Name: מודל בעלי חיים של דגי זברה לחקר תגובות אלרגיות בתגובה לביומולקולות של רוק קרציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: חקור תגובות אלרגיות ומנגנונים חיסוניים בדגי זברה (Danio rerio) בתגובה לביומולקולות של רוק קרציות. מודל זה מחקה תסמונת alpha-Gal אנושית ומסייע להבנת אינטראקציות מולקולריות בין קרציה למארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי קבוצת SaBio על שיתוף הפעולה בתכנון הניסוי והסיוע הטכני עם מתקן ניסויי הדגים ולחואן גלסרן סאז (IN-CSIC-UMH, ספרד) על אספקת דגי הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, ספרד והאיחוד האירופי-פדרציה (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras ממומן על ידי Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, ספרד, מענק IJC2020-042710-I.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קסטילה לה מנצ'ה במסגרת המחקר "הערכת התגובה החיסונית לחיסון מומת של M. bovis ואתגר עם M. marinum במספר דגם דג הזברה PR-2017-05-12."
קרציות התקבלו ממושבת המעבדה, שם דגימות מייצגות של קרציות במושבה נבדקו על ידי PCR לפתוגנים נפוצים של קרציותכדי לאשר את היעדר הפתוגנים, ונשמרו במכון לפרזיטולוגיה, המרכז הביולוגי של האקדמיה הצ'כית למדעים (IP BC CAS), צ'כיה.כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוק הגנת בעלי חיים של הרפובליקה הצ'כית מס '246/1992 Sb (אישור אתיקה מס '34/2018).
1. טיפול בדגי זברה
הערה: הניסוי נועד להעריך תגובות אלרגיות ואת התגובה החיסונית בדגי זברה שטופלו ברוק קרציות בתגובה לצריכת בשר יונקים.
<ol><li>טפלו בדגים (כפי שמוסבר בסעיף 4) ברוק קרציות, מסחרי Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (ראה טבלת חומרים), המשמש כבקרה חיובית, עם מלוחים חוצצי פוספט (PBS) כבקרה שלילית. דגי זברה בוגרים מחולקים באופן אקראי לשלוש קבוצות מאוזנות מגדרית (איור 1). הערה: ניתן להעריך כל תרכובת רצויה אחרת הקשורה ל- AGS באמצעות מודל זה.</li>
</ol>2. Ixodes ricinus מיצוי רוק קרציות
<ol><li>השתמשו בקרציות נקבות נטולות פתוגן למחצה המוזנות במשך 6-7 ימים בשרקנים.</li>
	<li>טפל בקרצייה עם 5 μL של תמיסה 2% (wt/vol) של פילוקרפין הידרוכלוריד ב- PBS (ראה טבלת חומרים) ב- pH 7.4 לתוך ההמוקול באמצעות מזרק 50 μL עם מחט 0.33 מ"מ כפי שתואר קודם לכן28 כדי לגרום לייצור רוק הקרציות. הערה: הטיפול בקרציות נעשה באמצעות מלקחיים; היזהר לא להפעיל יותר מדי כוח כאשר אוחזים בהם.</li>
	<li>לאסוף רוק באמצעות קצה 10 μL רכוב על micropipette.<ol><li>הציגו בזהירות את החוד בתוך היפוסטום הקרציה.</li>
		<li>שמור את הרוק בצינור של 1.5 מ"ל על קרח, אגר אותו ואחסן אותו ב -80 ° C כפי שתואר קודם27.</li>
	</ol></li>
	<li>לקבוע את ריכוז חלבון הרוק, כדי לקבוע את כמות החלבון שיש להזריק לדגים כמו במחקרים קודמים27 באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (ראה טבלת חומרים) בעקבות המלצות היצרן.</li>
</ol>3. תחזוקה של דגי זברה
