קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים

מחקר במבחנה וקינטיקה פלואורוגנית תאית מאפשר למשתמש להעריך אם אינטראקציות צבע אפטמר מהירות מספיק כדי לחקור תהליך של עניין בזמן אמת. הטכניקות המוצגות מאפשרות מדידות קינטיות כמותיות בתוך התא ומחוצה לו, שכל אחת מהן יכולה להיות רלוונטית בהתאם ליישום של האפאמר. השיטות המוצגות יכולות להיות מיושמות על כל מערכת RNA פלואורוגנית, כולל אפטמרים חלופיים וביוסנסורים מבוססי RNA עבור מולקולות קטנות.

כדי להתחיל, הגדר את תוכנית רנטורציה RNA מהתרמוציקלר. צור את התוכנית על ידי בחירה באפשרות צור תוכנית חדשה "הוסף שלב חדש" והוסף שלב חדש"מספר פעמים כדי להוסיף שלבים ספציפיים לטמפרטורה לפני לחיצה על שמור"התאם הגדרות נוספות בהתאם לתוכנית. כדי לחדש את התרד 2 ואת ה-RNA של ברוקולי, הכינו שני גבעולי מיקרומולר של כל רנ"א במים מזוקקים כפולים בצינור PCR דק של 0.5 מיליליטר.

לאחר מכן הוסיפו נפחים שווים של מאגר רנטורציה של שני x כדי ליצור תמיסת RNA מיקרומולרית אחת. הכניסו את הצינורות לתוך התרמו-ציקלר. פתח את תוכנית הרנטורציה שנשמרה ולחץ על הפעלה"הבא, הגדר את תוכנית מזרק קורא הצלחות.

בקורא הלוחות הפלואורסצנטיים, בחר טמפרטורה" והגדר אותה ל-37 מעלות צלזיוס. לפני תחילת הקינטיקה, ודא שהטמפרטורה התאזן לערך זה. פתח את תוכנת קורא הלוחות.

בחר הגדרות"ולאחר מכן תצוגת רכישה"כדי להזין את התוכנית למדידות קינטיות, בחר לולאה"עבור כל באר. לאחר מכן, הגדר את הגדרת הבסיס ל-60 קריאות בסיסיות והגדרות הזרקה חכמה להזרקה של 10 מיקרוליטר. הגדר את אורך גל העירור הפלואורסצנטי ל-448 ננומטר, את אורך גל הפליטה ל-506 ננומטר ואת המחסנית למונו.

הגדר את זמן הקריאה הכולל ל- 10 דקות עם מרווח קריאה של 0.5 שניות. הגדר את PMT ואת האופטיקה לשישה הבזקים לכל קריאה. לאחר מכן לולאת קלט לבאר הבאה.

כדי להכין את מזרק קורא הצלחות בחר להזריק "על קורא הלוחות" ולספק צלחת איסוף פסולת כאשר מכוון. לאחר מכן בחר לשטוף" ונקה את צינור ההזרקה לפי ההוראות בקורא הצלחת עם נפח מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים, 75% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים. לאחר מכן בחר שאף"המאפשר למזרק להוציא נוזלים עודפים.

לאחר מכן בחר פריים" כדי להקדים את המזרק עם שני 260 מיקרוליטרים של 100 מיקרומולר D F H B I.To לבצע ניסוי קינטיקה אחד להוסיף 80 מיקרוליטר של תערובת מאסטר חיץ מחייב לבאר אחת של צלחת תחתית ברורה היטב 96. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של RNA renatured. אפשרו לצלחת ולתמיסת D F H B I במזרק, להגיע לשיווי משקל ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, בחר את הבאר לניתוח בהגדרות התוכנה תחת אזור הקריאה. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה בית, בחר הפעל"כדי להפעיל את תוכנית הקינטיקה שתוארה קודם לכן. חזור על תהליך זה עד להשלמת כל הניסויים.

לאחר הריצה, יש לשטוף את המזרק כדי להסיר את התמיסה הנותרת D F H B I מצינור ההזרקה כפי שהודגם קודם לכן. כדי להגדיר את הקבצים הניסיוניים הפעל את ציטומטר הזרימה ואת המחשב. צור קובץ חדש בכרטיסייה סייר הניסויים על ידי לחיצה ימנית על שם המשתמש של ציטומטר הזרימה.

