מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס

האסטרטגיה להחריג נוירונים באמצעות מיון FACS שלילי מייצרת שיעורי ריצוף RNA באיכות גבוהה של אוכלוסיית תאי שפע נמוכה, כמו תאי גזע עצביים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים, כדי לחקור את תפקידם במודולציה של נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגר. בשיטה זו, ניתן להתאים את בחירת הנוגדן ב- FACS gating, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לוורסטילי מאוד בהתייחסות לשאלות ביולוגיות שונות הקשורות לפיתול המשונן. שיטה זו נועדה בעיקר לחקור את נישת ההיפוקמפוס למבוגרים.

עם זאת, ניתן להתאים אותו בקלות לחקר נישות אחרות של תאי גזע. מי שתדגים את הנוהל תהיה שרה אחמד דה פראדו, עמיתת פוסט-דוקטורט במכון פרנסיס קריק. כדי להתחיל, להעביר את המוח מנותק מן העכבר מורדם לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ מלא PBS קר כקרח.

לאחר מכן הניחו את צלחת הפטרי על קרח וחתכו את המוח לשני חצאים לאורך ציר הסגיטל. באמצעות אזמל, להסיר את המוח הקטן. העבירו מחצית מהמוח לצלחת הפטרי החדשה בגודל 10 ס"מ שהונחה על קרח, המכילה PBS קר כקרח.

נתחו את הפיתול המשונן, או DG, באמצעות משקפת, וחזרו על שלב זה כדי לקבל את ה-DG השני מהמחצית השנייה של המוח. מעבירים את שני ה-DGs לתוך ההומוגנייזר Dounce המקורר מראש ומוסיפים מיליליטר אחד של חיץ הומוגניזציה קר, או HB. הומוגניזציה של הרקמה עם 10 משיכות של מזיק A רופף, ואחריו 15 משיכות של מזיק B הדוק. מעבירים את ההומוגנט לצינור 15 מיליליטר מוכן מראש.

שטפו את ההומוגנייזר של Dounce עם 1 מיליליטר של HB קר ושלבו אותו עם אותו צינור. מוסיפים 3 מיליליטר של HB לצינור 15 מיליליטר, ודוגרים במשך 5 דקות על קרח. מערבבים את מתלה הגרעינים פעמיים על ידי היפוך הצינור בעדינות.

באמצעות 0.5 מיליליטר של HB, יש להרטיב מראש את מכסה המסננת בגודל 70 מיקרומטר המונח מעל מבחנה של 50 מיליליטר, ולאחר מכן לסנן את תרחיף הגרעינים לפני שטיפת מסננת התא עם 0.5 מיליליטר של HB. לאחר מכן, הסר את מסננת התאים וצנטריפוגה את המבחנה בצנטריפוגת דלי נדנדה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט. יש לתלות בעדינות את הכדור ב-4 מיליליטר של HB באמצעות פיפטה P1000.

לאחר 5 דקות של דגירה על קרח, צנטריפוגה את המתלה ב 500 x גרם במשך 10 דקות, ב 4 מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשהות את הכדור ב-3 מיליליטר של מדיית כביסה. יש להשתמש ב-0.5 מיליליטר של מדיית כביסה כדי להרטיב מראש מכסה מסננת של 35 מיקרומטר על פני מבחנה של 50 מיליליטר.

לאחר מכן מסננים את תרחיף הגרעינים על ידי פיפטינג של 0.5 מיליליטר של השעיה בכל פעם, באמצעות פיפטה P1000. לאחר שטיפת כובע המסננת עם 0.5 מיליליטר של מדיה לשטוף, מניחים את הצינור על קרח. מעבירים את התסנין לצינור חדש של 15 מיליליטר ועושים צנטריפוגה במשך 5 דקות ו-4 מעלות צלזיוס, ב-500 x גרם.

להשליך את supernatant, ולהשהות את הכדור ב 3 מיליליטר של מדיה לשטוף. חזור על הצנטריפוגה ושלח את הכדור במיליליטר אחד של מצע שטיפה עם העכבר anti-NeuN, נוגדן מצומד אלקסה פלואור 488 ו 1 מיקרוגרם למיליליטר DAPI. לדגור את התגובה במשך 45 דקות על קרח בחושך.