<ol><li>שמרו על דגי זברה במערכת מים זורמת ב-27°C עם מחזור בהיר/כהה של 14 שעות/10 שעות (איור 2).</li>
	<li>האכילו את הדגים פעמיים ביום בשעות 9:30 בבוקר ו-13:30 במזון יבש לדגים (50-70 מיקרוגרם לדגים) עד היום השני.</li>
	<li>יש להאכיל את הדגים פעמיים ביום בשעות 9:30 בבוקר ו-13:30 במזון יבש לכלבים (50-70 מק"ג/דגים) מהיום השני לאחר הזרקת הטיפול ועד סוף הניסוי</li>
</ol>4. הזרקת דגי זברה
<ol><li>בחר 10 דגים בכל קבוצה עם יחס דומה של נקבות/זכרים ומשקל דומה. הערה: קבוצה 1 מכילה דגים המוזרקים עם PBS, קבוצה 2 מכילה דגים המוזרקים עם רוק קרציות, וקבוצה 3 מכילה דגים המוזרקים עם α-גל.</li>
	<li>הרדימו את הדג לזמן קצר על ידי טבילה ב-0.02% טריקאין מתאן-סולפונט (MS-222) (סרט 1). הערה: דגים מורדמים כראוי מראים נשימה רגילה וללא שחייה, בעוד שניתן למקם אותם בתחתית מיכל המים או לצוף. כל דג חייב להיות מורדם בנפרד כדי למנוע נזק פיזיולוגי אפשרי.</li>
	<li>לכדו את הדגים המורדמים באמצעות רשת דיג.</li>
	<li>הניחו את הדג על חצי צידו בעזרת מלקחיים או ידיים בזהירות, על ספוג רטוב, כאשר הסנפיר הקאודלי בצד ימין כדי להזריק את התרכובות באותו כיוון על מנת לשלוט בנגעים.</li>
	<li>הזריקו קבוצות דגים תוך עורית, כמו במחקרים קודמים26, בשריר בקוטר 5 מ"מ לסנפיר הקאודלי ובזווית של 45 מעלות ביחס לגוף הדג (סרט 2). השתמש בטיפול המתאים בימים 0, 3 ו- 8 כפי שתואר קודם לכן 27 עם מזרק 100 μL מצויד במחט 1 ס"מ, 29 גרם עם 1 μL (עם 9 מיקרוגרם / μL של חלבון) של רוק I. ricinus ב 10 μL של PBS (רוק קרציות), 5 מיקרוגרם של α-גל ב 10 μL PBS (α-Gal)27,  ו-10 מיקרוליטר של PBS (איור 3). הערה: הטיפול חייב להיעשות במהירות ובזהירות כדי למנוע נזק פיזי לבעל החיים. ביומולקולות אחרות ברוק הקרציות ניתנות להערכה בעקבות פרוטוקול זה.</li>
	<li>החזירו את הדגים המטופלים למיכל מים מתוקים ללא הרדמה לצורך התאוששות. הערה: ניתן להכניס את כל הדגים מאותה קבוצה לאותו מיכל מים לצורך התאוששות.</li>
</ol>5. האכלת דגי זברה
<ol><li>מועכים את מזון הכלב עם טיט ו pestle.</li>
	<li>יש להאכיל 50-70 מק"ג/דגים פעמיים ביום בשעות 9:30 ו-13:30 במזון דגים יבש עד היום השני.</li>
	<li>יש להאכיל 50-70 מק"ג/דגים פעמיים ביום בשעות 9:30 ו-13:30 במחית מזון לכלבים מהיום השני לאחר הזרקת הטיפול ועד סוף הניסוי ביום השמיני. הערה: אם יש להעריך סמני חסינות או טיטרים של נוגדנים לנוגדן α-Gal או IgE בתגובה לטיפולים או להזנה במהלך החיסונים השונים, יהיה צורך בהזנה עד סוף הניסוי.</li>
</ol>6. הערכת תגובות, נגעים והתנהגות אלרגיים בדגי זברה
<ol><li>בחנו את סוג הדימום של תגובות אלרגיות (אדמומיות בעור, שינוי צבע ודימום) באמצעות זכוכית מגדלת או סטריאומיקרוסקופ לצורך דיוק, וציינו את מיקום הופעתן על הדגים בעקבות הסיווג הכלול בטבלה 1 (איור 4A). הערה: התגובות האלרגיות המוצגות באיור 4 הופיעו לאחר הזרקת רוק קרציות וצריכת מזון המכיל בשר אדום. לכן, התגובות המתוארות הן סוג התגובות הקשורות ל- AGS, שכן תגובות דומות מופיעות בהקשר הקליני.<ol><li>שימו לב אם מופיעה תגובה כלשהי לאחר טיפולים ותוך מתן מזון פעמיים ביום בזמן שהדגים נמצאים במיכל המים.</li>
