טיפול בסוגיות מעשיות במיקרו-הזחה מבוססת מיקרוסקופיה של כוח אטומי על צמחי סחוס מפרקיים אנושיים

מטרת פרוטוקול זה הייתה ליצור מודל במבחנה לחקר תכונות מכניות של סחוס מפרקי במהלך הופעת דלקת מפרקים ניוונית והתקדמותה. היתרון העיקרי של הטכניקה הנוכחית הוא שצמחי הסחוס קלים להפקה ומייצגים מאוד את הסחוס בגיל הטבעי. מודל זה יכול לשמש לניתוח וניטור של גישות שונות של דלקת מפרקים ניוונית, אבחון וטיפול ברמה הביומכנית.

כדי להתחיל, לחתוך את הסחוס מן העצם באמצעות אזמל. באמצעות ניקוב ביופסיה, ליצור דיסקים בקוטר ארבעה מילימטר. הנח את הדיסק על מכשיר חיתוך בהתאמה אישית.

בעזרת מרית, מקבעים ומייצבים את דיסק הסחוס. חותכים את דיסק הסחוס עם סכין גילוח. בעזרת מרית, לאסוף את הדיסק ולהניח אותו בתוך צינור 1.5 מיליליטר.

כדי להישאר בדגימות הסחוס, הוסף 130 מיקרוליטר של צבע פלואורסצנטי חדיר לתאים לכל באר של צלחת 96 באר ופזר את הדיסק על הצלחת כדיסק אחד לכל באר. הניחו את צלחת 96 על מחזיק הצלחת במיקרוסקופ הפלואורסצנטי. בחר את מסנן הפלואורסצנטיות המתאים ואת המטרה.

מקם את המטרה מתחת לבאר שנבחרה מראש המכילה סחוס בודד. התמקדו בדיסק כדי לראות את התבנית התאית. בחר את פונקציית הנווט כדי לקבל סקירה כללית של הבאר כולה.

השתמש בלחצן העכבר השמאלי וגרור אותו כדי לנווט למיקום במה אחר. בחר ריבוע המקיף את האזור המעניין לסריקה. בחר באפשרות נקודת מפת המיקוד של התוכנה ולאחר מכן בחר כל אריח בנפרד על-ידי לחיצה שמאלית במרכזו.

בחר את מפת מיקוד האפשרויות בחלון הופיע עם כל האריחים שנבחרו קודם לכן. לחץ פעמיים על אריח כדי להציג ולהביא אותו למיקוד הנכון. לאחר מכן, לחץ על הגדר Z כדי לשמור את תוכנית המוקד ולהמשיך לאריח הבא.

לאחר התאמת תוכנית המוקד עבור כל אריח בודד, התחל ברכישת תמונה על-ידי הקשה על התחל סריקה. תקן כל דיסק סחוס שנבחר מראש המכיל תבנית תאית בצלחות פטרי על ידי הוספת דבק תואם ביולוגית מספיק בצד העליון, התחתון, השמאלי והימני של הדיסק. מכסים את הדיסקים ב-2.5 מיליליטר מדיום ליבוביץ ללא L-גלוטמין.

מקמו את צלחת הפטרי במחזיק הדגימה של מכשירי AFM. כדי לכייל את מיכל AFM, הניחו אותו על פני השטח של מזנון בלוק הזכוכית כך שהוא יישען על המישור האופטי המלוטש במרכז בלוק הזכוכית. מנמיכים את המגן בצעדים של 100 מיקרומטר באמצעות פונקציית מנוע הצעד עד שהוא שקוע לחלוטין בתווך.

כדי לזהות את אתר מדידת הסחוס הרצוי, התחל בגישת סורק עם המזנון על אזור נקי ללא דגימה של צלחת הפטרי. לאחר מכן משכו את המזנון במרחק של 1.5 מילימטרים מתחתית הצלחת. עבור משדה בהיר לתצוגת פלואורסצנטיות וזהה חזותית את החלק העליון של הדיסק.

