי להפחית את רמות הרעש. הנח את ה- MEA בזהירות במערך MEA, ומקם את שבב MEA שש בארות עם המספר הסידורי הנראה בצד ימין או שבב MEA יחיד היטב עם אלקטרודת הייחוס משמאל.כעת, הגדר את מערכת MEA לחימום משולב ל -38 מעלות צלזיוס. סגור את המכסה של ההתקן מכיוון שמתג הבטיחות המשולב מאפשר להפעיל את הלייזר רק אם המכסה סגור מעל שבב MEA. באמצעות תוכנית התצורה של MEA הגדר את מסנן מערכת MEA במעבר גבוה ובמעבר נמוך ל-0.1 הרץ או פחות ו-3, 500 הרץ בהתאמה.השתמש בתוכנת ארון התקשורת MC או בכל תוכנה חלופית להקלטה. התאם את טווח הקלט בהתאם לניסוי. הקפדה על כך שהאות לא ירווה את המגבר ואת קצב הדגימה.השתמש בפונקציית התצוגה ארוכת הטווח של התוכנה כדי לבדוק את ההקלטה. לאחר הכנסת שבב MEA להגדרת MEA, והגדרת התוכנה אתחל את מכניקת הלייזר באמצעות תוכנת FB ALP. כעת, לחץ על כפתור האתחול.בסוף האתחול נקודת הלייזר הווירטואלית תהיה בבאר D עבור MEA של שש בארות ובפינה השמאלית התחתונה עבור MEA באר אחת בהתאמה. לאחר מכן באמצעות מקש הבקרה בלחיצת עכבר הזז את נקודת הלייזר הווירטואלית לאמצע האלקטרודה D חמש והתאם את המיקוד על ידי החזקת מקש הבקרה וגלילה עם גלגל העכבר. לחלופין, השתמש בפונקציית המיקוד האוטומטי.לחץ על הלחצן הגדר P אחד, ונקודת הלייזר הווירטואלית תעבור באופן אוטומטי לתוך הבאר F.המערכת מיושרת כעת. התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן התהליך בהתאם לדרישות הניסוי. כדי להפעיל את הלייזר, לחץ על כפתור כיבוי הלייזר שיופיע כלייזר מופעל, עבור לתוכנת ההקלטה.בחר שם קובץ ולחץ על כפתור ההקלטה האדום ואחריו כפתור ההפעלה בחלק העליון של החלון כדי להקליט את המדידה. לפני פתיחת התאים עם הלייזר להקליט בסיס במשך 60 שניות. חזור לתוכנת האתחול והשבת אלקטרודות כדי שלא ייכללו בלייזר במפה הווירטואלית בצד ימין של חלון התוכנה.כדי להתחיל את הלייזר להשתמש Alt לחץ על העכבר, ובחר את האלקטרודה המרכזית של באר זו. זה יוזם את הלייזר לפתוח את התאים על כל אלקטרודה של באר זו באופן אוטומטי, לחזור על כל באר כדי לפתוח את כל האלקטרודות שהופעלו בעבר של באר זו שנבחרה. יש להמיס תחילה את הריכוז המילימולרי של Nifedipine E-40 31, ואת דופטיליד ב-DMSO, ולאחר מכן בריכוז בינוני שלם עד פי 10 מהריכוז הרצוי.לעולם אל תעלה על ריכוז DMSO סופי של 0.1% בבאר. הקלט את הפעילות הבסיסית למשך 60 שניות. התחל את הלייזר המושרה peration כפי שהודגם קודם לכן, וכתוצאה מכך להפוך את FPS לתוך liAPs.החל את כל התרופות כריכוז יחיד לכל באר. הסר 20 מיקרוליטרים ו -100 מיקרוליטרים של בינוני לכל באר משש בארות ובאר אחת של MEA בהתאמה. הוסף 20 מיקרוליטר או 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי התרופות שיש למדוד לבאר.בהתאם לסוג MEA, ובזהירות פיפטה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים. יש לאפשר לתרכובות להישטף פנימה למשך 300 שניות. במהלך תקופה זו, צורת ה-liAP עשויה להפוך לצורת FP.שוב, מושרה לייזר המושרה peration ולרשום פגמים אפשריים מורכבים המושרים על liAP במשך 60 שניות נוספות. התוספת של ניפדיפין הפחיתה את שלב הרמה של ה-liAPs באופן תלוי ריכוז, ובכך קיצרה את ה-liAP כולו. קיצור זה היה דומה לפוטנציאל השדה של קרדיומיוציטים מאלקטרודות לא מניפולטיביות.E-40 31 עיכב את הפולריזציה של KV רלוונטי נקודה אחת 11 תעלות אשלגן והוביל להתנהגות קצבית של קרדיומיוציטים בריכוזים מוגברים. כמו כן, E-40 31 הגדיל את משך ה- liAP באופן תלוי ריכוז. בסוף ה-liAP נצפו סטיות מתח חיוביות קטנות ב-0.1 מיקרומולר שהפכו לבולטות יותר עם ריכוזים גבוהים יותר, מה שמעיד על דה-פולריזציה חדשה וחולפת הנקראת EAD's.בריכוז הגבוה ביותר של 0.1 מיקרומולאר, EAD אלה הסלימו עם הזמן לפעימות חוץ רחמיות. שהם פוטנציאל פעולה מוקדם מדי. פעימות EAD וחוץ רחמיות הן אינדיקטורים מרכזיים לפעילות פרו-קצבית.ובסופו של דבר, הפעילות החשמלית גורמת למכות קצביות. קשרי תגובת הריכוז מתואמים עם הקלטות FP ו-liAP. יתר על כן, בנוכחות דופטיליד, הן FP והן liAP הציגו משכי זמן של כשתי שניות בתוך אותה באר, צורת הגל של FP הציגה סטיות רפולריזציה קבועות.בעוד ב liAP EAD של ניתנים לזיהוי. חשוב להתאים את המיקוד לפני כל מלומן, שכן תמונת מיקרוסקופ מחוץ למיקוד עלולה להשפיע על פתיחת התאים. כמו כן, פוטנציאל הפעולה נלקח זמן קצר לאחר opterperation יש להשתמש לניתוח.טכניקה זו רגישה יותר באיתור השפעות קצביות קודמות בהשוואה ל- MEA סטנדרטי, ומאפשרת זיהוי מדויק יותר של השפעות מורכבות שליליות.