	</ol></li>
	<li>בחנו את התנהגות הדגים על ידי הערכת השינויים27 בדפוסי השחייה (ניידות, מהירות, עמידה ללא תנועה בתחתית מיכל המים ושחייה בזיגזג) בעקבות הסיווג הכלול בטבלה 1.</li>
	<li>להעריך תמותה מצטברת, ולדווח על מספר הדגים המתים כולל השעה / יום המוות (איור 4B). הערה: כל הפרמטרים מוערכים מיד לאחר הטיפול או לאחר שינוי ההזנה ועוקבים אחריהם מדי יום עד סוף הניסוי ביום 8 תוך סיווג משתנים איכותיים (טבלה 1). כהמלצה, הערכה זו צריכה להתבצע על ידי איש מקצוע בעל ידע בדגי זברה כדי לשקול שינויים התנהגותיים בהתבסס על הרקע והניסיון שלהם בעבודה עם מודל בעלי חיים זה.</li>
	<li>חשב את מספר דגי הזברה ליום עם תגובות אלרגיות מדווחות, התנהגות חריגה ושינויים בהזנה בכל קבוצה והשווה בין קבוצות על ידי בדיקת ANOVA חד-כיוונית.</li>
</ol>7. איסוף דוגמאות
<ol><li>הרדימו את הדג על ידי טבילה ב-0.04% MS-222 ביום ה-8. הערה: אספו גם את הדגימות מהדגים שמתו מתגובות אלרגיות במהלך הניסוי.</li>
	<li>מקבעים את הדג על צלחת פרפין עם סיכות.</li>
	<li>לאסוף סרום מן כלי הדם זימים 29 של הדגים מיד לאחר המתת חסד, כאשר הזימים עדיין מושקים בדם, באמצעות מזרק 0.5 מ"ל מצויד 1 ס"מ,29 גרם מחט. יש לאחסן אותו בצינור בנפח 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש (סרט 3).</li>
	<li>חותכים את הדג עם להב אזמל ולהעריך את הנגעים הפנימיים (נגעים hemorrhagic או גרנולומות)27,30 אם הם מופיעים. הערה: נגעים אינם מופיעים בהכרח אך יש לרשום אותם אם כן.</li>
	<li>אספו את המעי (סרט 4) ואת הכליה (סרט 5) מכל דג בצינורות ריקים נפרדים של 1.5 מ"ל, כפי שתואר קודם לכן31, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (איור 4C).</li>
	<li>יש לחלץ רנ"א כולל ממעי דגי הזברה ומדגימות הכליה באמצעות ערכת טיהור RNA (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>לנתח את ביטוי הגנים הקשורים לתגובה חיסונית כפי שתואר קודם לכן30,32 (ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר) בדגי זברה, ביצוע תגובת שרשרת כמותית של שעתוק לאחור-פולימראז (RT-qPCR) באמצעות תערובת שעתוק לאחור עבור RT-qPCR (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן. נרמלו את ערכי cT mRNA כנגד D. rerio GAPDH, והשוו בין קבוצות (דגים שטופלו ברוק, α-Gal והקבוצות שטופלו ב-PBS) באמצעות מבחן t סטודנטיאלי עם שונות לא שוויונית.</li>
	<li>קבע טיטרים נוגדנים מסוג IgM המזהים α-Gal בדגי זברה בדגימות סרום על ידי ELISA כפי שתואר קודם לכן27,30. רשום את טיטרי הנוגדנים כערכי O.D.450 ננומטר, באמצעות קורא צלחות, והשווה בין קבוצות (דגים שטופלו ברוק, α-גל והקבוצות שטופלו ב- PBS) באמצעות מבחן t סטודנט עם שונות לא שווה. הערה: קביעת טיטרים של נוגדנים IgM וניתוח גנים ביטוי היא אופציונלית ומבוצעת רק אם נדרש מידע אימונולוגי. תערובת RT-qPCR היא ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון לניתוח ביטוי גנים באמצעות qPCR בזמן אמת.</li>
</ol>