הזז את מחזיק דגימת ה-AFM בדיוק שני מילימטרים לכיוון מרכז הדיסק. הפעל גישת סורק כדי להגיע לפני השטח של דיסק הסחוס ולמשוך את המגן ב -100 מיקרומטר. ליצירת עקומת מרחק כוח, התמקדו בתאים הממוקמים באתר המדידה הרצוי.

לחצו על כפתור ההפעלה כדי להתחיל את המדידות ולקבל חמש עקומות מרחק כוח בכל אתר מדידה. שמור את העקומות לאחר בדיקתן. כדי להעריך את המודולים של יאנג, באמצעות האפשרות פתח קבוצה של עקומות ספקטרוסקופיה, פתח את עקומות מרחק הכוח שנוצר לניתוח.

בחר בדגם Hertz-fit ולאחר מכן באפשרות Elasticity-Fit. לאחר מכן דמיינו ותיעדו את המודולוס של יאנג. התאימו את עצמכם באמצעות יחס פואסון של 0.5 ורדיוס קצה הקנטיליבר המתאים.

לאחר מכן בדוק חזותית את התאמת עקומת מרחק הכוח כדי להבטיח נכונות. לקביעת עומק הזחה, פתח כל אחת מעקומות מרחק הכוח שנוצר בתוכנת ניתוח הנתונים ובחר במודל Hertz-fit כתהליך הניתוח. החילו את האפשרות 'הסט מקו בסיס חיסור' על אפס ציר הסטייה האנכית ובחרו בפונקציית ההסטה בתוספת הטיה.

השתמש בפונקציה חיפוש נקודת מגע כדי לזהות באופן אוטומטי את נקודת המגע. באמצעות פונקציית מיקום הקצה האנכי, הפחת את המרחק תוך התחשבות אך ורק בסטייה מגובה הפיזו הגולמי במהלך הכניסה. בחר באפשרות Elasticity-Fit כדי להציג את עקומת מרחק הכוח המעובד.

לאחר מכן בחרו באזור התרשים כך שהוא יתיישר עם הערך השלילי ביותר בציר מיקום הקצה האנכי. בכרטיסיית הפרמטר מהתיבה XMIN, קרא ותעד את הכניסה. הדיסקים שהכילו מחרוזות בודדות הראו ערכי קשיחות גבוהים יותר עם חציון של 2.6 קילו פסקל, המייצג אזורי סחוס בריאים ללא פשרות.

עם הופעת דלקת מפרקים ניוונית והתקדמותה, מדידות AFM הראו ירידה חזקה בנוקשות של 42% במיתרים כפולים, 77% באשכולות קטנים, ובסופו של דבר 88% בשלבים מתקדמים המיוצגים על ידי אשכולות גדולים. הדיסקים המכילים תבנית דיפוזית מוצגים באלסטיות מוגברת עם וריאציה חשובה של ערכי יחיד מודולוס של יאנג. עבור כל דיסקי הסחוס עם ארגון תבנית תאית דומיננטית שהוקצתה, עומק ההזחה הקשור לנקודת הסט המופעלת נמצא ביחס הפוך לנוקשות.

הממצאים הנראים בעקומות מרחק הכוח שנוצרו מעידים על מגע תת-אופטימלי בין משטח ה-AFM לבין משטח הסחוס או על קיבוע דגימה לא תקין לצלחת הפטרי. ניתן להמשיך לעבד ולנתח את צמחי הסחוס שלנו באמצעות מגוון טכניקות ביולוגיות מולקולריות כגון ניתוח חלבונים באמצעות אלייזה, תיוג חיסוני, מודינג מערבי או ניתוח Gen באמצעות PCR. שיטה זו עשויה לשמש לחקר ההשפעה הישירה של טיפולים חדשים על קרטיליגה מפרקית ועשויה לסייע לחוקרים להשיג תובנות חשובות לגבי מנגנוני הפוטומה של דלקת מפרקים ניוונית.