Name: קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למד קינטיקה של אפטאמרים פלואורוגניים של RNA במבחנה ובתאים באמצעות קורא צלחות וציטומטריית זרימה. שיטות אלו מאפשרות מדידות כמותיות של אינטראקציות אפטאמר-צבע בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים ל- MCH: NSF-BSF 1815508 ו- NIH R01 GM124589. MRM נתמך חלקית על ידי מענק הכשרה NIH T32 GM122740.

<ol><li>Su, Y., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+small+molecules+and+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs.</a> Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+spinach+array+for+mRNA+Imaging+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells.</a> Scientific Reports. 5, 17295(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+spatial+complementation+of+aptamer-mediated+recognition+enables+live-cell+imaging+of+native+RNA+transcripts+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time.</a> Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).</li>
<li>Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+superfolding+Spinach2+reveals+the+dynamic+nature+of+trinucleotide+repeat-containing+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA.</a> Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).</li>
<li>Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+fluorescent+biosensors+for+live+cell+imaging+of+second+messengers+cyclic+di-GMP+and+cyclic+AMP-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).</li>
<li>Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidine+biosensors+enable+comparison+of+cellular+turn-on+kinetics+of+riboswitch-based+biosensor+and+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).</li>
<li>Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+fluorescent+biosensor+for+high-throughput+analysis+of+the+cGAS-cGAMP-STING+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway.</a> Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).</li>
<li>Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+RNA-based+fluorescent+biosensors+enable+anaerobic+detection+of+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 139(2016).</li>
<li>Paige, J. S., Thinh, N. -D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+cellular+metabolites+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA.</a> Science. 335 (6073), 1194(2012).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333 (6042), 642-646 (2011).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Basch, H., Gadebusch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antimicrobial+activity+of+dimethylsulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide.</a> Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).</li>
<li>Kallansrud, G., Ward, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+measured+and+calculated+single-+and+double-stranded+oligodeoxynucleotide+extinction+coefficients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients.</a> Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).</li>
<li>Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+thermal+hydrolysis+method+for+quantification+of+structured+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs.</a> RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).</li>
<li>Szatmári, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+concentrations+and+cation-dependent+remodelling+of+bacterial+MreB+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies.</a> Scientific Reports. 10, 12002(2020).</li>
<li>Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIVE%2FDEAD%C2%AE+BacLightTM%3A+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G-quadruplex-containing+RNA+activates+fluorescence+in+a+GFP-like+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).</li>
<li>Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+ligand+binding+and+complex+stabilization+of+the+RNA+Mango+and+RNA+Spinach+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers.</a> RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+photophysics+of+the+Spinach-DFHBI+RNA+aptamer-fluorogen+complex+to+improve+live-cell+RNA+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+properties+of+Spinach+and+its+use+in+selective+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging.</a> Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).</li>
<li>Dao, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+DFHBI+bound+to+RNA+aptamer+Baby+Spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach.</a> Scientific Reports. 11, 7356(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

עבור ניסוי הקינטיקה במבחנה, ניתן לשנות את אותו פרוטוקול כללי כדי למדוד את הקינטיקה במבחנה של ביוסנסור פלואורסצנטי מבוסס RNA המכיל גם תחום קושר ליגנד וגם תחום קושר פלואורופור 8. במקרה זה, יש לדגור את הרנ"א עם הפלואורופור לפני המדידות בעת הזרקת הליגנד על מנת לקבל קינטיקה של תגובת ליגנד. אם נצפתה שונות גבוהה בין המשכפלים, ניתן לפתור בעיות על ידי בדיקה שכל דגימה מותרת לשיווי משקל למשך אותה כמות זמן בלוח 96 הבאר לפני המדידה. כל דגימה או שכפול צריכים להיות מוכנים בנפרד בבאר ולמדוד מיד...