לאחר מכן בחר ניסוי חדש"בחלון הנפתח וכאשר חלון חדש במסך המחשב צץ, בחר סוג ניסוי כצינורות"ולאחר מכן בחר בסדר"בקובץ הניסוי החדש לחץ לחיצה ימנית על תיקיית הקבוצה ובחר הוסף צינור דגימה חדש"תייג את צינורות הדגימה עבור כל נקודת זמן ספציפית ושכפל על ידי לחיצה ימנית על הדגימה"ובחירה שינוי שם" בתפריט הנפתח. לאחר מכן, הכן תמיסת תאים מדוללת על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של X P B S אחד ושלושה מיקרוליטרים של תאים מושרים במדיית AI בצינור תרבית. לפני הוספת צבע, מדוד את פלואורסצנטיות הרקע של התאים כדי לראות את הקפל מופעל לאורך זמן.

לאחר הוספת הצבע מניחים את צינור התרבית המכיל תאים ב- P B S לתוך מרים צינור הדגימה ומעלים את המרים למחט הזרקת הדגימה. לאחר מכן בחר את קובץ הדגימה המתאים בכרטיסיית לוח האיסוף ולחץ על הקלט "לאחר השלמת הריצה הורד את מרים צינור הדגימה עם צינור התרבית ביד. כדי ליזום שלב שטיפה, כדי לשטוף את המערכת הנוזלית, ולמזער את הנשיאה בין כל דגימת שכפול ביולוגית.

כדי לעבור לדוגמה הבאה, בחר את הקובץ לדוגמה הבא על-ידי לחיצה על סמל החץ ימינה ליד שם צינור הדגימה מתחת לסמל הרשומה. כדי למדוד את הפלואורסצנטיות של תאים עם צבע להוסיף 1.4 מיקרוליטר של מלאי צבע מרוכז לתוך אחד X P B S עם תאים, כדי לתת ריכוז סופי של 50 micromolar D F H B I אחד T.לאבטח את מכסה צינור התרבית ולהפוך שלוש עד חמש פעמים כדי לערבב את התמיסה באופן שווה. לאחר מכן, הסר את המכסה והנח את צינור התרבית לתוך מרים צינור הדגימה.

לאחר הרמת המחזיק למחט הזרקת הדגימה, לחץ על סמל הרשומה מתחת לקובץ הדגימה המתאים. לאחר מכן, התחל טיימר על ידי לחיצה על start"In vitro kinetics של תרד אפטמרס פלואורוגני 2 וברוקולי, הציג קינטיקה אסוציאציה דו פאזית לקשירת צבע D F H B I. עבור שני האפטמרים, נתוני הקינטיקה הותאמו טוב יותר על ידי אסוציאציה דו-פאזית מאשר חד-פאזית בזמני מדידה ארוכים.

עקומת ההתאמה הטובה ביותר קבעה את קבועי הקצב ואת ערכי מחצית החיים עבור האסוציאציות המהירות והאיטיות. תרד שני במצב כשירות הכריכה, הראה הפעלה מהירה יותר מאשר ברוקולי. הקינטיקה של השלב השני עבור שני האפטמרים דומה ועשויה להתאים לשלב משותף המגביל את הקצב.

העקומות הקינטיות של האפטמרים מורכבות ממידה דומה של רנ"א המקשר במהירות. עבור תאים המבטאים תרד שני T RNA, עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת או M F I עולה מיד בנקודת זמן אפסית. יתר על כן, הפלואורסצנטיות התאית הגיעה לערך M F I המקסימלי שלה תוך חמש דקות.

לעומת זאת, תאי בקרה הראו פלואורסצנטיות נמוכה ברקע וללא שינוי בערכי M F I עם תוספת D M S O השיטות המוצגות מאפשרות לחוקרים לקבוע כיצד הם יכולים ליצור חיישנים מבוססי RNA באפטמרים פלואורוגניים מהר יותר.