<ol><li>de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Ticks+as+vectors+of+pathogens+that+cause+disease+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals.</a> Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).</li>
<li>de la Fuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-pathogen+interactions+and+vector+competence%3A+identification+of+molecular+drivers+for+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114(2017).</li>
<li>Villar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tick+salivary+gland+and+saliva+alphagalactome+reveals+candidate+alpha-gal+syndrome+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).</li>
<li>Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+tick+salivary+proteins+as+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The use of tick salivary proteins as novel therapeutics.</a> Frontiers in Physiology. 10, 812(2019).</li>
<li>Chung, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetuximab-induced+anaphylaxis+and+IgE+specific+for+galactose-alpha-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).</li>
<li>Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+association+between+tick+bite+reactions+and+red+meat+allergy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Medical+Journal+of+Australia%22%5BJournal%5D)">An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans.</a> The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+molecular+drivers+of+the+%CE%B1-Gal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1210(2019).</li>
<li>de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-Gal+syndrome%3A+new+insights+into+the+tick-host+conflict+and+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation.</a> Parasites & Vectors. 12 (1), 154(2019).</li>
<li>Platts-Mills, T. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+cause+and+consequences+of+IgE+to+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%3A+A+report+from+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+workshop+on+understanding+IgE-mediated+mammalian+meat+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+anaphylaxis%2C+angioedema%2C+or+urticaria+after+consumption+of+red+meat+in+patients+with+IgE+antibodies+specific+for+galactose-alpha-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).</li>
<li>Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphylaxis+to+the+carbohydrate+side+chain+alpha-gal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Allergy+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal.</a> Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).</li>
<li>Mateos-Hernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-host+conflict%3A+immunoglobulin+E+antibodies+to+tick+proteins+in+patients+with+anaphylaxis+to+tick+bite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite.</a> Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).</li>
<li>Galili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+in+primates+by+%26%2334%3BCatastrophic-selection%26%2334%3B+interplay+between+enveloped+virus+epidemics%2C+mutated+genes+of+enzymes+synthesizing+carbohydrate+antigens%2C+and+natural+anti-carbohydrate+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Evolution in primates by &#34;Catastrophic-selection&#34; interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies.</a> American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).</li>
<li>Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+mechanism+of+galactose-alpha-1%2C3-galactose+in+the+elicitation+of+delayed+anaphylactic+reactions+to+red+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Allergy+and+Asthma+Reports%22%5BJournal%5D)">Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat.</a> Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3(2019).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+research+meets+tick+vectors+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cancer research meets tick vectors for infectious diseases.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).</li>
<li>Yilmaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+elicits+a+protective+immune+response+against+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission.</a> Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).</li>
<li>Cabezas-Cruz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+immune+response+to+%CE%B1-Gal+and+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).</li>
<li>Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+of+alpha-gal+syndrome%3A+Current+standards%2C+pitfalls+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Hautarzt%3B+Zeitschrift+Fur+Dermatologie%2C+Venerologie%2C+Und+Verwandte+Gebiete%22%5BJournal%5D)">Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives.</a> Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).</li>
<li>Commins, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+tick+bites+to+the+production+of+IgE+antibodies+to+the+mammalian+oligosaccharide+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+spectrum+of+%CE%B1-Gal+syndrome%3A+from+immediate-type+to+delayed+immediate-type+reactions+to+mammalian+innards+and+meat%5BTitle%5D)+AND+%22Allergo+Journal+International%22%5BJournal%5D)">Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat.</a> Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).</li>
<li>Hodžić, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+Toxocara+canis+inhibits+the+production+of+IgE+antibodies+to+%CE%B1-Gal+in+humans%3A+towards+a+conceptual+framework+of+the+hygiene+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis.</a> Vaccines. 8 (2), 167(2020).</li>
<li>Kiewiet, M. B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+characterization+of+the+%CE%B1-Gal+syndrome-importance+of+atopy+for+symptom+severity+in+a+European+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology.+In+Practice%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).</li>
<li>Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-gal+story%3A+lessons+learned+from+connecting+the+dots%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).</li>
<li>Hashizume, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Amblyomma+testudinarium+tick+bites+are+associated+with+increased+galactose-%CE%B1-1%2C3-galactose+carbohydrate+IgE+antibody+levels%3A+A+retrospective+cohort+study+in+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).</li>
<li>Chandrasekhar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+exposure+to+clinically+relevant+lone+star+ticks+promotes+IgE+production+and+hypersensitivity+through+CD4%2B+T+cell-+and+MyD88-dependent+pathways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice.</a> Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).</li>
<li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amblyomma+sculptum+tick+saliva%3A+%CE%B1-Gal+identification%2C+antibody+response+and+possible+association+with+red+meat+allergy+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil.</a> International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).</li>
<li>Contreras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+reactions+and+immunity+in+response+to+tick+salivary+biogenic+substances+and+red+meat+consumption+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78(2020).</li>
<li>Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E%282%29+in+tick+saliva+regulates+macrophage+cell+migration+and+cytokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile.</a> Parasites & Vectors. 6 (2), 261(2013).</li>
<li>Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+will+tell%3A+what+hematological+analyses+can+reveal+about+fish+welfare%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare.</a> Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955(2021).</li>
<li>Pacheco, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+alpha-gal+protects+against+mycobacterial+infection+in+the+zebrafish+model+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis.</a> Vaccines. 8 (2), 195(2020).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), e1717(2010).</li>
<li>Lu, M. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+response+is+involved+in+nervous+necrosis+virus+acute+and+persistent+infection+in+zebrafish+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model.</a> Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).</li>
<li>Saralahti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+model+for+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis.</a> Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).</li>
<li>Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%3A+A+fintastic+model+for+hematopoietic+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312(2018).</li>
<li>Katoch, S., Patial, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+emerging+model+system+to+study+liver+diseases+and+related+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).</li>
<li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).</li>
<li>Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prednisolone+on+behavior+and+hypothalamic-pituitary-interrenal+axis+activity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325(2020).</li>
<li>Aleström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+Housing+and+husbandry+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: Housing and husbandry recommendations.</a> Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

