אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מספק שיטת פתרון מהירה וספציפית לגודל עבור שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות על ידי אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטריית זרימה. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסיות מייצגות של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות באמצעות פיזור קדמי לעומת פיזור גודל בלבד. התחל על-ידי ביצוע הליך ההפעלה הסטנדרטי של סדרן תאי הזרימה.

הפעל את ההתקן על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה ולאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה של הלייזר בלוח הבקרה של הלייזר. לחצו על כפתור החלפת המיכלים בתפריט המשנה Smart Sampler כדי להפעיל לחץ על הפלואידיקה. השתמש בזרבובית סילון ואוויר 50 מיקרומטר מנוקה באולטרסאונד והתקן אותו עד למכלול הזרבובית.

כוונן את הלחץ ל- 80 SI עבור נוזל נדן ו- 80.3 SI עבור זרימת הדגימה במסוף הלחץ. לחץ על לחצן זרימת הנדן כדי להתחיל את זרימת הנדן כדי להתחיל את זרימת הנדן. לחצו על לחצן הבועות בתפריט המשנה Smart Sampler כדי לבטל את הבועה באופן אוטומטי למשך 10 דקות ולאחר מכן כבו אותה.

כדי ליישר את הזרם ולקבוע את נקודת הלייזר, הפעל את אור תא ההארה כדי לראות את הזרם מעל חורי הסיכה. כוונן את המיקרומטרים למעלה ולמטה, שמאלה וימינה, ומלפנים ומאחור כדי למרכז את הזרם על חור הסיכה ולמקד את הזרם. פתח את כל תריסי הלייזר, בחר בכרטיסיה יירוט לייזר וזרם ולאחר מכן לחץ על לחצן החץ הירוק ברציפות כפי שתתבקש כדי להשלים את תהליך כיול יירוט הלייזר ויישור הזרבובית.

גש למסך יישור הלייזר העדין. בחר בלייזר בגודל 640 ננומטר ובערוץ פס פס 772 בר 44 כפרמטר ציר x ובפרמטר לייזר 405 ננומטר וערוץ פסים 448 בר 59 כפרמטר ציר Y. לחץ על בורר פרמטרי ההדק ובחר בפרמטר הפיזור קדימה של לייזר 488 ננומטר.

לאחר מכן, לדלל את חלקיקי הקשת הפלואורסצנטית על ידי הוספת טיפה אחת לתוך מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפול לריכוז סופי של אחד כפול 10 עד חרוז שישי למיליליטר. פתחו את דלת תא הדגימה וטענו שפופרת של חלקיקים פלואורסצנטיים מוכנים בקשת. לחץ על לחצן התחל דגימה וכוונן מיקרומטרים למעלה ולמטה כדי למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות, מה שהופך כל אות לאינטנסיבי ככל האפשר.

לחץ על לחצן התחל בקרת איכות או QC בלוח הבקרה של מסך המגע כדי לבצע QC באופן אוטומטי. לאחר מכן לחץ על לחצן אתחול IntelliSort. המכשיר מתאים באופן אוטומטי את התדירות והמשרעת של תנודת הטיפות כדי להשיג את עיכוב הירידה של כ -25 ולהיות מסוגל לדמיין את נקודת השבירה של הטיפה בבירור.

לאחר מכן, לחץ על כפתור עיכוב השחרור ועל כפתור התחזוקה. בחר צינור כסוג פלט המיון. מניחים מחזיק צינור 15 מיליליטר בתא המיון.

הפעל את מתח הצלחת והגדר את מתח הצלחת לכ- 4, 000 וולט. לאחר מכן, הפעל את תבנית הבדיקה על ידי בחירה בלחצן הגדרת הזרם. התאימו את מחוון פאזת הטעינה ואת מחוון הסטייה כדי לוודא שתמונת הזרם תואמת לצינור האיסוף.

לאחר מכן בחר בלחצן סימן הביקורת. התחברו לתחנת העבודה Summit במחשב. צור פרוטוקול חדש מהתפריט הראשי של הקובץ.

לאחר מכן צור תרשים נקודות על-ידי בחירת כרטיסיית ההיסטוגרמה בלוח הבקרה של תוכנת הפסגה. בחר 'פיזור קדימה' כפרמטר 'ציר x' ו'פיזור צד' כפרמטר 'ציר y'. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על ציר תרשים הנקודות החדש בסביבת העבודה והצג את הפיזור קדימה ואת הפיזור הצידי בצורה לוגריתמית.