תגובות פלואורוגניות הן תגובות כימיות היוצרות אות פלואורסצנטי. אפטאמרים פלואורוגניים של RNA בדרך כלל מבצעים את הפונקציה הזו על-ידי קשירת צבע מולקולה קטנה כדי לשפר את התפוקה הקוונטית הפלואורסצנטית שלה (איור 1A)1. פותחו מערכות אפטמר RNA פלואורוגניות שונות המורכבות מרצפי RNA אפטמר ספציפיים ומליגנדות הצבעהמתאימות 1. אפטאמרים של RNA פלואורוגניים צורפו לתעתיקי RNA כתגי פלואורסצנט המאפשרים הדמיה של תאים חיים של mRNA ו-RNAsשאינם מקודדים 2,3,4. הם גם הוצבו לאחר רצפי מקדמים כמדווחים פלואורסצנטיים של ביטוי גנים, בדומה לשימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמדווח, אלא שפונקציית הדיווח היא ברמת RNA 5,6. לבסוף, אפטאמרים של RNA פלואורוגניים שולבו בביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA, שנועדו לעורר את התגובה הפלואורוגנית בתגובה למולקולה קטנה ספציפית. ביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA פותחו להדמיית תאים חיים של מטבוליטים שונים שאינם פלואורסצנטיים ומולקולות איתות 7,8,9,10,11.
יש עניין גובר בפיתוח אפטמרים של RNA פלואורוגניים כדי לדמיין שינויים דינמיים בלוקליזציה של RNA, ביטוי גנים ואותות של מולקולות קטנות. עבור כל אחד מהיישומים הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך הדיוק של המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית להיות מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה במבחנה עבור רנ"א פלואורוגני אפטאמרים תרד2 12 וברוקולי13 באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה ולקביעת הקינטיקה הדלקתית התאית עבורתרד2 המתבטאת ב-Escherichia coli באמצעות ציטומטר זרימה. שני אפטאמרים אלה של RNA נבחרו מכיוון שהם יושמו כדי לחקור לוקליזציה של RNA 2,3,4, הם שימשו בכתבים 5,6 וביוסנסורים 7,8,9,10,11, וליגנדות הצבע המתאימות (DFHBI או DFHBI-1T) זמינות מסחרית. סיכום של תכונותיהם במבחנה שנקבעו בספרות מובא בטבלה 1 4,13,14, אשר ביססה את התפתחות הפרוטוקול (למשל, אורכי הגל וריכוזי הצבעים שבהם נעשה שימוש). תוצאות אלה מראות כי התגובות הפלואורוגניות המושפעות מאפטאמרים של RNA הן מהירות ואינן אמורות לעכב מדידות מדויקות עבור היישומים הביולוגיים הרצויים של התא.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>BP160500</td><td></td></tr><tr><td>ציוד אלקטרופורזה ג'ל Agarose Thermo</td><td>Fischer Scientific</td><td>B1A-BP</td><td></td></tr><tr><td>Alpha D-(+)-לקטוז מונוהידראט</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18-600-440</td><td></td></tr><tr><td>ענבר 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה Thermo</td><td>Fischer Scientific</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום סולפט ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT זרימה ציטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A24861</td><td></td></tr><tr><td>Attune 1x נוזל מיקוד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>A24904</td><td></td></tr><tr><td>Attune פתרון כיבוי</td><td>תרמו Fischer Scientific</td><td>A24975</td><td></td></tr><tr><td>Attune חרוזי מעקב אחר ביצועים</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4449754</td><td></td></tr><tr><td>Attune Wash Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>&nbsp; J24974</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>מלח דיסודיום קרבניצילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה כלור</td><td>אמזון</td><td>B07J6FJR8D</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר 96 בארות</td><td>צלחת דייגר סיינטיפיק</td><td>EF86610A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית, 12 מ"מ x 75 מ"מ, 5 מ"ל עם מכסה מיקום כפול מחובר</td><td>גלובוס סיינטיפיק</td><td>05-402-31</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td> SML2697-D-גלוקוז <td></td></tr><tr><td>(נטול מים)</td><td>Acros Organics</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>DNA טוען צבע</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind צינורות (2.0 מ"ל)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8.0</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטור קצה מסנן</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12635, AM12648, AM12655, AM12665</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>FlowJo v10 תוכנה</td></tr><tr><td>קורא צלחות פלורסנט עם בקרת חימום</td><td>VWR</td><td>10014-924</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח אלקטרופורזה ג'ל</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>EC3000XL2</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן AM95010</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM95010</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td> תוכנת ניתוח <td>N/A</td><td>מבית Academic Group License&nbsp;</td></tr><tr><td>בלוק חום&nbsp;</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1159Z11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>פירופוספאטאז אנאורגני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA במשקל מולקולרי נמוך</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N3233L</td><td>מסופק עם בקבוקון חינם של צבע טעינת ג'ל, סגול (6x), ללא SDS (NEB #B7025).</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4)</td><td></td>צינורות מיקרוצנטריפוגה <td>של Fisher Scientific</td> MFCD00011110 <td></td></tr><tr><td>(1.5 מ"ל)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה עם בקרת טמפרטורה</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטורים</td><td>Gilson</td><td>FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטור</td><td>מסנן מים Sigma-Aldrich</td><td>Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR</td><td></td></tr><tr><td>Millipore עם יחידת BioPak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDUFBI001, ZRQSVR3WW</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה מיקרופיפטור צרים</td><td>DOT Scientific</td><td>RN005R-LRS</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>תרמו פישר ערכת</td> ניקוי <td>BP39920</td><td></td></tr><tr><td>מדעית PCR</td><td>Qiagen</td><td>28181</td><td></td></tr><tr><td>PCR פריימרים ותבניות</td><td>טכנולוגיות DNA</td><td></td><td></td>משולבות</tr><tr><td>PCR תרמו-ציקלר לצינורות PCR דקי דופן</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermocycler לצינורות 0.5 מ"ל</td><td>Techne</td><td>5PRIME/C</td><td></td></tr><tr><td>pET31b-T7-Spinach2</td><td>Plasmid Addgene</td><td>פלסמיד #79783</td><td></td></tr><tr><td>פולימראז DNA בנאמנות גבוהה&nbsp;</td><td>רכישת New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>של אנזים נאמנות גבוהה של Phusion מסופקת עם 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer ו-MgCl2 ופתרונות DMSO.</td></tr><tr><td>מסרק ג'ל אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, C.B.S. Scientific</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>VGC-1508</td><td></td></tr><tr><td>ציוד אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>Genesee מדעי</td><td>38-101</td><td></td></tr><tr><td>rNTPs: ATP, CTP, GTP,</td><td>UTP מעבדות ביולוגיות ניו אינגלנד</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור UV גל קצר</td><td>תרמו פישר</td><td>11758221</td><td></td>מדעי</tr><tr><td>נתרן פחמתי (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד (NaCl)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי, נטול מים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S375-500</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>N/A</td><td>SoftMax Pro 6.5.1 (תוכנת קורא צלחות) שהושגו באמצעות רישיון קבוצה אקדמית</td></tr><tr><td>יחידות סינון סטריליות</td><td>תרמו Fischer Scientific</td><td>09-741-88</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>מאגר TAE לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון (מגורען)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ג'ל אוריאה-PAGE&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td></td></tr><tr><td>UV פלואורסצנטי TLC צלחת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.05789.0001</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV/Vis</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>תרמו פישר 2215415</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>קסילן ציאנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים (מגורענת)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של rna פלואורוגניים

Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers

אפטאמרים פלואורוגניים של RNA יושמו בתאים חיים כדי לתייג ולהמחיש רנ"א, לדווח על ביטוי גנים ולהפעיל ביוסנסורים פלואורסצנטיים המזהים רמות של מטבוליטים ומולקולות איתות. על מנת לחקור את השינויים הדינמיים בכל אחת מהמערכות הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך דיוק המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית שתהיה מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה החוץ-גופית והתאית עבור אפטאמרים פלואורוגניים של RNA באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה וציטומטר זרימה, בהתאמה. אנו מראים כי ניתן למדל את הקינטיקה במבחנה עבור הפעלת הפלואורסצנציה של האפטמרים תרד2 וברוקולי כתגובות אסוציאציה דו-פאזיות ויש להם קבועי קצב פאזה מהירים שונים של 0.56 s−1 ו- 0.35 s−1, בהתאמה. בנוסף, אנו מראים כי הקינטיקה התאית להפעלת פלואורסצנטיות של תרד2 ב-Escherichia coli, המוגבלת עוד יותר על ידי דיפוזיית צבע לחיידקים גראם-שליליים, עדיין מהירה מספיק כדי לאפשר תדירות דגימה מדויקת על ציר הזמן הדק. שיטות אלה לניתוח קינטיקה של הפעלת פלואורסצנציה ישימות לאפטמרים פלואורוגניים אחרים של RNA שפותחו.

קינטיקה במבחנה הרצפים של תבניות הדנ"א והפריימרים, שנרכשו כאוליגונוקלאוטידים סינתטיים, מוצגים בטבלה 2, ומתכוני הריאגנטים מוצגים בקובץ משלים 1. הגברת PCR משמשת להגדלת כמות תבנית הדנ"א באמצעות מקדם T7, הנדרש לתגובת השעתוק במבחנה (IVT) הבאה. בנוסף, ניתן להשתמש בהגברת PCR לשתי מטרות באותה תגובה: ליצור את תבנית הדנ"א של ברוקולי באורך מלא על ידי הרחבת פריימר, כמו גם להגדיל את תבנית הדנ"א.
לאחר תגובת ה- IVT לסינת...

הפרוטוקול מציג שתי שיטות לקביעת הקינטיקה של הרנ"א הפלואורוגני אפטאמרים תרד2 וברוקולי. השיטה הראשונה מתארת כיצד למדוד קינטיקה פלואורוגנית של אפטמר במבחנה באמצעות קורא צלחת, ואילו השיטה השנייה מפרטת את מדידת הקינטיקה הפלואורוגנית של אפטמר בתאים על ידי ציטומטריה של זרימה.

קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים

Fluorogenic RNA aptamers have been applied in live cells to tag and visualize RNAs, report on gene expression, and activate fluorescent biosensors that ...