דג זברה הוא מודל חסכוני וקל לטיפול שהיה גם כלי אפשרי מאוד לחקר מנגנונים מולקולריים של התגובה החיסונית, מחלות פתוגנים, בדיקות תרופות חדשניות, חיסון והגנה מפני זיהומים33,34,35. המחקר על התנהגות דגי הזברה שימושי מכיוון שמחקרים קודמים מצאו כי חלק ממיני הדגים נשארים ללא תנועה בתחתית המיכל כאשר הם בסטרס, מה שמשפיע על צריכת המזון שלהם, אוכלים פחות; בנוסף, זיגזג כאשר הם זזים יכול להיות קשור גם עם מתח דגיםוחרדה 36,37</s...

קרציות הן וקטורים של פתוגנים הגורמים למחלות והם גם הגורם לתגובות אלרגיות, המשפיעות על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם 1,2. במהלך הזנת קרציות, ביומולקולות ברוק הקרציות, במיוחד חלבונים ושומנים, להקל על האכלה של ectoparasites אלה, הימנעות הגנות המארח3. חלק מהביומולקולות של הרוק עם גליקן Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) מובילות לייצור רמות נוגדנים גבוהות נגד α-Gal IgE לאחר עקיצת הקרציה, רק אצל אנשים מסוימים, מה שידוע בשם תסמונת α-גל (AGS)4. זוהי מחלה הקשורה לאלרגיה בתיווך IgE שעלולה לגרום לאנפילקסיס לעקיצות קרציות, צריכת בשר יונקים שאינם פרימטים, וכמה תרופות כגון cetuximab5. התגובות ל-α-גל הן לעיתים קרובות חמורות ולעיתים עלולות להיות קטלניות 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-גל מצוי בכל היונקים למעט קופי העולם הישן, קופים ובני אדם שאין להם יכולת לסנתז α-גל13. עם זאת, פתוגנים כגון חיידקים ופרוטוזואה מבטאים גליקן זה על פני השטח שלהם, אשר יכול לגרום לייצור כמויות גבוהות של נוגדנים נגד α-גל IgM/IgG ועשוי להיות מנגנון הגנה מפני פתוגנים אלה16,17. עם זאת, ייצור נוגדנים נגד α-גל מעלה את הסיכון לפתח אלרגיות אנטי-α-גל בתיווך IgE 7,13. נוגדנים טבעיים נגד α-גל המיוצרים בבני אדם, בעיקר מתת-הסוגים IgM/IgG, עשויים להיות קשורים לשינוי זה הקיים בחיידקים ממיקרוביוטת המעי16. AGS יכולה להיות אבחנה קלינית מאתגרת, שכן שיטת האבחון העיקרית כרגע מבוססת על היסטוריה קלינית של תגובות אלרגיות מאוחרות, הקשורות במיוחד לאלרגיות למזון (כלומר, גרד, כוורות מקומיות, או אנגיואדמה חוזרת לאנפילקסיס, אורטיקריה ותסמינים במערכת העיכול) ומדידת רמות נוגדנים IgE נגד α-גל9. ממצאים עדכניים מצביעים על כך שעקיצות קרציות מהוות את אחד הסיכונים העיקריים בהופעת AGS 18,19, עלייה של פי 20 ומעלה ברמות IgE ל-α-גל בעקבות עקיצת קרציות 19, היסטוריה של עקיצות קרציות בחולים עם AGS20,21,22, קיומם של נוגדנים תגובתיים לאנטיגנים של קרציות בחולי AGS 19, וכי Anti-α-Gal IgE קשורים קשר הדוק לרמות IgE נגד קרציות19,23, אך נדרשים מחקרים נוספים כדי להעריך אילו ביומולקולות מעורבות בפועל.
בנוסף, תרחיש אפשרי נוסף הוא חולים המציגים תגובות אלרגיות חזקות לעקיצות קרציות ורמות גבוהות של נוגדנים נגד α-Gal IgE אך עמידים לצריכת בשר יונקים12. לכן, אלרגיה לבשר יונקים יכולה להיות סוג מסוים של אלרגיה הקשורה לעקיצת קרציות. מיני הקרציות העיקריים הקשורים ל-AGS כוללים את Amblyomma americanum (ארה"ב), Amblyomma sculptum (ברזיל), Amblyomma testudinarium ו-Haemaphysalis longicornis (יפן), Ixodes holocyclus (אוסטרליה) ו-Ixodes ricinus (הווקטור העיקרי של Borreliosis ליים באירופה)11,24.
המודל היחיד ששימש להערכת ייצור IgE הקשור לעקיצות קרציות הוא מודל העכבר המהונדס גנטית עם הגן לעכברי α-1,3-גלקטוסילטרנספראז (α-Gal KO)25,26 מכיוון שכמו יונקים אחרים, גם עכברים מבטאים α-גל על חלבונים ושומנים ואינם מייצרים IgE ל-α-Gal. עם זאת, דג זברה (Danio rerio) הוא מודל שימושי למחקר ביו-רפואי המיושם על יונקים מכיוון שהוא חולק קווי דמיון אנטומיים רבים עם יונקים, וכמו בני אדם, גם אינו מסוגל לסנתז α-גל. מכיוון ש-α-גל אינו מיוצר באופן טבעי בדגי זברה, זהו מודל זול, קל למניפולציה ומאפשר מדגם גבוה לחקר תגובות אלרגיות הקשורות ל-α-Gal.
במחקר זה, דגי זברה משמשים כאורגניזם מודל כדי לאפיין ולתאר תגובות אלרגיות מקומיות, דפוסי התנהגות, ואת המנגנונים המולקולריים הקשורים לתגובה לרגישות מלעורית לרוק קרציות26,27 וצריכת בשר יונקים לאחר מכן. לשם כך, דגים נחשפים לרוק קרציות על ידי הזרקה תוך עורית ולאחר מכן מוזנים במזון כלבים, המכיל מוצרים שמקורם בבשר יונקים המתאימים לשימוש בבעלי חיים המכיל α-גל27, ואז נבדקות תגובות אלרגיות אפשריות הקשורות. שיטה זו עשויה להיות מיושמת על המחקר של biomolecules אחרים הקשורים לתהליכים אלרגיים, במיוחד אלה הקשורים AGS.