בחר בכרטיסייה acquisition ואתר את חלונית פרמטרי הרכישה. הפעל את כל האותות בתפריט המשנה של פרמטרים מפעילים. בחר פיזור קדימה כפרמטר הגורם המפעיל והגדר סף של 0.01.

כוונן את המתח והרווח של פיזור קדמי ופיזור צדדי ב- 250 ו- 0.6 כדי להבטיח הפרדה בין אירועים בחלקת הפיזור הקדמי לעומת פיזור צדדי ואוכלוסיות. דללו את מיקרוספרות הפוליסטירן הפלואורסצנטיות לתרחיפים של 100, 200 ו-300 ננומטר על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של מיקרוספרות למיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן לטעון את השעיית microsphere ברציפות.

בחר התחל בתפריט הרכישה של Summit Software כדי להקליט 20, 000 אירועים ולאחר מכן לחץ על עצור לאחר הקלטת האירועים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תרשים נקודות הפיזור קדימה לעומת פיזור צדדי כדי ליצור מלבנים וגרור לשינוי גודל. מקם מחדש את אזורי הרעש האלקטרוני ואוכלוסיית המיקרוספירה בגודל 100 ננומטר על ידי לחיצה ימנית על האזורים כדי לשנות את שמם ל-R7 ו-R4 בהתאמה.

חזור על השלבים כדי למסגר את המיקרוספרות בגודל 200 ו- 300 ננומטר עם מלבנים ברצף, ושנה את שמם ל- R5 ו- R6 בהתאמה. לבסוף, קבע את אזור המיון של 50 עד 200 ננומטר בהתבסס על הרעש האלקטרוני והמיקום של חלקיקים של 200 ננומטר כדי להגדיר אותו כ- R8. ערוך החלטות מיון בחלונית לוגיקת מיון וסטטיסטיקה על-ידי לחיצה כפולה על השדה הריק של זרם שמאלי או L1 ובחירת האזור בשם R8 ליצירת לוגיקת המיון. בחר את מצב ההפלה של טוהר ובחר מעטפת טיפה מעל טיפה אחת עבור זרם L1.

טען דגימה של 500 מיקרוליטר של שלפוחיות חוץ-תאיות שהוכנו בעבר או תערובת EVs. לחץ על לחצן התחל תחת תפריט הרכישה ב- Summit כדי להשיג את הנתונים ולאחר מכן לחץ על עצור. לאחר מכן, לחץ על התחל בתפריט המיון כדי לאסוף שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות בגודל 50 עד 200 ננומטר או sEV לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

ניתוח ציטומטריית זרימה של מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי כדי לאתר את טווח הגדלים של 50 עד 200 ננומטר בחלקת הפיזור הקדמי לעומת הפיזור הצדדי גילה אותות חלקיקים מובחנים. R4, R5 ו-R6 מתייחסים למיקומם של חלקיקים בגודל 100, 200 ו-300 ננומטר בהתאמה. R7 הוא הרעש האלקטרוני כגבול הגילוי של חלקיקים 50 ננומטר ו-R8 מייצג את טווח המיקום של חלקיקים של 50 עד 200 ננומטר.

התפלגות גודל החלקיקים של תערובת כלי הרכב החשמליים שהופקה מתאי לבלב על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או NTA, הייתה בטווח רחב של 40 עד 400 ננומטר לאחר אולטרה-צנטריפוגה. מיון ציטומטרי זרימה בוצע כדי לבודד ולטהר את sEV 50 עד 200 ננומטר באזור R8. איכות הבידוד אומתה על ידי נת"ע ונמצא כי טווח גודל החלקיקים של sEV לאחר מיון היה בין 50 ל-200 ננומטר.

נוכחות של sEV נצפתה עוד יותר על ידי TEM וה- sEV המבודדים אושרו כמכילים סמנים של CD6, CD63 ו- CD81 על ידי Western Blot Analysis. שיטה זו מאפשרת הפרדה של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות וסיווג או ניתוח פרו טם של ביטוי גנים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות, מה שפותח יישומי מחקר רבים במורד הזרם.