laser-induced-action-potential-like-measurements-cardiomyocytes-on

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

אפיון אלקטרופיזיולוגי של cardiomyocytes הנגזר האדם בתאי גזע Pluripotent (hPSC-CMs) הוא קריטי עבור מודלים של מחלות לב ולקביעת תגובות סמים. פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתק צלחת hPSC-CMs על מערכים אלקטרודה רב, למדוד את פוטנציאל השדה שלהם, וכן שיטה לניתוח QT ו RR מרווחי.

ניתוח אלקטרופיזי של האדם Pluripotent גזע גזע נגזר Cardiomyocytes (hPSC-CMs) באמצעות מערכים אלקטרודה רב (MEAs)

כאן אנו מציגים שיטה אופטית התמונה פוטנציאל פעולה, במיוחד cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה דמוי חדרית. השיטה מבוססת על הביטוי מונחה המקדם של חלבון פלואורסצנטי רגיש מתח.

סוג משנה ספציפי פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות-אנוש המושרה Cardiomyocytes חדרית נגזר תאי גזע Pluripotent

מאמר זה מכיל קבוצה של פרוטוקולים לפיתוח של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע (היפנוsc-CM) רשתות המתורבתות על לוחות בעלי השפעה מרובת המידות כדי electroporate הפיך קרום התא עבור מדידות פוטנציאליות פעולה. הקלטות תפוקה גבוהה מתקבלות מאותם אתרי תא במשך ימים ברציפות.

האדם הנגזר iPSC האנטי נטוורקס רשתות על Multiwell מיקרו מערכים אלקטרודה לפעולה ונשנים הקלטות פוטנציאליות

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

אנו מציגים פרוטוקול להערכת ההשפעות האלקטרו-מאלקטרומכניים של הפעלת GtACR1 בקרדיוציטים בארנבים. אנו מספקים מידע מפורט על בידוד התא, culturing ו אדנונגיפי התמרה, ועל ניסויים פונקציונליים עם מלחציים טלאי וסיבי פחמן.

הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.

הקלטה של מערך Microelectrode של קצב הירי של צמת Sinoatrial כדי לזהות פגמים מהותיים בקצב הלב בעכברים

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל מבטיח במבחנה לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ומידול מחלות. כאן אנו מפרטים פרוטוקול למדידת התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה של hiPSC-CMs.

יישומים טכניים של מערך מיקרו-אלקטרודות והקלטות מהדקי טלאים על קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

למד שיטה חדשנית לרישום פוטנציאלי פעולה תוך-תאיים בקרדיומיוציטים באמצעות ניקוב לייזר ומערכי מיקרואלקטרודות. שיטה זו משפרת את הסיווג של פוטנציאלים פרוע-פרפורמיים ואת בטיחות התרופות בקרדיולוגיה.

מדידות דמויות פוטנציאל פעולה המושרה בלייזר של קרדיומיוציטים במערכי מיקרואלקטרודות לחיזוי מוגבר של פרמקולוגיה בטיחותית

גלה סרטונים נוספים