<table><tbody><tr><td>שפופרת 1.5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>מתקני</td><td></td><td></td><td></td>מים</tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA&nbsp;</td>סט חיתוכים <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-1279</td><td></td></tr><tr><td>מזון לכלבים - צלחות אקאנה</td><td></td><td></td><td></td>אליסה קלאסיות אדומות-96</tr><tr><td>באר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10547781</td><td></td></tr><tr><td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&alpha;-Gal)&nbsp;</td><td>Dextra</td><td>NGP0203</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix</td><td>Supermix</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>מזרקי מיקרוליטר</td><td>המילטון</td><td>7638-01</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח סיגמא</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>פילוקרפין הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>קצה פיפטה P10&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-0364</td><td></td></tr><tr><td>קצה פיפטה P1000</td><td>VWR</td><td>613-0359</td><td></td></tr><tr><td>מזון פרימיום דגים טרופיים</td><td>DAPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספוג מחזיק בעלי חיים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>עשוי מקצף גרוטאות</td></tr>, <tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td>, <td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler, PCR בזמן אמת</td><td>, כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate (MS-222)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table>

מודל בעלי חיים של דגי זברה לחקר תגובות אלרגיות בתגובה לביומולקולות של רוק קרציות

Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

קרציות הן וקטורים של פרוקי רגליים הגורמים למחלות על ידי העברת פתוגנים, ועקיצותיהם יכולות להיות קשורות לתגובות אלרגיות המשפיעות על בריאות האדם ברחבי העולם. אצל אנשים מסוימים, רמות גבוהות של נוגדנים אימונוגלובולינים E נגד גליקן Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) נגרמו על ידי עקיצות קרציות. תגובות אנפילקטיות המתווכות על ידי גליקופרוטאינים וגליקוליפידים המכילים את הגליקן α-גל, הנמצאים ברוק הקרציות, קשורות לתסמונת אלפא-גל (AGS) או אלרגיה לבשר יונקים. דג זברה (Danio rerio) הפך למודל חולייתי נפוץ לחקר פתולוגיות שונות. במחקר זה, דגי זברה שימשו כמודל לחקר תגובות אלרגיות בתגובה לצריכת בשר α-גל ויונקים, מכיוון שבדומה לבני אדם, הם אינם מסנתזים גליקן זה. לשם כך הוערכו דפוסי התנהגות ותגובות אלרגיות אנפילקטיות דימומיות בתגובה לרוק קרציות Ixodes ricinus ולצריכת בשר יונקים. גישה ניסיונית זו מאפשרת קבלת נתונים תקפים התומכים במודל בעלי החיים של דגי הזברה לחקר אלרגיות המועברות על ידי קרציות, כולל AGS.

הפרוטוקול המוצג כאן מבוסס על מספר היבטים של ניסויים שפורסמו בעבר27,30 ותוצאות שבוצעו במעבדה שלנו, שם מודל דג הזברה מבוסס ומאומת לחקר AGS והתגובה החיסונית ל- α-Gal מכיוון שגם בני אדם וגם דגי זברה אינם מסנתזים מולקולה זו13. מודל זה מאפשר אפיון והערכה של מגוון תגובות אלרגיות כתוצאה מתגובת המאכסן לרוק הקרציות (איור 4) והשלכותיהן על AGS. בנוסף, שינויים בהתנהגות כגון שחייה איטית (סרט 6), שכיבה על תחתית המיכל (סרט <s...

כאן, דג זברה (Danio rerio) משמש כמודל לחקר תגובות אלרגיות ותגובות חיסוניות הקשורות לתסמונת אלפא-גל (AGS) על ידי הערכת תגובות אלרגיות לרוק קרציות וצריכת בשר יונקים.