למיון גרעינים מופעלים פלואורסצנטיים, או FANS, העבירו את תרחיף הגרעינים המוכתמים באימונו למבחנה של 5 מיליליטר, והניחו אותו על קרח עד לתחילת הליך הציטומטריה של הזרימה. מערבבים את הדגימות במשך 3 שניות, בעוצמה קלה, לפני שמכניסים את הצינורות למכשיר FACS. כדי לרכוש את הנתונים מתרחיף גרעינים מוכתמים, הגדר את השערים בגובה DAPI ובאזור DAPI כדי לא לכלול את פסולת התאים ואת הגרעינים המצטברים.

לאחר מכן הגדר את השערים באזור הפיזור הצדדי של היומן, או SSC, ואת אזור פיזור הלוג קדימה, או FSC, כדי להפריד בין הגרעינים הבודדים לבין הצבירה המוכתמת ב- DAPI הנותרת או פסולת תאים. לאחר מכן בודד את האוכלוסייה השלילית של NeuN-AF488 על ידי הגדרת השערים לאזור האנטי-NeuN-AF488 ו- FSC. לאחר הניתוח, מיין את האוכלוסייה השלילית נגד NeuN-AF488 בצינור איסוף של 1.5 מיליליטר מלא ב-50 מיקרוליטרים של מדיית כביסה באמצעות אסטרטגיית הגרירה.

לאחר סיום המיון, הוסף 1 מיליליטר של PBS המכיל 1% אלבומין בסרום בקר, או BSA, לצינור האיסוף כדי לאסוף טיפות מדופן הצינור וצנטריפוגה את הצינור ב 500 x גרם, במשך 5 דקות, ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט, והותירו 50 מיקרוליטרים מומסים כדי להשעות גרעינים צנטריפוגטיים. במיקרו-צינורית של 0.5 מיליליטר, הוסיפו 5 מיקרוליטרים של תרחיף הגרעינים ל-5 מיקרוליטרים של כחול טריפאן.

מדוד את הריכוז והערך את הכדאיות של תרחיף התא הבודד באמצעות מונה תאים אוטומטי לפני ביצוע הכנת הספרייה וריצוף הגרעינים. אשכולות ביואינפורמטיים חשפו קבוצות מופרדות היטב של גרעינים המתאימים לסוגי תאים ידועים בתוך ה-DG, עם או בלי FANS. בתוך הדגימה שאינה ממוינת על ידי FACS, רוב הגרעינים המרוצפים באיכות גבוהה היו 84.9% מתאי העצב.

הוא כלל שלוש קבוצות של נוירונים, מה שמצביע על האפשרות של אוכלוסיות התאים המייצגות ביותר בפיתול המשונן להיות נוירונים גרגיריים, נוירונים מעוררים אחרים ונוירונים מעכבים. בתוך הדגימה שאינה ממוינת על ידי FACS, האשכולות הלא-עצביים שזוהו היו מורכבים ברובם מ-11.1% מסוגי תאי גליה, כולל אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ותאים מבשרי אוליגודנדרוציטים, 3.3% תאי חיסון ו-0, 6% תאי קחאל-רציוס. תוך כדי ביצוע FANS כדי להוציא אוכלוסיות חיוביות של NeuN, צבירי תאי הגליה הפכו לבולטים, עם 81.3% מכלל הגרעינים.

עבור הדגימות המרוצפות ב-50, 000 קריאות לכל גרעינים, זוהו 25, 010 גנים לכל גרעינים עבור הדגימה שאינה ממוינת על ידי FACS, ו-1, 665.5 גנים עבור דגימת ה-NeuN-negative FANS, המאשרים פרופיל תעתיק באיכות גבוהה של גרעינים בודדים ומיון FACS אינו פוגע בגרעינים עבור snRNA-seq הבאים. לשיעור הגבוה של תאי עצב בדגימה שאינה ממוינת על ידי FACS הייתה פעילות שעתוק גבוהה יותר של 2, 660 גנים לכל גרעין ו-6, 170 תעתיקים לכל גרעין בדגימה שאינה ממוינת על ידי FACS מאשר סוגי התאים הלא עצביים עם פעילות שעתוק ממוצעת של 1, 090 גנים לגרעין ו-1, 785 תעתיקים לכל גרעין. לאחר שהנתונים נוצרו עם פרוטוקול זה, כדאי לשקול את השיטות האורתוגונליות החדשות כגון תסמינים מיוחדים או מחקרי in vivo כדי לאמת את כל הממצאים.