מחקר במבחנה וקינטיקה פלואורוגנית תאית מאפשר למשתמש להעריך אם אינטראקציות צבע אפטמר מהירות מספיק כדי לחקור תהליך של עניין בזמן אמת. הטכניקות המוצגות מאפשרות מדידות קינטיות כמותיות בתוך התא ומחוצה לו, שכל אחת מהן יכולה להיות רלוונטית בהתאם ליישום של האפאמר. השיטות המוצגות יכולות להיות מיושמות על כל מערכת RNA פלואורוגנית, כולל אפטמרים חלופיים וביוסנסורים מבוססי RNA עבור מולקולות קטנות.כדי להתחיל, הגדר את תוכנית רנטורציה RNA מהתרמוציקלר. צור את התוכנית על ידי בחירה באפשרות צור תוכנית חדשה "הוסף שלב חדש" והוסף שלב חדש"מספר פעמים כדי להוסיף שלבים ספציפיים לטמפרטורה לפני לחיצה על שמור"התאם הגדרות נוספות בהתאם לתוכנית. כדי לחדש את התרד 2 ואת ה-RNA של ברוקולי, הכינו שני גבעולי מיקרומולר של כל רנ"א במים מזוקקים כפולים בצינור PCR דק של 0.5 מיליליטר.לאחר מכן הוסיפו נפחים שווים של מאגר רנטורציה של שני x כדי ליצור תמיסת RNA מיקרומולרית אחת. הכניסו את הצינורות לתוך התרמו-ציקלר. פתח את תוכנית הרנטורציה שנשמרה ולחץ על הפעלה"הבא, הגדר את תוכנית מזרק קורא הצלחות.בקורא הלוחות הפלואורסצנטיים, בחר טמפרטורה" והגדר אותה ל-37 מעלות צלזיוס. לפני תחילת הקינטיקה, ודא שהטמפרטורה התאזן לערך זה. פתח את תוכנת קורא הלוחות.בחר הגדרות"ולאחר מכן תצוגת רכישה"כדי להזין את התוכנית למדידות קינטיות, בחר לולאה"עבור כל באר. לאחר מכן, הגדר את הגדרת הבסיס ל-60 קריאות בסיסיות והגדרות הזרקה חכמה להזרקה של 10 מיקרוליטר. הגדר את אורך גל העירור הפלואורסצנטי ל-448 ננומטר, את אורך גל הפליטה ל-506 ננומטר ואת המחסנית למונו.הגדר את זמן הקריאה הכולל ל- 10 דקות עם מרווח קריאה של 0.5 שניות. הגדר את PMT ואת האופטיקה לשישה הבזקים לכל קריאה. לאחר מכן לולאת קלט לבאר הבאה.כדי להכין את מזרק קורא הצלחות בחר להזריק "על קורא הלוחות" ולספק צלחת איסוף פסולת כאשר מכוון. לאחר מכן בחר לשטוף" ונקה את צינור ההזרקה לפי ההוראות בקורא הצלחת עם נפח מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים, 75% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים. לאחר מכן בחר שאף"המאפשר למזרק להוציא נוזלים עודפים.לאחר מכן בחר פריים" כדי להקדים את המזרק עם שני 260 מיקרוליטרים של 100 מיקרומולר D F H B I.To לבצע ניסוי קינטיקה אחד להוסיף 80 מיקרוליטר של תערובת מאסטר חיץ מחייב לבאר אחת של צלחת תחתית ברורה היטב 96. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של RNA renatured. אפשרו לצלחת ולתמיסת D F H B I במזרק, להגיע לשיווי משקל ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר מכן, בחר את הבאר לניתוח בהגדרות התוכנה תחת אזור הקריאה. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה בית, בחר הפעל"כדי להפעיל את תוכנית הקינטיקה שתוארה קודם לכן. חזור על תהליך זה עד להשלמת כל הניסויים.