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

השאלה היא מדוע רק חלק מהאנשים שנחשפו לעקיצות קרציות מפתחים תגובות אלרגיות. עבורנו, הבהרת הביומולקולות ברוק הקרציות והמנגנונים החיסוניים המעורבים בתהליך זה היא המפתח להתמודדות עם שאלה זו. מודל בעלי החיים של דגי הזברה של תסמונת אלפא-גל משחזר דפוסי התנהגות אנושיים ותגובות אלרגיות בתגובה לרוק הקרציות.גישה ניסיונית זו מקדמת את הבנת האינטראקציה המולקולרית בין קרציות לפונדקאי שבה יש לנו קונפליקט הקשור לתסמונת אלפא-גל ושיתוף פעולה הקשור לתגובת נוגדנים לאלפא-גל, המגנים מפני זיהום פתוגן. כדי לטפל בדגים ברוק קרציות, פזרו דגי זברה בוגרים לשלוש קבוצות מאוזנות מגדרית. השתמש ב- Gala1-3Gal-BSA 3 מסחרי או ב- alpha-Gal כבקרה חיובית וב- PBS כבקרה שלילית.למיצוי רוק, השתמשו בקרציות נקבות חצי חרוכות, נטולות פתוגנים, המוזנות במשך שישה עד שבעה ימים בשרקנים. טפל בקרצייה עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסה 2% של פילוקרפין הידרוכלוריד ב- PBS ב- pH 7.4 לתוך ההמוקול באמצעות מזרק 50 מיקרוליטר עם מחט 0.33 מילימטר. אספו רוק מהיפוסטום הקרצייה באמצעות קצה של 10 מיקרוליטר המורכב על מיקרופיפטה.מניחים את הרוק בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח, ומאחסנים אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לקבוע את ריכוז חלבון הרוק כדי לקבוע את כמות החלבון שיש להזריק לדגים באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA, בהתאם להמלצות היצרן. שמרו על דגי זברה במערכת מים זורמים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס עם מחזור בהיר-כהה של 14 עד 10 שעות.לאחר מכן, בחר 10 דגים לכל קבוצה עם יחס דומה של נקבות לזכרים ומשקל דומה להזרקה. מרדימים את הדג לזמן קצר על ידי טבילה ב-0.02% טריקאין מתאן-סולפונט. הניחו את הדג המורדם על חצי צידו בעזרת מלקחיים או ידיים בזהירות, על ספוג רטוב, כאשר הסנפיר הקאודלי בצד ימין כדי להזריק את התרכובות באותו כיוון כדי לשלוט בנגעים.הזריקו קבוצות דגים תוך עורית לשריר באמצעות מזרק 100 מיקרוליטר המצויד במחט של סנטימטר אחד, 29 מד בחמישה מילימטרים לסנפיר הקאודלי ובזווית של 45 מעלות לגוף הדג. לאחר ההזרקה, החזירו את הדגים המטופלים למיכל מים מתוקים ללא הרדמה לצורך התאוששות. האכילו את הדגים פעמיים ביום בשעה 9:30 בבוקר.ו-13:30 עם 50 עד 70 מיקרוגרם מזון דגים יבשים לכל דג עד היום השני. לאחר מכן מועכים את מזון הכלב עם מכתש ומזיק כדי להאכיל את הדגים מהיום השני לאחר הזרקת הטיפול ועד סוף הניסוי ביום השמיני.לאיסוף דגימות, תקן את הדג המרדים על צלחת פרפין עם סיכות. אספו את הסרום מכלי הדם של הזימים של הדג כאשר הזימים עדיין מושקים בדם באמצעות מזרק 0.5 מיליליטר המצויד במחט של סנטימטר אחד, 29 מד. יש לאחסן את הסרום שנאסף בצינור של 1.5 מיליליטר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.חותכים את הדג עם להב אזמל, ולהעריך את הנגעים הפנימיים. לאחר מכן לאסוף את המעי והכליה של כל דג בצינורות נפרדים של 1.5 מיליליטר. חלצו את סך הרנ"א מהמעי ומהכליה באמצעות ערכת טיהור RNA.לנתח את הביטוי של גנים הקשורים לתגובה חיסונית, ביצוע תגובת שרשרת כמותית של שעתוק לאחור-פולימראז, או RT-qPCR באמצעות תערובת שעתוק לאחור עבור RT-qPCR, על פי הוראות היצרן. נרמלו את ערכי cT mRNA כנגד GAPDH של דגי זברה, והשוו בין קבוצות באמצעות מבחן t של סטודנט עם שונות לא שווה. קביעת טיטרים נוגדנים IgM המזהים אלפא-גל בדגימות סרום על ידי ELISA.רשום את טיטרי הנוגדנים כערכי צפיפות אופטית של 450 ננומטר באמצעות קורא לוחות, והשווה בין קבוצות באמצעות מבחן t סטודנט עם שונות לא שווה. מודל דג זברה זה מאפשר אפיון והערכה של תגובות אלרגיות שונות עקב תגובת המאכסן לרוק הקרציות והשלכותיהן בתסמונת אלפא-גל, או AGS. בנוסף, בהשוואה לדגי הביקורת, נצפו שינויים בהתנהגויות כגון שחייה איטית, שכיבה על קרקעית המיכל ואי אכילה, רטט או זיגזג בדגים שטופלו ברוק קרציות.שכיחות משמעותית של תגובות אלרגיות נצפתה בדגים שטופלו ברוק קרציות, מה שהראה דה-סנסיטיזציה וסבילות מהירה. השינוי ההתנהגותי היה בולט יותר בדגים שטופלו ברוק קרציות מאשר רק באלפא-גל. ניתוח נוסף של ביטוי הסמנים החיסוניים המייצגים בוצע על ידי RT-PCR.התוצאות הראו הבדלים בין קבוצות דגי זברה בכליה, שם סמני התגובה החיסונית היו מופחתים בדגים שטופלו ברוק ובאלפא-גל בהשוואה לקבוצת הביקורת. יתר על כן, דגי הזברה שטופלו ברוק ואלפא-גל פיתחו נוגדני IgM נגד אלפא-גל שהראו רמות גבוהות יותר מאשר בדגים שטופלו ב-PBS. הזרקת הטיפול, הערכת תגובות והתנהגות אלרגית ודיווח על מספר הדגים המתים מתגובות אלרגיות הם ההיבט החשוב ביותר בפרוטוקול.שימוש בטכנולוגיות אומיקס ברמת ה-mRNA, החלבון וגם ברמת המיקרוביום כדי לאפיין את התגובה לרוק הקרציות מאפשר לנו לזהות את הביומולקולות העיקריות המעורבות בתהליך זה.

zebrafish-animal-model-for-study-allergic-reactions-response-to-tick

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אוסף של hemolymph לתקתק נגוע, בלוטות הרוק, ורוק חשוב ללמוד איך לתקתק נישאים פתוגנים לגרום למחלה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לאסוף את בלוטות הרוק hemolymph ו מ...

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

התגובה החיסונית המולדת מגנה על אורגניזמים מפני זיהום הפתוגן. מרכיב קריטי של התגובה החיסונית המולדת, פרץ הנשימה תא בלען, מייצר מיני חמצן תגובתי שהורגים מיקרואורגניזמים פולשים. אנו מתארים assay פרץ נשימה שמכמת מיני חמצן תגובתי נוצרו כאשר התגובה החיסונית המולדת מושרה כימית.

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה והדמיה של זיהום חיידקי מקומי בשלפוחית האוטית של דג הזברה.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שחפת אנוש מודל דג זברה למבוגרים באמצעות הפתוגן הטבעי שלה, התחממות עולמית. חילוץ DNA ו- RNA של האיברים הפנימיים של דג זברה נגוע יכול לשמש כדי לחשוף את שהסכום הכולל mycobacterial טוען את הדגים, של המחשב המארח תגובות מערכת החיסון עם qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

כאן נתאר החיסונים של הבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) עם חיסון מבוסס DNA עבור פרוטוקול להדגים את האימות של אירוע מוצלח חיסון. שיטה זו מתאימה להקרנה פרה של החיסון מועמדים במודלים שונים של זיהום.

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס בזחלים זברה. נבגי אספרגילוס הם microinjected לתוך hindbrain של זחלים, טיפול כימי משמש כדי לגרום לדיכוי המערכת החיסונית. התקדמות הזיהום מנוטרת באמצעות מערך הדמיה יומי כדי לפקח על צמיחה פטרייתית ותגובות חיסוניות, כמו גם ספירה של נבגים חיים על ידי ציפוי יחידה יוצר מושבה.

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

מאמר זה מציג את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לזחל Ixodes scapularis לצורך מחקר קליני. הטכניקה פשוטה יחסית, נסבלת על ידי מתנדבי המחקר, וניתנת לשינוי בהתאם לצרכי הניסוי. מחקר כזה בבני אדם חייב להתבצע תחת פרוטוקולי מחקר קליני שאושרו על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות.

מודל לחשיפה ניסיונית של בני אדם לקרציות זחל Ixodes scapularis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף רוק, המולימפה, בלוטות הרוק והמעי האמצעי, לאחר דיסקציה של קרצייה בודדת שניזונה, כדי לחקור לוקליזציה ספציפית לרקמה של פתוגנים הנישאים על ידי קרציות כדי לקדם את ההבנה של יכולת הווקטור ואינטראקציות פתוגן-מיקרוביום.

מיצוי רוק, המולימפה, בלוטות רוק ומעי תיכון מקרציות בודדות (Acari: Ixodidae)

שיטה זו מתארת את פיתוח מערכת הזנת דם מקרציות במבחנה , המשלבת תא מודפס בתלת-ממד וממברנת סיליקון מעבדתית. המערכת מאפשרת האכלה מלאכותית של קרציות, ומאפשרת דגימה קלה בשלבים שונים של האכלה ושימוש בכמויות דם נמוכות, ומספקת כלי יקר ערך לחקר קרציות איקסודיד.

דם קרציות המזין דרך ממברנה מלאכותית בתא מודפס בתלת-ממד במחקר קרציות איקסודיד

כדי למודל כיצד אותות דלקתיים משפיעים על התפתחות עצבית באורגניזמים רגישים גנטית, אנו מציגים פרוטוקול להזרקת IL-6 מיקרו לתעלה של הווריד הקרדינלי הנפוץ של זחלי דגי הזברה, המאפשר השראה מבוקרת של דלקת והערכת השפעתו ההתפתחותית בהקשר של קומפלקס טרשת השחפתות (TSC).

מיקרוהזרקה של אינטרלוקין-6 לזרם הדם של זחלי דגי זברה TSC כדי לחקור התנהגויות דמויות הפרעות נוירופסיכיאטריות

חקור תגובות אלרגיות ומנגנונים חיסוניים בדגי זברה (Danio rerio) בתגובה לביומולקולות של רוק קרציות. מודל זה מחקה תסמונת alpha-Gal אנושית ומסייע להבנת אינטראקציות מולקולריות בין קרציה למארח.

מודל בעלי חיים של דגי זברה לחקר תגובות אלרגיות בתגובה לביומולקולות של רוק קרציות

גלה סרטונים נוספים