לאחר הריצה, יש לשטוף את המזרק כדי להסיר את התמיסה הנותרת D F H B I מצינור ההזרקה כפי שהודגם קודם לכן. כדי להגדיר את הקבצים הניסיוניים הפעל את ציטומטר הזרימה ואת המחשב. צור קובץ חדש בכרטיסייה סייר הניסויים על ידי לחיצה ימנית על שם המשתמש של ציטומטר הזרימה.לאחר מכן בחר ניסוי חדש"בחלון הנפתח וכאשר חלון חדש במסך המחשב צץ, בחר סוג ניסוי כצינורות"ולאחר מכן בחר בסדר"בקובץ הניסוי החדש לחץ לחיצה ימנית על תיקיית הקבוצה ובחר הוסף צינור דגימה חדש"תייג את צינורות הדגימה עבור כל נקודת זמן ספציפית ושכפל על ידי לחיצה ימנית על הדגימה"ובחירה שינוי שם" בתפריט הנפתח. לאחר מכן, הכן תמיסת תאים מדוללת על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של X P B S אחד ושלושה מיקרוליטרים של תאים מושרים במדיית AI בצינור תרבית. לפני הוספת צבע, מדוד את פלואורסצנטיות הרקע של התאים כדי לראות את הקפל מופעל לאורך זמן.לאחר הוספת הצבע מניחים את צינור התרבית המכיל תאים ב- P B S לתוך מרים צינור הדגימה ומעלים את המרים למחט הזרקת הדגימה. לאחר מכן בחר את קובץ הדגימה המתאים בכרטיסיית לוח האיסוף ולחץ על הקלט "לאחר השלמת הריצה הורד את מרים צינור הדגימה עם צינור התרבית ביד. כדי ליזום שלב שטיפה, כדי לשטוף את המערכת הנוזלית, ולמזער את הנשיאה בין כל דגימת שכפול ביולוגית.כדי לעבור לדוגמה הבאה, בחר את הקובץ לדוגמה הבא על-ידי לחיצה על סמל החץ ימינה ליד שם צינור הדגימה מתחת לסמל הרשומה. כדי למדוד את הפלואורסצנטיות של תאים עם צבע להוסיף 1.4 מיקרוליטר של מלאי צבע מרוכז לתוך אחד X P B S עם תאים, כדי לתת ריכוז סופי של 50 micromolar D F H B I אחד T.לאבטח את מכסה צינור התרבית ולהפוך שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב את התמיסה באופן שווה. לאחר מכן, הסר את המכסה והנח את צינור התרבית לתוך מרים צינור הדגימה.לאחר הרמת המחזיק למחט הזרקת הדגימה, לחץ על סמל הרשומה מתחת לקובץ הדגימה המתאים. לאחר מכן, התחל טיימר על ידי לחיצה על start"In vitro kinetics של תרד אפטמרס פלואורוגני 2 וברוקולי, הציג קינטיקה אסוציאציה דו פאזית לקשירת צבע D F H B I. עבור שני האפטמרים, נתוני הקינטיקה הותאמו טוב יותר על ידי אסוציאציה דו-פאזית מאשר חד-פאזית בזמני מדידה ארוכים.עקומת ההתאמה הטובה ביותר קבעה את קבועי הקצב ואת ערכי מחצית החיים עבור האסוציאציות המהירות והאיטיות. תרד שני במצב כשירות הכריכה, הראה הפעלה מהירה יותר מאשר ברוקולי. הקינטיקה של השלב השני עבור שני האפטמרים דומה ועשויה להתאים לשלב משותף המגביל את הקצב.העקומות הקינטיות של האפטמרים מורכבות ממידה דומה של רנ"א המקשר במהירות. עבור תאים המבטאים תרד שני T RNA, עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת או M F I עולה מיד בנקודת זמן אפסית. יתר על כן, הפלואורסצנטיות התאית הגיעה לערך M F I המקסימלי שלה תוך חמש דקות.לעומת זאת, תאי בקרה הראו פלואורסצנטיות נמוכה ברקע וללא שינוי בערכי M F I עם תוספת D M S O השיטות המוצגות מאפשרות לחוקרים לקבוע כיצד הם יכולים ליצור חיישנים מבוססי RNA באפטמרים פלואורוגניים מהר יותר.

determination-vitro-cellular-turn-on-kinetics-for-fluorogenic-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

אנו מתארים את ההנדסה של פולימראז T7 RNA חדשני הקשור לדנ"א כדי לווסת את תגובות התמלול במבחנה. אנו דנים בצעדים לסינתזה ואפיון חלבונים, מאמתים רגולציה של תמלול הוכחת הרעיון, ודנים ביישומיה במחשוב מולקולרי, אבחון ועיבוד מידע מולקולרי.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.

זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר מדידת פלואורסצנציה כמותית לאורך החיים של גשושי ריבוגלו עבור תהליכי דימות RNA ניתנים לשחזור במבחנה, בתאי יונקים חיים, ובמודלים תלת-ממדיים תלת-ממדיים. אנו מתכננים תהליכי הכנת דגימות, אספקת גשושים, איסוף נתונים וניתוח כמותי להפקת מדידות חיים של פלואורסצנציה בלתי מוטה.

אפיון גשושי ריבוגלו במבחנה כבסיס להדמיה פלואורסצנטית לאורך חיים בתאים חיים ביונקים ובמודלים תלת-ממדיים של תאים

למד קינטיקה של אפטאמרים פלואורוגניים של RNA במבחנה ובתאים באמצעות קורא צלחות וציטומטריית זרימה. שיטות אלו מאפשרות מדידות כמותיות של אינטראקציות אפטאמר-צבע בזמן אמת.

קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים

גלה סרטונים נוספים